Abstract
Indoleamine 2,3-dioxygenase-en (IDO) er et immunregulerende enzym uttrykt av de fleste humane tumorer. IDO nivåer i kreftceller korrelerer med økt metastasering og dårlig pasient utfall og IDO er knyttet til tumorcelle motstand mot immunterapi, strålebehandling og kjemoterapi. Kunnskap om tumorcelleautonome virkninger av IDO, uavhengig av dets velkjente rolle i regulering og undertrykkende anti-tumor immunresponser, er begrenset. Klonale bestander av A549 humane lunge adenokarcinomceller stabilt transfektert med anti-IDO shRNA eller egge kontroll shRNA ble brukt til å studere IDO effekter på stoffet følsomhet og resistens. IFNy ble anvendt for å indusere IDO i disse cellene. Vi viser, for første gang, at IDO medierer humane tumorcellemotstanden til de kandidatanticancer legemidler FK866 (en NAD
+ inhibitor), methoxyamine (MX, en base excision reparasjon [BER] inhibitor) og godkjente anticancermedikamenter pemetrexed ( et folat anti-metabolitt) og gemcitabin (en nukleosidanalog), og kombinert behandling med pemetrexed og MX, i fravær av immunceller. Samtidig knockdown av IDO og tymidylatsyntase (TS, en nøkkel hastighetsbegrensende enzym i DNA-syntese og reparasjon) sensitizes humane lungekreftceller til pemetrexed og 5FUdR i større grad enn knockdown av enten mål alene. Vi konkluderer med at BER i IDO-uttrykke A549 celler spiller en viktig rolle som formidler resistens mot en rekke godkjente og kandidat kreft narkotika. Ido-inhibitorer er under klinisk utprøving i første rekke for å forbedre antitumorimmunresponser. Vi viser at targeting IDO alene eller i kombinasjon med TS er en potensielt verdifull terapeutisk strategi for kreftbehandling, uavhengig av immunaktivitet og i kombinasjon med konvensjonell kjemoterapi
Citation. Maleki Vareki S, Chen D, Di Cresce C Ferguson PJ, Figueredo R, Pampillo M, et al. (2015) IDO Nedregulering induserer Følsomhet for Pemetrexed, gemcitabin, FK866, og Methoxyamine i humane kreftceller. PLoS ONE 10 (11): e0143435. doi: 10,1371 /journal.pone.0143435
Redaktør: Aamir Ahmad, Wayne State University School of Medicine, USA
mottatt: 24 juni 2015; Godkjent: 04.11.2015; Publisert: 18.11.2015
Copyright: © 2015 Maleki Vareki et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet: All relevant data er i avisen og dens saksdokumenter fil
Finansiering:. arbeidet ble finansiert av den kanadiske Institutes of Health Research (https://www.cihr-irsc.gc.ca/e/193.html) (MOP-827270 og MOP-123454). Den Funder hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
immunoregulatory molekylet IDO er en 45 kDa hemoprotein avgjørende for oksidativ katabolisme av tryptofan i kynurenine pathway [1]. IDO katalyserer oksidativ spaltning av 2,3-dobbeltbindingen i indolenheten av L-tryptofan, noe som resulterer i produksjon av den første kynurenine pathway metabolitt, N-formyl kynurenine [2]. Sluttproduktet av kynurenine veien er kinolinsyre (QA) som kan konverteres til NAD
+ i pattedyrceller. Vi og andre har vist at IDO tilveiebringer en kilde av NAD
+ til celler fra tryptofan katabolisme [3,4]. IDO kan induseres i de fleste humane celler, spesielt antigen-presenterende celler (APC), ved inflammatoriske cytokiner så som interferon-gamma (IFNy), tumor nekrose faktor (TNF) -α, og infeksjon [5,6]. Men de fleste humane tumorer uttrykker IDO [7], noe som bidrar til tumor-indusert toleranse og undertrykkelse av immunsystemet. IDO induserer en tolerogene stat i svulsten mikromiljøet og tumor-drenering lymfeknuter [8].
I de fleste pasientstudier, IDO uttrykk har blitt korrelert med redusert total overlevelse og redusert progresjonsfri overlevelse [9] . Videre IDO har vært knyttet til økt metastaser i ulike menneskelige kreftformer inkludert ikke-småcellet lungekreft (NSCLC), brystkreft, og endetarmskreft [10-12]. I tillegg kan pasienter med fremskredet stadium eggstokkreft, nasofaryngeal karsinom, og endometrial cancer hadde høye nivåer ido i deres tumorer [13].
IDO er også viktig i utviklingen av resistens mot immunterapi. Det har blitt foreslått at IDO spiller en viktig rolle i resistens mot ipilimumab [14]. I en mus transgen modell av brystkreft i hvilken tumorer ble indusert ved ekspresjon av oncogenet Neu under kontroll av musebrysttumorvirus (MMTV) promoter, ble IDO inhibering med 1-metyl-tryptofan (1-MT) i kombinasjon med paclitaxel, et kjemoterapeutisk middel som vanligvis anvendes for å behandle brystkreft [15]. Kombinasjonen resulterte i tumorregresjon hos tumorbærende dyr [15]. Påfallende, utarming av CD4
+ T-celler, eller bruken av T-celle-manglende atymiske mus i stedet for immunkompetente mus opphevet virkningen av kombinert behandling, noe som indikerer en immun-mediert effekt for å blokkere IDO i sammenheng med paklitaxel behandlings [15] .
Flere kliniske studier har antydet at høye iDO nivåer under behandling kan være relatert til dårlig resultat på kjemoterapi og /eller strålebehandling, og kanskje bidra til motstand mot terapi [16-18]. I en enarmet fase II-studien i pasienter med stadium III NSCLC ble pasientene behandlet med induksjons gemcitabin fulgt av samtidige carboplatin, paclitaxel og 74 Gray (Gy) thorax stråling [16]. Kreftpasienter viste høy IDO aktivitet som følger av målt høyere serum kynurenine /tryptofan forhold sammenlignet med friske kontroller. Denne høye IDO aktivitet etter kjemoterapi var assosiert med dårlig pasient utfallet, selv om den statistiske kraften av studien var begrenset av det relativt lave antallet pasienter [16].
I en annen studie ble IDO positivt assosiert med chemoresistance i en genuttrykk profilering studie for å identifisere molekyler assosiert med resistens mot paclitaxel kjemoterapi i eggstokkreft cellelinjer og ildfaste kirurgiske eggstokkreft prøver [17]. IDO ble sterkt uttrykt i både paclitaxel-resistente cellelinjer og ildfaste ovarietumorer men var fraværende i paclitaxel-sensitive cellelinjer og svulster [17].
I en klinisk studie som analyserte NSCLC pasientens respons til platina-basert kjemoterapi i en liten kohort av pasienter, ble IDO uttrykk i monocytter og granulocytter analysert før og etter behandling. Pasientpopulasjonen som dratt nytte av behandlingen viste lavere IDO uttrykk i blod monocytter etterbehandling [18].
Vi har vist at IDO gir resistens mot cisplatin, olaparib, og γ-stråling i A549, Hela, og H441-celler, uavhengig av immun direkte involvering [4]. IDO downregulation også redusert intracellulære NAD
+ nivåer i kreftceller [4]. NAD
+ er nødvendig for poly (ADP-ribose) polymerase (PARP) -funksjonen [19]. Rekruttering av BER scaffoldprotein X-ray reparasjon kryss utfyller protein 1 (XRCC1) til det skadede området av DNA er strengt avhengig av poly-ADP-ribosylering [20]. PARP funksjon derfor direkte virkninger BER, en kritisk formidler av kreftcelle motstand mot genotoksiske virkningene av γ-stråling og et antall kjemoterapeutiske midler, inkludert cisplatin, pemetrexed, og gemcitabin [21,22]. Derfor kan IDO ekspresjon i kreftceller potensielt forbedre BER i disse celler og indusere resistens overfor slike midler.
Vi viser, for første gang, at IDO ekspresjon i kreftceller, uavhengig av immunsystemet, gir resistens til NAD
+ inhibitor FK866 og BER inhibitor MX. Videre IDO downregulation sensibilisert kreftceller til pemetrexed og gemcitabin, som begge er rettet mot tymidylatsyntase (TS), men ikke TS-targeting narkotika 5FUdR. IDO downregulation også sensibilisert A549 celler til kombinert pemetrexed og MX behandling. Til slutt, samtidig nedregulering av IDO og TS økt kapasiteten på IDO downregulation og TS downregulation å bevisst A549 celler til pemetrexed og 5FUdR hhv.
Materialer og metoder
Cell Culture
human lunge adenokarsinom A549-celler ble erholdt fra American Type Culture Collection (ATCC, CCL-185), og opprettholdt i minimalt essensielt medium α (MEMα). A549 celler ble STR fingeravtrykk og validert av Radil test for å være mycoplasma gratis. Helstøpt media ble supplert med 10% føtalt bovint serum (FBS) (Gibco, Life Technologies, Carlsbad, California, USA, katalog # 325-043-EL), 100 enheter /ml penicillin og 100 ug streptomycin (pen /strep) (Gibco , Life Technologies, Carlsbad, California, USA, katalog # 15140-122) i 70 cm
2 kolber Sigma-Aldrich (St. Louis, Missouri, USA). Celler ble opprettholdt ved 37 ° C i 5% CO2. For de fleste forsøkene ble cellene tillatt å spre seg til ikke mer enn 70-80% av maksimal belegg på vev kultur plast (
i
.
e
., 70-80% sammenflytende).
Proliferation Assay (Cell Counting)
Tumor celleproliferasjon etter siRNA transfeksjon og /eller medikamentell behandling ble beskrevet tidligere [23]. Kort sagt ble A549-cellene vasket med PBS, trypsinert og telt ved bruk av et Beckman Coulter Z1 partikkelteller (Beckman, Mississauga, Ontario) 72 timer etter behandling. Den ganger endring i celleantall etter 3 dagers vekst (i forhold til utgangs antall belagte celler) ble beregnet som:
Forskjeller i proliferasjon indusert av behandling ble uttrykt som «sprednings (% kontroll)», og ble beregnet i henhold til følgende formel:
cytostatika
5FUdR ble kjøpt fra Sigma Chemical Co. (St. Louis, Missouri, USA). Pemetrexed (pemetrexed, Eli Lilly and Co., Toronto, Ontario, Canada) ble hentet fra London Health Sciences Centre apotek (London, Ontario, Canada). MX og FK866 ble kjøpt fra Sigma-Aldrich (St. Louis, Missouri, USA).
TS Protein deteksjon og måling
A549 celler ble dyrket i 75 cm
2 kolber. Celler ble inkubert i 96 timer etter TS siRNA transfeksjon, ble vasket to ganger med iskald PBS, høstet, og sonikert. Lyserte celler ble sentrifugert ved 20000 x g i 15 min ved 4 ° C og supernatanten ble samlet og lagret ved -80 ° C for fremtidig bruk. Proteinekstrakter (20 ug) ble kvantifisert ved BioRad proteinanalyse, separert ved elektroforese gjennom en 12% polyakrylamidgel, og deretter elektro-overført til en nitrocellulosemembran. TS monoklonalt antistoff (Taiho Pharmaceutical, Hanno-City, Japan) ble vennlig levert av Dr. Masakazu Fukushima (Taiho legemidler, Hanno Research Center, Hanno-City, Japan). Actin monoklonalt antistoff (Sigma, St. Louis, MO) ble anvendt for å påvise og kvantifisere aktin. Sekundær anti-mus og anti-kanin IgG (peroxidase bundet hele antistoffer, GE Healthcare og biovitenskap) ble bundet til primær IDO og aktin antistoffer, henholdsvis. De antistoff-proteinkomplekser ble visualisert ved hjelp av en Storm scanner (GE Healthcare og biovitenskap).
Pemetrexed, FK866, Methoxyamine, og 5FUdR Behandling
A549 celler (5×10
4) ble sådd inn i 25 cm
2 kolber i 2 ml MEMα supplert med 10% FBS pluss penn /strep. Mediet ble erstattet med friskt vekstmedium med eller uten IFNy (25 ng /ml) 16-24 timer etter såing. Tjuefire eller 48 timer etter tilsetning av IFNy, ble mediet erstattet med friskt medium inneholdende enten pemetrexed (200 nM), FK866 (5 nM), MX (3 mM) eller 5FUdR (40 nM). Tre dager etter tilsetning av medikamenter, ble celler vasket for å fjerne døde celler og partikler. Heftende celler ble trypsinert og nummerert ved hjelp av en Coulter teller (Beckman, Mississauga, ON). Levedyktighet av telte celler ble bekreftet av trypanblått eksklusjon.
Kombinert behandling med Pemetrexed og Methoxyamine
A549 celler (5×10
4) ble dyrket og co-behandlet med pemetrexed (30 nM ) og MX (3 mM) som beskrevet ovenfor. Celler ble tillatt å spre seg i kultur i 72 timer. Cellene ble deretter trypsinert og levende celler ble nummerert ved hjelp av en Coulter-teller.
IDO downregulation
Menneskelige A549 celler ble stabilt transfektert med kort hårnål RNA (shRNA) med en eggekontrollsekvens ikke-komplementær til kjente menneskelige RNA-sekvenser, eller anti til menneskelig IDO1 eller (SuperArray, Mississauga, ON, ved hjelp Lipofectamine 2000 (LFA2K) (Invitrogen, Burlington, ON, Canada), og enkelte klonale populasjoner med egge kontroll (SCR) shRNA eller anti-IDO shRNA isolert som beskrevet tidligere [4]. i korthet en million A549-celler ble sådd ut over natten i 2 ml MEMα supplert med 10% FBS. celler ble 70% sammenflytende på transfeksjon dag. ti mikrogram anti-IDO shRNA plasmid eller den krypterte kontroll shRNA plasmid ble blandet med 10 ul LFA2K og 125 ul serumfritt medium etter 20 min inkubering ved romtemperatur ble shRNA. LFA2K-kompleks ble tilsatt til cellene Transfeksjon fortsatte i 4 timer før tilsetning av 4 ml av frisk MEMα supplert med 10%. FBS. Tjuefire timer etter transfeksjon ble cellene overført til 14 cm plast vev kultur retter som inneholder 20 mikrogram puromycin (Bioshop Canada, Inc., Burlington, ON). Enkle kolonier ble utvalgt og dyrket i 48-brønners plater i nærvær av 2 ug puromycin. IDO mRNA og protein ble målt i alle valgte kloner etter induksjon med IFNy.
TS og BRCA2 siRNA Transfeksjon and Drug Treatment
TS siRNA nummer tre eller TS siRNA nummer 4 (tabell 1), rettet mot ulike regioner av menneskelig TS mRNA [ONTARGET Plus (Dharmacon RNAi Technologies, Lafayette, CO, USA)] og at redusert target mRNA med ca 70% av 24 timer etter transfeksjon, ble brukt til midlertidig nedregulere TS mRNA i A549 kreftceller. Konsentrasjoner av siRNAs rettet mot menneskelig brystkreft type-2 mottakelighet protein (BRCA2) [ONTARGET Plus SMARTPool BRCA2 (Dharmacon RNAi Technologies)] (tabell 1) som forbigående redusert target mRNA med ca 70% av 24 timer etter transfeksjon ble bestemt (10 nM) . TS siRNA (5 nM), BRCA2 siRNA (10 nM), og kontrollere ikke-målsøkende siRNA (2,5 eller 5 nM) i serumfritt MEMα og LFA2K (2,5 ug /ml) ble inkubert sammen i 20 min. SiRNA: LFA2K blanding ble deretter tilsatt til A549-celler som var blitt sådd, in triplo, ved 2 x 10
5 celler pr 25 cm
2-kolbe i 24 timer på forhånd. Ved 4 timer etter tilsetning av siRNA: LFA2K, ble mediet byttet med friskt dyrkningsmedium inneholdende IFNy (25 ng /ml). Mediet ble byttet ut 48 timer senere med friskt medium inneholdende pemetrexed eller 5FUdR. Tumor celleproliferasjon ble nummerert 72 timer senere ved hjelp av en elektronisk partikkelteller (Beckman-Coulter).
In vivo
Tumor Model
A549 kloner NC-3 og 2-18 ble beskrevet tidligere [4]. Tumorceller ble injisert i 50 pst Matrigel (ECM gel, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) i flankene av Fox Chase SCID-mus (1 x 10
7-celler per injeksjonssted) (n = 5 mus pr gruppe ). Once svulster nådd ~ 300 mm
3 mus ble behandlet (dag 0) med PBS-fortynnet rekombinant human IFNy (100 000 IE, ip, to ganger per uke i fire uker) (R 0,05. Panel D:. Korrelasjons analyse av forholdet mellom IDO proteininnhold (i forhold til aktin) og klonal populasjon motstand mot FK866 (spredning i forhold til ubehandlede kontrollceller)
IDO i humane tumorceller formidler Motstand mot Base Eksisjon Repair Inhibitor Methoxyamine
NAD
+ er viktig for PARP funksjon og PARP er viktig for rekruttering av BER scaffoldprotein XRCC1 til skadet DNA [20]. I lys av våre tidligere rapport som IDO spiller en rolle som formidler resistens overfor PARP-inhibitoren olaparib [4], til kapasiteten av IDO medierer resistens mot BER inhibitoren MX ble undersøkt. Antisense knockdown av IDO sensibilisert IFNy-indusert A549 kloner 2-6 og 2-18 (huser anti-IDO shRNA) til MX, mens A549 kloner NC-3, NC-10, og NC-30 (transfektert med egge kontroll shRNA) var ikke sensibilisert (fig 2A og 2B). Da data fra de 3 klonale populasjoner med kontroll shRNA ble slått sammen og sammenlignet med kombinerte data fra de 2 klonale populasjoner med anti-IDO shRNA, IFNy-indusert IDO mediert en 6-gangers økning i resistens mot anti-proliferative effekter av MX og tilstedeværelse av anti-IDO shRNA avskaffet at økningen (figur 2C). Det var en moderat sammenheng mellom IDO nivå og MX motstand blant alle 5 IFNy-indusert klonale populasjoner [R
2 = 0.83] (figur 2D). Disse resultatene tyder på at IDO i kreftceller forbedrer funksjonen av BER-proteiner, og antisense-formidlet reduksjon av ido blokker som ekstrautstyr.
Proliferasjon av hver enkelt av fem individuelle A549-cellepopulasjoner klonale før (panel A) og etter ( Panel B) IDO induksjon med IFNy. A549-klonale populasjoner ble dyrket med eller uten IFNy (25 ng /ml) i 48 timer. Dyrket medium ble deretter erstattet med friskt dyrkningsmedium inneholdende Methoxyamine (MX) (3 mM) og cellene ble tillatt å proliferere i 72 timer. Cellene ble deretter trypsinert og levende celler ble nummerert. Hvite striper: A549 kloner transfektert med eggerøre, ikke-måls kontroll shRNA. Grå barer: A549 celler transfektert med anti-IDO shRNA. Hver søyle representerer gjennomsnittet av 3 verdier (
n
= 3 for fastsettelse av hver verdi) ± SD. Resultatene er normalisert til kontrollceller som ikke var behandlet med methoxyamine, uten (panel A) eller med (panel B) IFNy behandling. Panel C: Induksjon av IDO i A549 klonale cellepopulasjoner induserer resistens mot MX (3 mm). Resultatene ble innhentet fra 3 eller 2 uavhengige klonal cellepopulasjoner med eggerøre, ikke-måls kontroll shRNA eller anti-IDO shRNA, henholdsvis. Hver søyle representerer et gjennomsnitt av 9 (hvite søyler) eller 6 (svarte søyler) verdier ± SEM, * Signifikant forskjell, Student
t
-test,
p
0,05. Panel D: Forholdet mellom IDO proteinnivå (i forhold til aktin) og motstand mot methoxyamine (MX) (spredning i forhold til ubehandlede kontrollceller). R
2 verdi på 0,83 representerer en moderat positiv sammenheng.
IDO i humane tumorceller formidler Motstand mot TS-targeting Drug Pemetrexed
TS er viktig i DNA-reparasjon og DNA-syntese og er overuttrykt i de fleste menneskelige kreft [25]. TS-targeting narkotika pemetrexed er ofte brukt til å behandle flere typer kreft hos mennesker, inkludert NSCLC og pleural mesothelioma [26]. BER er rapportert å være viktig i kreftcellen resistens mot dette stoffet. Vi har vist før at IDO økt NAD
+ nivåer i kreftceller [4]. I lys av våre funn at IDO tillagt motstand mot BER inhibitor MX (figur 2), vi satt til å undersøkt om tilstedeværelsen av IDO påvirket følsomheten A549 klonale cellepopulasjoner til pemetrexed, potensielt knytte IDO uttrykk med forbedrede BER funksjon i kreftceller . A549 klonale cellepopulasjoner som bærer kryptert kontroll shRNA (3 kloner) eller anti-IDO shRNA (2 kloner) ble behandlet med eller uten IFNy i 48 timer og deretter med pemetrexed (200 nM) og tillatt å spre seg i 72 timer. Det var ingen signifikante forskjeller i følsomhet for pemetrexed blant de 5 klonene før IFNy induksjon, enten klonene ble bedømt hver for seg (fig 3A), eller betyr relativ følsomhet av de tre kontroll shRNA kloner (n = 3 vurderinger av hver klon) ble sammenlignet med den mener relative følsomhet av de 2 anti-shRNA kloner (n = 3 vurderinger av hver klon) (figur 3C). Antisense-mediert nedregulering av IFNy-indusert IDO, i motsetning, sensibiliserte hver av de 2 kloner anti-IDO shRNA til pemetrexed, sammenlignet med alle 3 kloner egge kontroll shRNA (figur 3B). Når gjennomsnitts spredning av kontroll og anti-IDO shRNA kloner etter IFNy induksjon ble sammenlignet, de huse anti-IDO shRNA var omtrent dobbelt så følsom for pemetrexed (Fig 3C). Antisense-formidlet reduksjon i IDO derfor sensibilisert A549 klonale populasjoner til pemetrexed.
Proliferasjon av hver enkelt av fem individuelle A549-cellepopulasjoner klonale før (panel A) og etter (panel B) IDO induksjon med IFNy. A549-klonale populasjoner ble dyrket med eller uten IFNy (25 ng /ml) i 48 timer, deretter med pemetrexed (200 nM), og nummerert 72 timer senere. Hvite striper: A549 kloner transfektert med eggerøre, ikke-måls kontroll shRNA. Grå barer: A549 celler transfektert med anti-IDO shRNA. Hver søyle representerer gjennomsnittet av 3 verdier (
n
= 3) ± SD. Resultatene er normalisert til kontrollceller som ikke var behandlet med pemetrexed, uten (panel A) eller med (panel B) IFNy behandling. Panel C: Induksjon av IDO i A549 klonal celle induserer resistens mot pemetrexed (200 nM). Resultatene ble innhentet fra 3 eller 2 uavhengige klonal cellepopulasjoner med eggerøre, ikke-måls kontroll shRNA eller anti-IDO shRNA, henholdsvis. Hver søyle representerer et gjennomsnitt av 9 (hvite søyler) eller 6 (svarte striper) verdier ± SEM. * Signifikant forskjell, Student
t
-test,
p
. 0,05
IDO i humane tumorceller formidler Motstand mot Kombinert Behandling av Pemetrexed og Methoxyamine
En fase i klinisk studie av kombinert MX og pemetrexed er gjennomført (NCT00692159) og fase II kliniske studier av at legemiddelkombinasjonen i flere indikasjoner inkludert NSCLC er planlagt (NCT01851369, NCT02395692, NCT02535325, og NCT02535312) [26] . I lys av vår observasjon av IDO-mediert resistens mot både pemetrexed og MX, ble det antatt at IDO kan indusere motstand mot kombinert MX og pemetrexed behandling. For å teste denne hypotese, ble IDO indusert i A549 klonal cellepopulasjoner, og da disse populasjoner ble behandlet med en kombinasjon av pemetrexed (30 nM) og MX (3 mM) og proliferasjon vurdert etter 72 timer. I likhet med det som ble observert etter behandling med MX eller pemetrexed som enkle midler, IDO downregulation sensibilisert kreftceller til kombinert behandling (figur 4A og 4B). Dessuten, etter IFNy induksjon av IDO og eksponering for kombinert pemetrexed og MX, når gjennomsnittsspredningsverdiene for de 3 kontroll kloner ble sammenlignet for å bety spredning verdier for de 2 kontrollpunkt kloner (n = 3 vurderinger for hver klon), celler som anti-IDO shRNA var 7 ganger mer følsom for den kombinerte behandling enn celler med egge kontroll shRNA (figur 4C). Før IFNy induksjon av IDO uttrykk, var det ingen forskjell (figur 4C). Det var en moderat positiv sammenheng mellom mengden av IDO i IFNy-indusert tumorceller og deres motstand mot kombinert behandling med disse to midler (Fig 4 D, R «sup> 2 = 0,70). Disse data indikerer betydningen av IDO i mediering av resistens mot terapeutiske midler både alene og i kombinasjon.
Proliferasjon av hver enkelt av fem individuelle A549-cellepopulasjoner klonale før (panel A) og etter (panel B) IDO induksjon med IFNy . A549-klonale populasjoner ble dyrket med eller uten IFNy (25 ng /ml) i 48 timer. Dyrket medium ble deretter erstattet med friskt dyrkningsmedium inneholdende pemetrexed (30 nM) og methoxyamine (MX) (3 mM). Tumorceller ble deretter tillatt å spre seg i 72 timer, deretter oppregnet. Hvite striper: A549 kloner transfektert med eggerøre, ikke-måls kontroll shRNA. Grå barer: A549 celler transfektert med anti-IDO shRNA. Hver søyle representerer gjennomsnittet av 3 verdier (
n
= 3) ± SD. * Signifikant forskjell, Student
t
-test,
p
0,05. Resultatene er normalisert til kontrollceller som ikke var behandlet med pemetrexed og methoxyamine, uten (panel A) eller med (panel B) IFNy behandling. Panel C: Induksjon av IDO i A549 klonal celle induserer motstand mot kombinerte pemetrexed (30 nM) og MX (3 mM) behandling. Resultatene ble innhentet fra 3 uavhengige klonale cellepopulasjoner med egge kontroll shRNA eller anti-IDO shRNA, og hver stolpe representerer et gjennomsnitt av 9 (hvite søyler) eller 6 (svarte striper) verdier ± SEM (*
p
0,05). Resultatene er normalisert til kontrollceller som ikke var behandlet med gemcitabin, uten (panel A) eller med (panel B) IFNy behandling. Paneler D-F: Spredning av hver av 5 individuelle A549 celleklonal populasjoner før og etter IDO induksjon med IFNy. A549-klonale populasjoner ble dyrket med eller uten IFNy (25 ng /ml) i 48 timer og, 5FUdR (200 nM) i 72 timer, og deretter telles. Hvite striper: A549 kloner transfektert med eggerøre, ikke-måls kontroll shRNA. Grå barer: A549 celler transfektert med anti-IDO shRNA. Hver søyle representerer et gjennomsnitt av 9 (hvite søyler) eller 6 (svarte søyler) Verdier ± SD for Panels D og E og SEM for panel F ± SD. * Signifikant forskjell, Student
t
-test,
p
0,05. Resultatene er normalisert til å kontrollere cellene ikke behandlet med 5FUdR, uten (panel A) eller med (panel B) IFNy behandling.
IDO Nedregulering fikk ikke bevisst humane tumorceller til 5FUdR
i motsetning til den rolle BER i respons til pemetrexed, MX, og gemcitabin, er BER blitt foreslått for å øke snarere enn å hemme 5FUdR cytotoksisitet i kreftceller, på grunn av sin deltagelse i en nytteløs reparasjon syklus som potensierer 5FUdR toksisitet [28].
