Abstract
Bakgrunn
Nyere studier har vist at DNA metylering (DNAm) markører i perifert blod kan holde løftet som diagnostisk eller tidlig deteksjon /risikomarkører for epiteliale kreftformer. Men til dags dato ingen studier har evaluert diagnostisk og prediktiv potensialet i slike markører i en stor sak kontrollgruppen og på et genom-wide basis.
hovedfunnene
Ved å utføre genome-wide DNAm profilering av et stort eggstokkreft tilfelle kontrollgruppen, vi her viser at aktiv eggstokkreft har en betydelig innvirkning på DNAm mønster i perifert blod. Nærmere bestemt, ved å måle metylering nivåer på over 27 000 CPGs i blodcellene fra 148 friske personer og 113 alderstilpassede før behandling eggstokkkrefttilfeller, utlede vi en DNAm signatur som kan forutsi tilstedeværelsen av aktiv eggstokkreft i blindprøvesett med en AUC på 0,8 (95% KI (0,74 til 0,87)). Vi validere ytterligere våre funn i en annen uavhengig sett av 122 etter behandling tilfeller (AUC = 0,76 (0.72-0.81)). I tillegg gir vi bevis for et betydelig antall kandidat risiko eller tidlig deteksjon markører for kreft i eggstokkene. Videre, ved å sammenligne mønsteret av metylering med genuttrykk data fra hovedblodcelletyper, vi her demonstrerer at alder og kreftfremkalle vanlige endringer i sammensetningen av perifert blod, med en myeloid forskyvning som øker med alderen og som er ytterligere forverret i tilstedeværelsen av eggstokkreft. Til slutt viser vi at de fleste kreft og alder tilhørende metylering variasjonen er funnet på CPGs ligger utenfor CpG øyer.
Betydningen
Våre resultater understreker potensialet DNAm profilering i perifert blod som et verktøy for påvisning eller risiko prediksjon av epiteliale kreftformer, og garanterer ytterligere i dybden og høyere CpG dekning studier for å ytterligere belyse denne rollen
Citation. Teschendorff AE, Menon U, Gentry-Maharaj A, Ramus SJ, Gayther SA , Apostolidou S, et al. (2009) En epigenetisk Signatur i perifert blod Spår Active eggstokkreft. PLoS ONE 4 (12): e8274. doi: 10,1371 /journal.pone.0008274
Redaktør: Rodolfo Aramayo, Texas A M University, USA
mottatt: 07.09.2009; Godkjent: 13 november 2009; Publisert: 18.12.2009
Copyright: © 2009 Teschendorff et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av Eve Klage og gjennomført ved University College London Hospital (UCLH) /University College London (UCL) som fikk en andel av midler fra Department of Health, National Institute for Health (NIHR), Biomedical Research Centres støtteordning. AET ble støttet av en Heller stipend. AET ønsker å takke Michael og Morven Heller for Heller stipend. SB ble støttet av Wellcome Trust. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:. Ian J. Jacobs er konsulent innen eggstokkreft til Becton Dickinson.
Innledning
rollen epigenetikk i kreft og andre vanlige komplekse sykdommer er uomtvistet [1], [2]. En unik fasett av epigenetiske merker som skiller dem fra sine genetiske kolleger, er deres følsomhet til å gjennomgå endringer i respons til kosttilskudd og andre miljømessige eksponeringer [1], [3], [4]. Gitt den epidemiologiske sammenhengen mellom miljøfaktorer og kreft er det naturlig å hypoteser om at epigenetiske mutasjoner ervervet under en persons liv, disponere den enkelte til sykdommen [1], [5] – [8]. En slik modell er videre støttet av eneggede tvillingstudier som peker til alder og miljørelatert epigenetisk divergens som årsak til uharmoniske sykdomsstatus [9], [10]. Dermed virker det sannsynlig at epigenetiske forandringer knyttet til miljø og aldring kan selv være relatert til kreft [11], og spesielt at en rekke av disse epigenetiske mutasjoner kan utgjøre kreft predisposisjon markører.
Flere nylig, DNA metylering (DNAm) av spesifikke gener (
SEPT9, RASSF1A, APC
) i serum DNA er blitt foreslått som diagnostiske og prognostiske biomarkører for tykktarmskreft [12], henholdsvis [13] og brystkreft [14]. DNA-metylering (DNAm) endringer knyttet til kreft og aldring har også blitt observert i perifere blodprøver fra postmenopausale kvinner [15], [16]. Spesielt er det blitt foreslått at kjente epidemiologisk risikofaktorer (f.eks høye hormonnivåer) kan forlate DNAm avtrykk i perifert blod-DNA, og at tidlig påvisning av disse merkene kan bli brukt til å forutsi fremtidig fare for en person å utvikle kreft [15]. Men om DNAm markører avledet fra perifert blod kan tjene som diagnostiske eller risiko prediksjon verktøy er fortsatt kontroversielt [17] og ingen studie har ennå evaluert sin kliniske potensialet på et genom-wide basis.
Vi utførte genom-wide DNAm profilering av perifere blodprøver fra et stort eggstokkreft case-control-kohorten for å avhjelpe følgende spørsmål. Først, hvilken effekt gjør tilstedeværelsen av kreft har på DNAm mønster i perifert blod, et vev som er urelatert til cellen av opprinnelsen til en epitelial kreft, og mer spesifikt, kan tilstedeværelsen av kreft forutsies ut fra DNAm profil i blodet ? For det andre kan vi identifisere metylering markører i blodet som kan tjene som tidlig deteksjon eller predisposisjon markører for kreft i eggstokkene? Identifisering av pålitelige diagnostiske eller tidlig deteksjon biomarkører avledet fra blod er av stor klinisk og biologisk betydning, spesielt for eggstokkreft hvor tidlig påvisning er vanskelig [18]. Til slutt, etter de siste rapportene at de fleste metylering variable posisjoner er lokalisert utenfor CpG-øyer [19], vi utforsket den genomiske mønster av metylering variable posisjoner i forhold til CpG tetthet.
Resultater
Age og kreft Relaterte DNA metylering Patterns
Alle 540 perifere blodprøver ble hybridisert til 27 k Menneskelig metylering infinium beadchip arrays [20] (Materialer og metoder, Tabell S1). En streng kvalitetskontroll, og inter-matrise normaliseringsprosedyre ble benyttet for å fjerne tilbakevise variasjon på grunn av eksperimentelle faktorer, som resulterer i en normalisert datamatrise av metylering score (p-verdier, 0 relativt p 1) over 383 prøver (148 friske, 113 pre -rensing (pret) eggstokkreft tilfeller, 122 post-behandling (post) eggstokkreft tilfeller) og 25,642 CpG nettsteder (Materialer og metoder, Figur S1). Singulærverdidekomposisjonen (SVD) av de normaliserte data viste minst 10 store deler av variasjon med de største komponenter i forbindelse med fenotypiske faktorer, særlig tilstedeværelse av kreft og alder (figur S2, Materialer og metoder).
En DNA metylering signatur Assosiert med eggstokkreft
Vi har vedtatt en overvåket tilnærming til utlede en kreftspesifikk DNA metylering signatur og be om en slik signatur kan brukes til å forutsi sykdomsstatus på blindtestprøver. Spesielt hevdet vi at svulsten tilstedeværelse kan ha en stor nok effekt på DNA metylering mønstre som det burde være synlig fra perifere blodprøver fra pasienter før under behandling.
For å sikre at resultatene ikke var inhabil til et bestemt valget av trening /test sett partisjon, vi utførte totalt 100 runs, kjørt med en annen trening /test sett partisjon (Materialer og metoder). For hvert valg av treningssett (90 kontroller og 70 Prêt prøver), vi brukte en multivariat logistisk regresjonsmodell (MVLR), med CpG bestemt metylering profil som en prediktor og med BSC (bi-sulfitt konvertering) effektivitet, DNA-inngang og batch effekt som potensielt konfunderende faktorer, for å utlede en p-verdi på tilknytning til saken kontroll status for hver av de 25,642 CpG nettsteder (Materialer og metoder). Deretter ble CpG nettsider rangeres i henhold til sine p-verdier og en krympet Tyngdepunktet klassifikator trent på de 1000 CpG nettsteder (FDR 0,05, Materialer og metoder). Vi observerte at for det store flertallet av 100 runs, optimale (eller nær optimal) klassifiserer ytelse i interne kryss valideringer ble oppnådd ved å velge de 100 CpG nettsteder. Til slutt, i hvert løp, ble den resulterende topp 100 CpG klassifikator evaluert i en blindtest sett bestående av 58 friske kontroller og 43 pret tilfeller. Klassifiserings ytelse på trening og testsett ble evaluert ved hjelp av ROC kurver og tilhørende AUC (Figur 1a-b). I løpet av de 100 går, var gjennomsnittlig AUC og 95% KI i opplærings- og testsett var 0,82 (0,78 til 0,85) og 0,80 (0,74 til 0,87), henholdsvis, noe som indikerer at de stammer classifiers beholdt sterk prediktiv kraft i blinde testsett ( Figur 1a-b).
a-b) Klassifisering utførelsen av DNA-metylering klassifiserere i a) treningssett og b) blindprøvesett. Opplæring og test sett besto av blodprøver fra før behandling saker og friske individer (Materialer og metoder). Gjennomsnittlig ROC kurve over 100 forskjellige trening /test sett partisjoner med 95% KI konvolutt i blinde testsett. Gjennomsnittlig AUC og 95% CI over 100 ulike partisjoner er gitt. c) Klassifisering ytelse i testen sett bestående av friske kontroller og etterbehandling prøver med bevis for aktiv sykdom. d) Sammenheng mellom rangeringen av topp CPGs diskriminerende før behandling saker fra friske kontroller i regresjonsmodeller som inkluderte alder (x-aksen) og uten alder (y-aksen) som en co-faktor. Plottet er log10 (p-verdier) for 25,642 CpG nettsider, slik dette vurderes fra flere logistikk regresjoner av sak /kontroll status mot CpG metylering profil med alder som en co-faktor (x-aksen) og uten alder som en co- faktor (y-aksen). Spearman korrelasjon mellom de to rangeringene er gitt
Neste, vi undersøkt om de stammer classifiers kunne forutsi kreft statusen etter behandling prøver med bevis for aktiv sykdom. (Bestemt av CA125 serumnivåer 30) på det tidspunkt prøven trekning (47 prøver). Midlet over 100 går, fikk vi en AUC på 0,76 (0,72 til 0,81, 95% KI) i blindtestsett som består av 58 friske kontroller og (fast) 47 postreatment prøver (Figur 1c). Betydelig makt til å diskriminere etter behandling prøver med aktiv sykdom fra de uten ble også oppnådd (AUC = 0,74,
P
0,001). Disse resultatene bekrefter derfor evnen av de avledede klassifiserere å forutsi tilstedeværelse av svulster i post-behandlings prøver. I kontrast, gjorde classifiers ikke forutsi kreft statusen etter behandling prøver uten tegn på aktiv sykdom (70 prøver) i forhold til friske kontroller (AUC = 0,52 (0,48 til 0,55, 95% KI)).
Deretter spurte vi om klassifisering ytelsen kan bli påvirket av alder. For å løse dette, sammenlignet vi rangeringen av CPG områder i veiledet MVLR analyse med tilsvarende rangering i en MVLR modell som inkluderte alder som en co-faktor. Dette viste at p-verdier av foreningen var stort sett uendret, og at begge rangeringen var sterkt korrelert (Spearman rank korrelasjon = 0,998, figur 1d), som viser at CpG sider som vår Klassifiseringen basert var prediktiv av kreft status uavhengig av alder.
kreft Diagnostic CPGs (CA-CPGs)
Etter å ha fastslått at en DNA-metylering signatur fra perifert blod kan brukes til å forutsi tilstedeværelsen av eggstokkreft, vi neste brukte alle friske kontroller og pre- behandling prøver å utlede en endelig liste over slike «kreft diagnostiske» CPGs (CA-CPGs).
Vi identifiserte totalt 2714 CA-CPGs passerer en FDR terskel på 0,05 (figur 2a, Tabell S2, Figur S3 ). Vi observerte en skew mot hypometylering med 1513 (56%) CA-CPGs viser lavere nivåer av metylering i tilfeller (figur 2a, binomisk test
P
= 9 × 10
-10). Enda mer påfallende, for de 50 CPGs (47 unike genloci), 41 (87%) ble hypomethylated (Binomisk test
P
= 10
-8, Tabell S2). Av de 2714 CA-CPGs, ble 1482 (55%) og 1232 (45%) ligger innenfor (iCpGs) og utenfor (niCpGs) CpG øyer [21], henholdsvis. Gitt overrepresentasjon av iCpGs på tabellen (76% iCpGs vs 24% niCpGs), antall niCpGs assosiert med kreft var mye høyere enn det som var forventet ved en tilfeldighet (figur 2a, Fisher test
P
2
e
-16). Den overrepresentasjon av niCpGs blant CA-CPGs var også tydelig fra inspeksjon av topp 47 CA-CpG gen loci med 32 (68%) lokalisert til niCpGs (Fisher test
P
= 6 × 10
-12 )
a) Fordeling av 2714 CA-CPGs (FDR. 0,05) i form av hyper-og-hypometylering (binomisk test P-verdi gitt), samt i forhold til CpG lokalisering (Fishers eksakte test) . b) Overlapping av alders CPGs med CA-CPGs (Fisher-test P-verdi på overlapping gitt) og fordeling av 198 felles alder og CA-CPGs i form av hypermethylated og hypomethylated mønstre og iCpGs /niCpGs (Binomisk og Fisher-test P-verdier er gitt, henholdsvis). Ut av de 198 CPGs, 47 exbited hypermethylation med alder og kreft, 150 hypometylering med alder og kreft, en hyperM med alder og hypoM med kreft og 0 viste hypoM med alder og hypeM i kreft. c) Gene Set Enrichment Analyse for den vanlige alders CA-CPGs, aldersspesifikke CPGs (dvs. alders CPGs minus CA-CPGs) og CA-spesifikke CPGs (dvs CA-CPGs minus alders CPGs) stratifisert etter hyper /hypometylation. Benjamini-Hochberg justert P-verdier er oppgitt. . De fleste betydelig beriket biologiske termer er gitt
For ytterligere å validere den diagnostiske natur 2714 CPGs, vi evaluert deres overlapper med de 520 CPGs diskriminerende etter behandling prøver med og uten aktiv eggstokkreft (FDR 0,05, ikke data vist). Dette ga en overlapping av 355 CPGs (Fisher test
P
2 × 10
-16), som bekrefter at effektivt samme kreft diagnostisk DNA metylering signatur kunne vært hentet i etterbehandling innstillingen med CA125 nivåer som markører for svulst tilstedeværelse.
biologiske betydningen av DNAm Signatures
for å undersøke potensialet funksjonelle betydningen av CA-CpG sett vi spurte om det var bestemt berikelse av biologiske termer og veier, inkludert en stor database med funksjonelle genekspresjonssignaturer [22]. Nylig viste vi at aldring også har en betydelig innvirkning på DNAm mønster av perifert blod og identifisert 589 CPGs signifikant assosiert med alder (FDR 0,05) [16]. Derfor, for å dissekere rollene til alder og kreft utførte vi Gene sett Enrichment Analysis (GSEA) [22] på CPGs unikt assosiert med alder og kreft, så vel som på 198 CPGs (190 unike genloci) som deles av alder og CA-CpG lister (figur 2b, Tabell S2). Vi merker oss at denne overlappingen var svært signifikant (figur 2b, Fisher test
P
2 × 10
-16), noe som tyder på at alder og tumor nærvær framprovosere vanlige endringer i DNAm mønster av perifert blod. GSEA avdekket funksjonelle foreninger (justert
P
0,05) av fire hovedkategorier av gener (figur 2c, Tabell S3): (i)
REST
-targets og utviklingsgener [23], [24] med hypermethylated alders CPGs, (ii) gener involvert i hematopoese og lymfoid-myeloid differensiering med hypomethylated alder og alders CA CPGs, (iii) gener som er involvert i T-celleaktivering og naturlige killer (NK) mediert cytotoksisitet med hypermethylated kreft-spesifikke CPGs, og (iv) gener involvert i celle-adhesjon og
HOXA9
regulatoriske programmer med hypomethylated kreftspesifikke CPGs.
for å forstå disse funksjonelle assosiasjoner vi antok at noen av disse kan skyldes variasjoner i blodcelletype sammensetning, da dette er kjent for å variere med både alder og tumor nærvær [25] – [29]. For å undersøke dette nærmere, spurte vi om gener kjent for å være forskjellig uttrykt mellom hovedblodcelletyper [30] var overrepresentert i alder og CA-CpG lister. Flere signifikante sammenhenger ble funnet, noe som var mer uttalt for kreft enn de alders forbundet signaturer (tabell 1). Spesielt blant CPGs hypomethylated i krefttilfeller, var det berikelse av gener som er kjent for å være oppregulert i granulocytter (
P
= 2 × 10
-5, tabell 1), mens CPGs hypermethylated i kreft ble beriket for gener som er kjent for å være oppregulert i T-lymfocytter (CD4 +
P
= 0,002, CD8 +
P
= 0,01, Tabell 1, Tabell S4), i samsvar med rapporter om et høyere granulocytt /lymfocytter ratio i blodet hos krefttilfeller sammenlignet med friske kontroller [26], [29]. For å teste dette ytterligere vi sammenlignet metylering nivåer av de CPGs kartlegging til gener oppregulert i granulocytter og lmphocytes mellom friske kontroller og etterbehandling tilfeller med og uten aktiv sykdom (som bestemmes av CA125 nivåer) (figur S4). Som forventet ble gener oppregulert i granulocytter betydelig hypomethylated i etterbehandlings tilfeller med positive CA125 nivåer i forhold til kontroller, mens dette ikke var så for etterbehandling tilfeller uten aktiv sykdom (figur S4). Tilsvarende gener oppregulert i lmphocytes ble betydelig hypermethylated i etterbehandlings tilfeller med positive CA125 nivåer i forhold til kontrollene, mens det ikke var noen forskjell når man sammenligner post-treatmant tilfeller uten aktiv sykdom med kontroller (figur S4).
Age -avhengig DNAm Signatur Spår Tumor Presence
den sterke overlapping mellom alder og kreft forbundet CPGs og funksjonelle berikelse av gener involvert i myeloid-lymfoide differensiering angitt til oss at alder og kreft forårsaker de samme endringene i DNAm mønstre av uavhengig fremskaffe de samme underliggende endringer i blodcelletype sammensetning. Vi har derfor en hypotese om at aldersspesifikke DNAm endringer kan forverres hos pasienter med eggstokkreft. For å teste dette, må vi først beregnet gjennomsnitts metylering nivåer i løpet CPGs gjennomgår bestemt hyper eller hypometylering med alderen. Disse mønstrene viste de forventede korrelasjoner med alderen hos friske kontroller og forbehandling krefttilfeller (3a, c, e, g figur S5). Men vi har også observert at den gjennomsnittlige metylering verdiene var signifikant forskjellig mellom forbehandling tilfeller og kontroller, med lavere gjennomsnittlig metylering i tilfeller versus kontroller for alder hypomethylated niCpGs (figur 3b, Wilcox test
P
= 1 × 10
-13) og iCpGs (figur 3f,
P
= 1 × 10
-11), og tilsvarende høyere gjennomsnitts metylering nivåer i saker sammenlignet med kontroller for niCpGs hypermethylated med alderen (figur 3d,
P
= 3 × 10
-16). Viktigere, disse assosiasjonene med sykdomsstatus var uavhengig av aldersgruppe for hypomethylated niCpGs og iCpGs (3a, e). For de hypermethylated alders CPGs, observerte vi et tilsvarende mønster av hypermethylation i kreft i alle aldersgrupper for niCpGs (figur 3c), men ikke så for iCpGs (Tall 3g, h).
Gjennomsnittlig metylering mønstre av alders- assosiert CPGs valgt gjennom veiledet analyse. (A-b) alder hypomethylated niCpGs. (C-d) alder hypermethylated niCpGs. (E-f) alder hypomethylated iCpGs. (G-h) alder hypermethylated iCpGs. (A, c, e, g) Gjennomsnittlig metylering (y-aksen) av kontroller (grønn) og tilfeller (blå) for hver av de seks aldersgrupper (x-aksen) (50-55,55-60,60-65 , 65-70,70-75, 75). (B, d, f, h) Gjennomsnittlig metylering versus sykdomsstatus (alle aldersgrupper kombin). Alle p-verdier er fra en to-tailed Wilcoxon rank sum test. I alle paneler, gir vi antall prøver i hver gruppe over den tilsvarende boksplott. Tilfeller er pre-behandling prøvene.
For ytterligere å demonstrere at aldersrelaterte DNAm mønstre var uavhengig assosiert med tumor nærvær, spurte vi om alders forbundet CPGs avledet fra de 148 friske kontroller (293 CPGs med FDR 0.3) [16] var i stand til å skjelne prøver i henhold til sykdomsstatus (figur 4a). Unsupervised hierarkisk clustering over 293 CPGs segregert saker fra kontroller (figur 4b, Fisher test
P
= 4 × 10
-13). De samme alders CPGs var også i stand til å diskriminere tilfeller med residiverende aktiv sykdom fra de uten (målt ved serum CA125 nivåer på prøven uavgjort) i et uavhengig sett av blodprøver fra 122 etter behandling tilfeller (Figur 4c, Fisher test
P
= 3 × 10
-5). For ytterligere å etablere betydningen av disse funnene, ikke i noen av 1000 tilfeldig utvalg av 293 CPGs gjorde vi observere P-verdier så ekstrem som disse (figur 4d).
a) Multivariat lineær regresjon av alder i 148 friske blod prøvene mot CpG metylering profiler justering for BSC effektivitet, bakst og DNA inngangseffekter, identifisert 293 CPGs på q (FDR) 0,3. b) Hierarkisk gruppering av de 148 friske kontroller og saker 113 forbehandling (Prêt) over 293 CPGs. De to viktigste klyngene (CLUST) spådd av algoritmen er merket som blå og oransje. Sak kontroll status er indisert som aktiv sykdom (AD): case = svart, kontroll = grå. c) Hierarkisk clustering av 117 etter behandling tilfeller over samme 293 CPGs. Av de 117 etter behandling tilfeller, 47 og 70 hadde tilbakevendende (svart) og ingen tilbakevendende (grå) aktiv sykdom (AD) i prøven uavgjort, henholdsvis. De to viktigste klyngene (CLUST) spådd av algoritmen er merket som blå og oransje. I heatmaps, ble CpG bestemt metylering betaverdier standardisert til null middelverdi og enhet variansen for oversiktens skyld (blå: høy relativ metylering, gul = lav relativ metylering). I paneler b) og c) gir vi antall prøver med aktiv sykdom ved prøven drag i hver klynge, og gi det tilsvarende Fishers eksakte test P-verdi. d) Sammenligning av observerte P-verdier med de som oppnås ved 1000 tilfeldige utvalg av 293 CPGs. P-verdier ble beregnet fra Fishers eksakte test for de to klynger utledes fra å bruke en Gaussian blanding modell [43].
Kreft-Predisposition CPGs
Det er sannsynlig at et lite antall av 2714 CA-CPGs er bona-fide kreft-predisposisjon markører. Vi antok at noen av disse risikomarkører kan være synlig fra 70 etter behandling perifere blodprøver av pasienter som ikke har tilbakevendende sykdom på tidspunktet for prøve uavgjort, men som etter hvert kan utvikle tilbakevendende sykdom, siden slike prøver kan mimick pre- klinisk predisposisjon scenen. For å bestemme strengt om en slik risiko CpG signatur eksisterer, søkte vi en state-of-the-art surrogat Variabel Analysis (SVA) [31], [32] rammeverk, hvilke modeller skjulte og potensielt konfunderende faktorer for å få et mer nøyaktig anslag for FDR (Materialer og metoder). Ved hjelp av SVA vi fått 84 CPGs passerer en FDR terskel på 0,4, noe som tyder på at i gjennomsnitt ca 50 CPGs kan virke diskriminerende mellom etterbehandlingsprøver uten aktiv sykdom (CA125 serumnivåer 30) og friske kontroller (figur S6a, tabell S5). Siden det er mulig at noen av disse reflekterer metylering endringer grunnet behandling, og siden en risiko CpG bør også være diagnostisk, deconvoluted vi effekten av behandlingen ved å finne overlappingen mellom de 84 CPGs og 2714 CA-CPGs (upåvirket av behandlingen), som ga en overlapping på 18 «cancer-predisposisjon» risiko CPGs (Fisher test p = 0,003, figur S6b, tabell S5). Av interesse, denne listen inkluderte
TSG101
, et gen med antatte tumor suppressor roller og en kandidat brystkreft predisposisjon genet [33].
Diskusjoner
Her har vi utført første storskala (over 300 prøver) genome-wide studie av DNAm profiler ved hjelp av en state-of-the art plattform som måler metylering tilstand av over 27.000 CPGs. Vi har vist at eggstokkreft har en betydelig innvirkning på DNAm mønster av perifere blodceller. Mens epigenetisk signatur har vi presentert fortsatt mangler høy spesifisitet er nødvendig for en umiddelbar diagnostisk anvendelse, det faktum at aktive eggstokkreft kan forutsies med en relativ høy nøyaktighet (AUC = 0,8) fra et DNAm profil i blodet viser klart den fremtidige potensialet av epigenetisk profilering som et diagnostisk verktøy.
i tillegg har vi gitt bevis for eksistensen av DNAm markører som kan tjene som tidlig deteksjon eller predisposisjon markører for kreft i eggstokkene. Av de 18 kandidatrisikomarkører, 11 og 7 viste hyper og hypometylering i kreft, henholdsvis med
TSG101 Hotell og pre-mRNA spleising faktor
SFRS6
både under hypermethylation i kreft. Ytterligere bekreftelse på at markørene som er identifisert her kan tjene som tidlig deteksjon eller predisposisjon markører for eggstokkreft vil kreve en stor prospektiv studie, som for tiden pågår [34].
De observerte DNAm mønstre kan oppsummeres i form av to biologisk distinkte signaturer. Først den observasjon at en DNAm signatur for aldring, karakterisert ved differensiell metylering av gener med hematopoietisk celle avstamning og immunsystem funksjoner er forverret i nærvær av kreft i eggstokkene, antyder at en epitelial tumor og aldring fremkaller vanlige endringer i den cellulære sammensetning av perifer blod. Denne tolkningen er ytterligere støttet av det faktum at de samme biologiske betingelser var sterkt anriket blant gener som differensielt uttrykte mellom blodcelletyper [30] (tabell S6), og at gener som vanligvis oppregulert i granulocytter og lymfocytter viste en differensial metylering mønster (tabell 1, fig S4) var i overensstemmelse med en økt granulocytter til lymfocytt-forholdet i respons til aldring eller cancer. Det er betydningsfullt at det er uavhengig bevis for at både aldring og kreft tilstedeværelse fører til en myeloid-forvrenger i myeloid /lymfoide differensiering program, med en tilsvarende høyere granulocytt /lymfocytt-forholdet [25] – [29], et mønster i overensstemmelse med vår observasjon at granulocytt og T-lymfocytter spesifikke gener ble beriket blant CPGs hypo-og hypermethylated i kreft, henholdsvis. Siden denne effekten ble utledes fra DNAm profiler, ser det ut til at uttrykket av et betydelig antall gener som karakteriserer Bood celletyper er under direkte epigenetisk regulering.
Et annet beslektet spørsmål er om den diagnostiske epigenetisk signatur er spesifikke for eggstokkreft kreft. Hvis ulike kreftfremkalle lignende immunresponsen og dermed tilsvarende endringer i blodcelletype sammensetning, kan vi forvente en andel av identifiserte diagnose signatur å være ikke-kreft spesifikk. Men for å sikkert fastslå at dette er tilfelle, og at alder og kreft er ikke medier immuno-kompromittere effekter via epigenetisk modifikasjon av bestemte celletyper, krever ytterligere data ikke er levert av vår studie. Tilsvarende om deler av de observerte kreft signaturer kan være årsaks involvert i sykdommen må avvente videre undersøkelser.
En annen DNAm signaturen ble preget av CPGs gjennomgår hypermethylation med alderen og ble høyanriket for utviklings gener og
REST
-targets. Gitt at
REST product: (
NRSF
) er involvert i undertrykkelse av gener som er nødvendige for differensiering av embryonale og voksne stamceller [24], alder-indusert hypermethylation av
REST
-targets, hvis bekreftet i en stamcelle befolkningen, kan representere en generell mekanisme for aldersrelatert tap av stamcellefunksjon og økt disposisjon for kreft [5].
til slutt, våre funn at de fleste av metyleringen variabiliteten er forbundet med niCpGs ytterligere støtter det syn at det meste av fenotypisk aktuelle DNAm variasjon er å finne i andre enn CpG øyer [19] regioner. Bekrefter dette videre, den observerte sammenhengen mellom genuttrykk forskjellige blodcelletyper og mønster av DNA hypo og hypermethylation var mye sterkere for niCpGs enn iCpGs (data ikke vist).
I sammendraget, dette arbeidet viser at DNAm profilering i blodet har betydelige løftet som en fremtidig diagnostisk eller risiko prediksjon verktøyet og warrants videre høyere CpG-dekning studier for å fullt ut klargjøre denne rollen.
Materialer og metoder
beskrivelse av UKOPS Prøvetaking
det er totalt 540 fullblodprøver ble trukket fra Storbritannia Eggstokkreft befolkningsundersøkelsen (UKOPS) for inkludering i denne studien. Tilfeller (n = 266) besto av postmenopausale kvinner diagnostisert med primær ovarialcancer. Halvparten av tilfellene (før behandling tilfeller; n = 131) ga sitt blod på tidspunktet for sin diagnose før behandling og den andre halvparten (etter behandlingen tilfeller; n = 135) ga sitt blod på et tidspunkt i løpet av sin oppfølging besøk etter primærbehandling (2,4 ± 2,7 år mellom diagnose og blodprøve tatt). Controls (n = 274) var tilsynelatende friske postmenopausale kvinner rekruttert fra Storbritannia Collaborative Trial for eggstokkreft Screening (UKCTOCS) [34] som årlige serumprøver er tilgjengelige. Rekruttering fant sted på 8 deltakende sykehus i Storbritannia. Kvinner med en tidligere historie av bilateral ooforektomi og /eller kreft ble ekskludert fra studien. Alle saker og friske kontroller ble postmenopausale og alderstilpassede og detaljerte kliniske egenskaper er gitt i tabell S1.
Prøve Processing
Blodprøver ble samlet av studien sykepleier ved de regionale sentrene i rør ( 9 ml K3 EDTA Vacuette rør, produsert av Greiner Bio One) og ble frosset innen 3 timer etter innsamling. Prøvene ble lagret ved -80 °
C
på regionalt senter og ble fraktet til sentrallaboratoriet ved UCL på kvartalsbasis. Når mottatt i den sentrale laboratoriet ble prøvene registrert og overført til -80 °
C
fryser inntil DNA ble ekstrahert. Serum CA125 konsentrasjoner ble bestemt av elektrokjemiluminescens sandwich-immunoassay på en Elecsys 2010 (Roche Diagnostics, Burgess Hill, UK) ved hjelp av to monoklonale antistoffer (OC125 og M11, Fujirebio Diagnostics AB, Göteborg, Sverige), og verdier 30 ble tatt som en markør av aktiv sykdom [35]. Over 95% av pre-behandling tilfellene hadde CA125 30, mens blant etterbehandling tilfeller ca 40% hadde aktiv tilbakevendende sykdom (ca125 30).
DNA Extraction og bisulfitt Modification
DNA ble ekstrahert ved Tepnel, ved anvendelse av en kloroform basert utvinning metoden og 800 ng (2 x 400 for hver prøve). Gjennomsnittlig DNA konsentrasjonen var 33,0 ± 17,4 ng /mL. DNA fra hver prøve var bisulfitt endres ved hjelp av EZ DNA Metylering Kit D5008 (Zymo Research, Orange, CA, USA) i henhold til produsentens instruksjoner.
Illumina infinium analysen
Metylering analyse ble utført ved hjelp av Illumina infinium Menneskelig Methylation27 BeadChip. Kort, bisulfitt omdannet DNA ble forsterket, fragmentert og hybridisert til BeadChip arrays (hver brikke plass til 12 prøver som er utpekt av Sentrix posisjonerer A-L).
