Abstract
Blokkering av epidermal vekstfaktor reseptor (EGFR) aktiviteten har vært en primær terapeutisk mål for ikke-småcellet lungekreft (NSCLC). Som pasienter med vill-type EGFR har vist bare beskjeden utbytte av EGFR-tyrosinkinase-inhibitorer (TKI), er det et behov for ytterligere terapeutiske tilnærminger i pasienter med vill-type EGFR. Som en viktig del av nedstrøms intesignalisering og kjent reseptor krysstale med EGFR, hypotese vi at målretting brennvidde heft kinase (FAK) aktivitet, som også har vist seg å korrelere med aggressive scenen i NSCLC, ville føre til økt aktivitet av EGFR TKI . Som sådan, EGFR-TKI-resistente NSCLC celler (A549, H1299, H1975) ble behandlet med EGFR TKI erlotinib og FAK-hemmere (PF-573,228 eller PF-562,271) både som enkeltmidler og i kombinasjon. Vi er fast bestemt celle levedyktighet, apoptose og 3-dimensjonale vekst
in vitro Hotell og vurderes tumorvekst
in vivo
. Behandling av EGFR-TKI-resistente NSCLC-celler med FAK-inhibitoren alene effektivt inhiberte cellelevedyktighet i alle cellelinjene som ble testet; imidlertid dens anvendelse i kombinasjon med EGFR-TKI erlotinib var mer effektive for å redusere cellenes levedyktighet enn hver behandling alene når det ble testet i både 2- og 3-dimensjonale analyser
in vitro
, med forbedret fordel sett i A549-celler. Denne økede effekt kan være delvis skyldes den observerte inhibering av Akt-fosforylering når medikamentene ble gitt i kombinasjon, der igjen A549 celler demonstrerte det mest inhibering etter behandling med medikamentkombinasjonen. Kombinere erlotinib med FAK-hemmer var også potent
in vivo
som dokumentert av redusert tumorvekst i A549 mus xenograft modell. Vi videre konstatert at økt følsomhet var uavhengig av LKB1 mutasjonsstatus. I sammendrag viser vi effekten av å kombinere erlotinib og FAK-inhibitorer for anvendelse i kjente EGFR vill-type, EGFR-TKI-resistente celler, med det potensialet som en undergruppe av celletyper, som omfatter A549, kan være spesielt følsomme for denne kombinasjonsbehandlingen. Som sådan, videre evaluering av denne kombinasjonsbehandlingen er berettiget og kan vise seg å være en effektiv terapeutisk tilnærming for pasienter med iboende EGFR-TKI-resistente NSCLC
Citation. Howe GA, Xiao B, Zhao H, Al-Zahrani KN, Hasim MS, Villeneuve J et al. (2016) Focal Heft kinase hemmere i kombinasjon med Erlotinib Demonstrer Forbedret antitumoraktivitet i ikke-småcellet lungekreft. PLoS ONE 11 (3): e0150567. doi: 10,1371 /journal.pone.0150567
Redaktør: Jeremy J.W. Chen, Institute of Biomedical Sciences, TAIWAN
mottatt: 28 september 2015; Godkjent: 14 februar 2016; Publisert: 10 mars 2016
Copyright: © 2016 Howe et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet:. All relevant data er innenfor papir
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av et stipend til CLA fra Lung Cancer Research Foundation (https://www.lungcancerresearchfoundation.org). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling eller analyse, beslutning om å publisere eller utarbeidelsen av dette manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
forkortelser: DMSO, dimetylsulfoksyd; ECM, ekstracellulære matrise; EGFR, epidermal vekstfaktor-reseptor; FAK, fokale vedheft kinase; LKB1, lever kinase B1; NSCLC, ikke-småcellet lungekreft; PBS, fosfatbufret saltoppløsning; PF-228, PF-573228; PF-271, PF-562271; TKI, tyrosinkinasehemmer
Innledning
Lunge kreft står for flere dødsfall enn noen annen type kreft [1] med ~ 80% av lungekrefttilfellene blir klassifisert som ikke-småcellet lungekreft (NSCLC) [2]. Epidermal vekstfaktor-reseptor (EGFR) protein er overuttrykt i opp til 80% av NSCLCs, derav EGFR har vært en primær terapeutisk mål for NSCLC [3,4]. For dette formål har midler blitt utviklet for å nå både den ekstracellulære domene og intracellulære kinase domene av EGFR. Hemmere rettet mot kinase domene av EGFR, slik som erlotinib og gefitinib, har vist lovende for pasienter med aktiverende mutasjoner (dvs. i eksoner 18, 19 eller 21) i EGFR [5-8], selv om disse hemmere har vist beskjedne fordeler for pasientene husing villtype EGFR [9,10]. Dessuten kan sekundære mutasjoner i EGFR eller c-MET forsterkning utvikler, som gir resistens hos tidligere sensitive pasienter [11]. Som forekomsten av EGFR aktiverende mutasjoner er relativt lav i de fleste nordamerikanske og europeiske populasjoner [12-15], er det et behov for å forbedre følsomheten til EGFR-tyrosinkinase-inhibitorer (TKI) for pasienter med vill-type EGFR.
fokal adhesjonskinase (FAK) er en ikke-reseptor tyrosinkinase som lokaliserer på områder av celle-adhesjon til den ekstracellulære matriks (ECM) og medierer aliserte hendelser nedstrøms av integrin inngrep av ECM. FAK er kjent for å regulere celleoverlevelse, proliferasjon og migrasjon [16]. FAK uttrykket har også vist seg å være oppregulert i mange krefttyper, inkludert lungekreft [17], og dermed plassere FAK som et viktig mål for reguleringen i kreftterapi. For dette formål har FAK-inhibitorer blitt utviklet, herunder farmakologiske inhibitorer av FAK tyrosinkinaseaktivitet [18,19]. Inhibering av FAK er blitt demonstrert å påvirke en rekke cellulære prosesser som er viktige for tumorvekst og progresjon av sykdom inkludert angiogenese og metastase [20-22]. I tillegg er FAK-inhibitorer blitt vist å effektivt inhibere tumorvekst i en rekke subkutane xenograft-modeller [23,24] lovende som enkle midler, så vel som i kombinasjon med andre inhibitorer [24-26].
I NSCLC, blir øket ekspresjon nivåer av FAK observert i tumorvev sammenlignet med normalt lungevev, og denne økede ekspresjon er korrelert med økt sykdomsstadier [27]. Disse funnene tyder på en viktig rolle for FAK i utviklingen av NSCLC. Nyere bevis har også innblandet β1 inte uttrykk i motstand mot EGFR TKI gefitinib, med økt gefitinib følsomhet blir sett følgende β1 inte uttømming hos NSCLC celler [28]. Gitt at FAK er en av de viktigste kinaser aktivert nedstrøms for β1 integrin, er betydningen av ECM-fokal adhesjon komplekse signalisering i resistens mot EGFR TKI behandling indikert. Som det er en etablert praksis å behandle NSCLC pasienter med EGFR TKI og det økende bevis for at FAK spiller en viktig rolle i kreft vekst og progresjon lunge, vi setter ut for å teste nytten av å kombinere EGFR-hemmer erlotinib med FAK hemming i NSCLC. Vi undersøkte effekten av to FAK-inhibitorer, PF-573 228 (PF-228) og PF-562 271 (PF-271) på NSCLC cellevekst i kultur og tumorvekst i mus xenograft-modeller som både enkle midler og i kombinasjon med erlotinib. Resultatene fra vår studie viser at å kombinere FAK hemming med erlotinib reduserer mer effektivt EGFR villtype NSCLC celleviabilitet
in vitro Hotell og xenograft tumorvekst
in vivo
enn både medikamentell behandling alene, med særlig effekt ved A549 celletype. Dermed har våre resultater identifisert en lovende legemiddelkombinasjonen strategi rettet mot EGFR og FAK i NSCLC, og indikerer at et behandlingsregime inkludert et FAK-hemmer kan vise seg mer fordelaktig enn behandling med erlotinib alene hos pasienter som iboende EGFR-TKI-resistente NSCLC.
Metoder
Cell kultur og reagenser
humane cellelinjer A549 (EGFR vill-type) og H1299 (EGFR villtype) ble kjøpt fra ATCC, mens H1975 (EGFR L858R og T790M mutasjoner), HCC827 (EGFR ΔE746-E750) og HCC4006 (EGFR ΔL747-E749) cellelinjer var en gave fra Dr. Ming Tsao (Princess Margaret Hospital, Toronto, ON). A549-celler ble holdt i DMEM (Mediatech, Manassas, VA) supplert med 10% føtalt bovint serum (FBS; Medicorp, Montreal, QC), mens H1299, H1975, HCC827 og HCC4006 celler ble holdt i RPMI-1640 (HyClone Laboratories, Logan , UT) med 10% FBS. Alle cellelinjer ble dyrket ved 37 ° C og 5% CO
2. Den FAK inhibitor PF-573228 (PF-228) ble kjøpt fra Tocris Biovitenskap (Bristol, UK) og oppløst i DMSO. Erlotinib og FAK inhibitor PF-562271 (PF-271) ble kjøpt fra Shanghai Biochempartner Co Ltd (Shanghai, Kina) og oppløst i DMSO for
in vitro
cellekulturarbeid.
generering av erlotinib resistente celler
HCC4006 celler som var opprinnelig følsomme overfor erlotinib ble gjort motstandsdyktig mot erlotinib gjennom 5 runder med doseøkning starter med 0,005 mikrometer erlotinib og økende konsentrasjon med en faktor på fem til celler som er resistente mot 3 mikrometer erlotinib ble isolert. Parentale celler ble behandlet med ekvivalente mengder av DMSO til celler som gjennomgår seleksjon for resistens for varigheten av den doseeskalerings forsøket, og disse ble anvendt som kontroller for alle etterfølgende eksperimenter.
Plasmid transfeksjon av LKB1 inn i A549-celler
A549 celler ble transfektert med pcDNA3-FLAG-LKB1 (plasmid 8590 [29], Addgene, Cambridge MA) å overuttrykker LKB1 eller med pcDNA3.1 som vektor kontroll ved hjelp GeneJuice transfeksjon reagens (Novagen, Etobicoke, ON). Transfekterte celler ble sådd inn i flere vevskulturskåler og etter 48 timer, aktivt delende celler ble behandlet med 500 pg /ml Geneticin (Invitrogen, Burlington, ON) for å lette valget av plasmid-uttrykkende celler. Cellene i hver vevskulturskål som gjenstår etter valg ble slått sammen for å lage en rekke sammenslåtte kloner av både LKB1 uttrykker og ikke-uttrykkende A549-celler. Bekreftelse av LKB1 uttrykk i FLAG-LKB1 transfekterte celler og fortsatt mangel på LKB1 uttrykk i kontrollceller ble bekreftet av western blotting for LKB1.
siRNA transfeksjon
H1299 celler var enten mock transfektert (PBS) eller transfektert med siGENOME ikke-måls kontroll siRNA # 2 eller siGENOME SMARTpool LKB1 siRNA (cat # M-005035-02, Dharmacon, Lafayette, CO) med Oligofectamine reagens (Invitrogen, Burlington, ON). Effektivitet av LKB1 knockdown ble bekreftet gjennom western blotting. For MTT analyser utnytte siRNA-transfekterte celler, medikamentell behandling påbegynt på 48 timer etter transfeksjon. For forsøk med stimulering av celler med EGF for western blotting, siRNA-transfekterte celler ble serum-sultet over natten begynnelse ved 48 timer etter transfeksjon før vekstfaktor stimulering.
MTT cellenes levedyktighet assay
Celler ble sådd ut i 96-brønns plater ved en densitet på 4000 celler /brønn og inkubert over natten. For dose eskalerings og medikamentkombinasjon eksperimenter ble celler behandlet med enten erlotinib eller PF-228 alene eller i kombinasjon i forskjellige konsentrasjoner av medikament i DMEM eller RPMI-1640 supplert med 5% FBS i 48 timer. Celleviabilitet ble så vurdert med MTT reagens (Thiazolyl blå tetrazoliumbromid, Sigma, Oakville, ON) som tidligere beskrevet [30] med absorbans blir bestemt ved 570 nm med en Multiskan Ascent plateleser (Thermo Scientific, Rockford, IL). Behandlinger ble utført i replikater på seks med middelverdiene uttrykt som prosent levedyktigheten i forhold til DMSO-behandlet kontrollgruppe (100% levedyktig). Naturen av effekten av erlotinib i kombinasjon med FAK inhibitor PF-228 ble bestemt av Chou-Talalay metode [31] med CalcuSyn programvare (Biosoft, Cambridge, UK). Data for celle-levedyktighet målt ved MTT for hvert legemiddel alene og i kombinasjon ble anvendt i CalcuSyn programmet til å produsere fraksjon-påvirket CI (Fa-CI) plott som viser kombinasjonsindeksen (CI) verdier for hver legemiddelkombinasjon. CI verdier 1 indikerer synergis interaksjoner, CI verdier 1 indikerer antagonistisk interaksjon og CI-verdier = 1 indikerer additiv interaksjon.
FAK immunpresipitering og in vitro-kinaseanalyse
Immunoutfelling og kinase-reaksjoner ble utført som tidligere beskrevet [32]. Kort fortalt ble like mengder total cellelysat (600 mikrogram) immunopresipitert for FAK med anti-FAK antistoff (BD Biovitenskap, Mississauga, ON) og 20 ul Protein A /G sepharose perler (GE Healthcare, Uppala, Sverige), mens roterende for 2 timer ved 4 ° C. Perlene ble deretter vasket 3 ganger med 200 mM NETN (20 mM Tris-HCl, pH 8,0, 1 mM EDTA, pH 8,0, 200 mM NaCl, 0,5% Igepal CA-630) etterfulgt av en vask i kinase-buffer (0,25 mM NAVO
3, 20 mM Tris-HCl, pH 7,4, 1 mM NaF, 10 mM β-glycerofosfat, 1 mM ditiotreitol, 15 mM MgCl
2). DMSO (bærerkontroll) eller FAK-inhibitor PF-228 ved 1 eller 5 uM-konsentrasjoner ble deretter tilsatt til reaksjonsblandingen i 20 ul kinase-buffer og inkubert i 20 minutter ved 30 ° C. Den kinaseanalyse ble deretter satt i gang med 1 mL av [
32P] γATP (5 uCi /ul) og inkubert i 30 minutter ved 30 ° C under blanding for hvert 10. minutt. Reaksjonen ble avsluttet etter tilsetning av 4 X SDS prøvebuffer. Prøvene ble løst på en 7,5% polyakrylamidgel og overført til PVDF-membran. Membranen ble utsatt for autoradiografi for utvikling av FAK-fosforylering arrangementer og probet for total FAK-nivåer ved Western-blotting som beskrevet nedenfor.
Strømningscytometri
Celler ble behandlet med oppløsningsmiddel-kontroll (DMSO), erlotinib , PF-228, eller begge deler erlotinib og PF-228 i medium inneholdende 5% FBS i 48 timer. Både ikke-adherente og adherente celler ble samlet opp og slått sammen, vasket to ganger med PBS og resuspendert i 70% etanol for permeabiliseringen. Cellesuspensjonene ble deretter behandlet med propidiumjodid-løsning (48 ug /ml propidiumjodid, 40 pg /ml RNase A) i 30 minutter ved romtemperatur. Totalt 1 x 10
4 celler ble evaluert ved bruk av Beckman Coulter Epics XL flowcytometer (Beckman-Coulter, Mississauga, ON) og andelen av apoptotiske celler ble beregnet fra celler med mindre enn 2 N DNA innhold ved hjelp av FCS Express flyt cytometri analyse programvare (De Novo Software, Los Angeles, California).
Western blot analyse
Etter total protein utvinning, ble western blotting utført som tidligere beskrevet [30]. Primære antistoffer som brukes i denne studien var som følger: (. Cat # 9272) (. S473, Cat # 9271) kanin anti-Akt, Pakt, LKB1 (Cat # D60C5.) Og PARP-antistoffer var fra Cell (Cat # 9542.) signale Technology (Danvers, MA), mus anti-FAK (klon 77 /FAK) var fra BD Transduction Laboratories (Mississauga, ON), og mus anti-β-actin antistoff (klone AC-74) var fra Sigma (St. Louis , MO). Etter inkubering med primært antistoff over natten, ble membranene vasket 3 x 5 minutter og inkubert i pepperrotperoksidase (HRP) konjugert geite-anti-muse-eller geite-anti-kanin-sekundært antistoff (Calbiochem, San Diego, CA) i 1 time. Membraner ble deretter vasket 6 x 5 minutter og inkuberes i Immobilon Western Chemiluminescent HRP substrat (EMD Millipore, Billerica, MA) før bildet utvikling ved hjelp av GeneGnome Bio Imaging System og GeneSnap programvare (Syngene, Frederick, MD).
Colony vekstanalyse
Lab-Tek II 4-brønners kammerobjektglass (Nalge Nunc International, Naperville, IL) ble belagt med 100 ul av redusert vekstfaktor basalmembran ekstrakt (BME; Trevigen, Gaithersburg, MD), hvilken størknet i 30 minutter ved 37 ° C. Cellene ble deretter sådd ut på det størknede BME sjiktet ved en tetthet på 5000 celler /brønn i medium som inneholdt 10% FBS og 2,5% BME. Medium ble oppdatert hver tredje dag. Celle kolonistørrelsene ble bestemt med ImageJ programvare fra en totalt 4 bilder fra hver av duplikate brønner for hvert eksperiment.
In vivo-tumorvekst
A549 lungekreftceller (1 x 10
6 celler) ble injisert subkutant inn i både den venstre og høyre bakben flankene av 6-uker gamle CD-1 nakne mus (Charles River, Wilmington, MA). Mus ble plassert i spesifikke patogenfrie forhold, på en 12 timers lys /mørke syklus med ad libitum foring og vann for varigheten av forsøket. Tre dager etter injeksjon, mus (4 mus /behandlingsrom) ble først behandlet ved oral sonde med kjøretøykontroll, eller med tidligere påviste effektive konsentrasjoner av erlotinib (50 mikrogram /g) [33], PF-271 (50 mikrogram /g) [ ,,,0],23], eller en kombinasjon av begge medikamenter i PBS med 5% Gelucire (bærerkontroll). Legemidler ble deretter administrert ved oral tvangsforing daglig i fem påfølgende dager, etterfulgt av to dager uten behandling, og prosessen ble deretter gjentatt for varigheten av forsøket. Målinger av tumorstørrelse ble tatt en gang i uken ved kalibermåling og tumorvolum ble beregnet ved anvendelse av følgende formel: tumorvolum = (bredde)
2 x (lengde) /2. Alle dyreforsøk ble utført og godkjent av University of Ottawa Animal Care komité og dannet til retningslinjer fastsatt av
Dyr for forskningsloven
og Canadian Council on Animal Care
Guide til omsorg og bruk av forsøksdyr
(Vol. 1, 2. utg., 1993), og oppfyller standarder for praksis i fagområdene forsøksdyrlære og forsøksdyrveterinærmedisin. I henhold til godkjent protokoll, ble dyrene avlivet ved karbondioksyd kvelning fulgt av cervikal dislokasjon ved forhåndsbestemte eksperimentelle endepunkter blant a) tumormasse til et punkt hvor det i betydelig grad forstyrrer normale kroppsfunksjoner eller forårsaker smerte, b) var i overensstemmelse eller hurtig vekttap mer enn 20% av kroppsvekten c) sårdannelse /infeksjon av tumorstedet (brudd i huden barrieren), e) tumor belastning . 10% av musekroppsvekt g) alvorlig respiratorisk distress eller h) ambulatorisk distress en eller annen grunn
Ex vivo lunge svulst analyse
Kirurgisk resected NSCLC svulster og normal tilstøtende lungevev ble samlet etter patologisk evaluering fra fem pasienter som ga skriftlig informert samtykke i henhold til protokoll godkjent av Ottawa Hospital forskningsetikk Board ( protokoll # 20120559-01H). Pasient egenskaper er beskrevet i tabell 1. Vevet ble behandlet på samme dag for bruk i
ex vivo
eksperimenter. En biopsi stempel (Miltex GmbH, Rietheim-Weilheim, Tyskland) ble benyttet for å oppnå 2 mm diameter kjerner fra begge lungetumorvevet og normalt lungevev og videre delt inn 1 mm tykke skiver med tre stykker deretter tilfeldig fordelt i triplikate brønner på en 24 -Vel vev kultur plate. Vevssnitt ble opprettholdt i DMEM supplert med 10% FBS og 100 U /ml antibiotisk /antimykotisk oppløsning (Gibco, Waltham, Massachusetts) ved 37 ° C og 5% CO
2. Ettersom hvert vev skive er ikke nødvendigvis identiske med hensyn til sin celletetthet eller levedyktigheten ved tidspunktet for isolasjon, dagen etter isolering, ble levedyktighet av vevssnitt vurdert på en per brønn basis før medikament tilsetning etter inkubasjon i 4 timer med en 10 % alamarBlue løsning (ABD Serotec, Raleigh, NC). Innlegg behandlings målingene ble deretter normalisert til disse baseline målinger av levedyktighet for hver brønn. Vevssnitt ble behandlet dagen etter isolering med enten bærerkontroll (DMSO), erlotinib (10 uM) ble PF-271 (5 uM), eller en kombinasjon av begge medikamenter i 48 timer og cellelevedyktighet så vurdert med 10% alamarBlue oppløsning . Fluorescens ble målt (eksitasjon 530 nm /emisjon 590 nm) med en Fluoroskan Ascent fluorescens plateleser (Thermo Scientific, Rockford, IL) 4 timer etter tilsetting av alamarBlue.
Statistiske analyser
Alle statistiske analyser ble utført ved hjelp av Prism 6.0 (GraphPad, La Jolla, CA). Multiple sammenligninger ble utført av ANOVA mens enkle sammenligninger ble utført av uparede Student
t
tester. Statistisk signifikante forskjeller ble bestemt som
P
0,05 fra minimum to uavhengig utført eksperimenter.
Resultater
Hemming av FAK reduserer celle levedyktighet i EGFR-TKI-resistente NSCLC celler
For å vurdere effekten av behandling EGFR TKI-resistente NSCLC-cellelinjer med FAK TKI, benyttet vi to EGFR villtype-cellelinjer (A549, H1299) med kjent ufølsomhet til EGFR TKI [34], så vel som EGFR mutantcellelinje H1975, med ervervet EGFR TKI motstand på grunn av en T790M mutasjon i EGFR-genet [35]. Disse tre cellelinjene således gitt oss med rimelige eksempler for å teste effektiviteten av tilsetning av et FAK-tyrosinkinase-inhibitor for å erlotinib behandling for å mer potente hemmere av veksten av EGFR-TKI-resistente NSCLC-celler.
Vi først testet FAK-inhibitor PF-228 [36] og vurdert sin evne til å doseavhengig (0,001 til 25 uM) inhiberer veksten av NSCLC-cellelinjer
in vitro
. Behandling av celler med økende doser av PF-228 viste at alle tre EGFR-TKI-resistente cellelinjer (A549, H1299, H1975) var følsomme for dette stoffet ved konsentrasjoner større enn 1 mikrometer (Fig 1A). IC50-verdiene for PF-228 bestemmes fra diagrammet var: 5,6 uM (R «sup> 2 = 0,92) i A549, 6,6 uM (R
2 = 0,95) i H1299 og 10,4 uM (R» sup> 2 = 0.80 ) i H1975. Interessant, levedyktighet to EGFR-TKI-sensitive cellelinjer (HCC827, HCC4006) [34] var mye høyere (~ 75% av cellene gjenværende levedyktig sammenlignet med kontrollgruppen behandlet) enn de EGFR-TKI-resistente cellelinjer (~ 10% av cellene gjenværende levedyktig sammenlignet med kontrollgruppen behandlet) ved den høyeste dosen av PF-228 testes (25 pM) (fig 1 A), selv om årsaken til denne forskjellen i levedyktigheten ennå ikke er forstått. Da de to cellelinjer som hadde iboende motstand mot erlotinib og var både EGFR villtype så ut til å være mer følsomme for den FAK-inhibitor enn de H1975 celler som hadde EGFR mutasjoner som resulterer i ervervet følsomhet, undersøkte vi hvorvidt celler innledningsvis er følsomme for erlotinib ble også mer følsom for Fak på å få kjøpt narkotika motstand. HCC4006 celler som ble gjengitt motstandsdyktig overfor erlotinib følgende serieaging i økende konsentrasjoner av erlotinib opp til 3 um, resulterte i cellekloner med betydelig mindre følsomhet for erlotinib med IC50s på 1,3 mikrometer (R
2 = 0,87) og 16,8 mikrometer (R
2 = 0,73) for resistente kloner 1 og 2 henholdsvis sammenlignet med kontrollceller som ble serielt passert i like volumer av DMSO kontroll med en IC50 på 0,21 pM (R «sup> 2 = 0,91) (figur 1B). Det skal bemerkes at begge disse klonene viste erlotinib motstand ved tilsvarende eller høyere nivåer til de resistente paren valgte linjer (med IC50s som strekker seg fra 1.2μM, 5.3μM og 5.9μM for A549, H1299 og H1975 henholdsvis). Erlotinib resistente HCC4006 cellene viste økt følsomhet for Fak hemmere med IC50s på 8,0 mikrometer (R
2 = 0,96) og 8,7 mikrometer (R
2 = 0,95) for kloner 1 og 2 henholdsvis sammenlignet med kontroll HCC4006 klone med en IC50 på 12,3 uM (R
2 = 0,90) (figur 1C). Mens erlotinib resistente cellekloner gjorde showet økt følsomhet for FAK-hemmere, forble de mindre følsomme for PF-228 sammenlignet med EGFR villtype iboende erlotinib motstandsdyktig A549 eller H1299 celler. Det er således usannsynlig at hovedmekanismen av ervervet resistens overfor erlotinib i EGFR mutant NSCLC avhenger i betydelig grad av FAK-aktivitet.
(A) Cellelevedyktigheten ble vurdert ved behandling med PF-228 ved forskjellige doser i 48 timer i fullstendig media med 5% FBS. Cellelevedyktigheten ble bedømt ved MTT-analyse med levedyktigheten til DMSO-behandlede celler er angitt som 100%. Data indikerer gjennomsnitt ± SEM for log [inhibitor] vs. normalisert respons fra to uavhengig utført eksperimenter. (B) HCC4006 celler i serie dyrket i økende konsentrasjoner av erlotinib opp til 3 uM ble bekreftet motstandsdyktig i forhold til parentale celler etter MTT-analyse av celler behandlet med økende konsentrasjoner av erlotinib. Data tegnes som gjennomsnittet av log [inhibitor] vs normalisert respons ± SEM (n = 2). (C) Erlotinib motstandsdyktig HCC4006 celler er mer følsomme for Fak inhibitor PF-228 enn foreldre HCC4006 celler. Celler ble behandlet med økende konsentrasjoner av PF-228 og cellelevedyktigheten ble bedømt ved MTT-analyse. Dataene er presentert som gjennomsnitt av log [inhibitor] vs normaliserte respons ± SEM (N = 2). (D) Relativ protein uttrykk mellom erlotinib resistente (A549, H1299, H1975) og sensitive (HCC827, HCC4006) foreldrecellelinjer. (E) A549 cellelysater ble immunopresipitert for endogen FAK og underkastet
in vitro kinasebestemmelser
i nærvær av enten DMSO (vehikkelkontroll) eller PF-228 (1 uM eller 5 uM). Autoradiografi avslørte FAKfosforylering (FAK AUTORAD) og western blotting indikerte totale nivåer av FAK (IB: FAK).
Vi evaluerte også om følsomheten til Fak hemmere observert i foreldre NSCLC cellelinjer ble assosiert med basal ekspresjon av noen store proteiner i disse medikament target veier. Følsomheten til FAK narkotika så ikke ut til å korrelere med generelle nivået av FAK, EGFR eller ß1 inte proteiner, da disse nivåene dukket variabel i både sensitive og ufølsomme cellelinjer (figur 1D). Gitt at de tre EGFR-TKI-resistente NSCLC-cellelinjer hadde IC50-verdier for PF-228 som strekker seg fra 5 til 10 um, og at vårt laboratorium har tidligere observert hemming av både autofosforylering og kinaseaktivitet av FAK ved 5 uM PF-228 [20] bekreftet vi aktiviteten av denne inhibitor i A549-celler etter
in vitro
kinase analyser for FAK autofosforylering. Tilsetningen av PF-228 til kinasereaksjonen inhiberte signifikant FAK-autofosforylering i A549-celler (figur 1E) med lignende resultater blir observert i H1299 og H1975 cellelinjer (data ikke vist). Således ble etterfølgende eksperimenter utført under anvendelse av konsentrasjoner av PF-228 i området 1-10 um.
FAK-inhibitor PF-228 synergizes med erlotinib for mer effektivt å redusere cellenes levedyktighet i EGFR villtype NSCLC-celler
Som behandling med FAK TKI alene viste seg å hemme levedyktigheten til de EGFR-TKI-resistente NSCLC-celler ble testet i figur 1, ved ønsket å bestemme hvorvidt tilførsel av PF-228 kan sensibilisere celler som erlotinib, eller i det minste , resultere i en additiv reduksjon i celleviabilitet utover det av behandling med erlotinib alene. Celler ble således behandlet med erlotinib (1-25 uM), eller PF-228 (1-10 uM) alene og i kombinasjon, og cellelevedyktigheten ble bedømt ved MTT-aktivitet. Alle tre cellelinjene som ble testet viste resistens mot erlotinib behandling alene, selv ved svært høye konsentrasjoner (dvs. 25 pM, figur 2A) resultater fra tidligere undersøkelser angående EGFR-TKI motstand i både EGFR villtype og T790M mutasjon-inneholdende cellelinjer [34 bekrefter, 35,37-39]. Når erlotinib og PF-228 ble brukt i kombinasjon observerte vi en økt cytotoksisk effekt på A549, H1299 og H1975 celler som vi hadde hypoteser (Fig 2A). Chou-Talalay metode ble anvendt for å bestemme innholdet av medikamentkombinasjonen virkning [31]. Kombinasjonen indeks (CI) ble bestemt ved å plotte fraksjonen påvirkes hvor KI-verdier mindre enn 1 anses synergistisk, verdier CI større enn en anses antagonistisk, og CI verdier lik 1, er betraktet som additiv. Kombinasjonen av erlotinib og PF-228 resulterer i redusert cellelevedyktighet ble funnet å være synergistisk i alle tre cellelinjene som ble testet (figur 2B). Som et sekundært system vi anvendte bruken av humane lungekreftpasient tumor eksplantater for ytterligere å teste effektiviteten av FAK TKI i lungekreftceller. Tumor explants fra uselekterte pasienter som gjennomgår torakotomi for tidlig stadium lungekreft ble behandlet
in vitro
med erlotinib eller FAK TKI alene eller i kombinasjon. Behandlingen av eksplantert lunge svulst med erlotinib alene viste en beskjeden, men ikke statistisk signifikant reduksjon i celle levedyktighet (figur 2C, venstre panel). Lignende beskjeden reduksjon av cellenes levedyktighet ble også observert i tilgrensende normalt lungevev følgende erlotinib behandling alene (figur 2C, høyre panel). Vi har observert at pasientens lunge cancer var også følsomme for FAK TKI hemming med en trend i retning av mer effektiv inhibering når de brukes i kombinasjon med erlotinib (figur 2C). Til tross for den lille størrelsen på utvalget og variasjonen i forbindelse med testing i heterogene vev (dvs. ulike prosenter av svulsten til stroma kan oppstå i hver pasientprøve), ble vi oppmuntret av den åpenbare fordelen av legemiddelkombinasjonen i løpet av erlotinib behandling alene, i likhet med hva vi har observert i våre cellelinje eksperimenter. Av ytterligere betydning, tilstøtende normalt lungevev ut til å være upåvirket av FAK TKI behandlinger alene eller i kombinasjon med erlotinib (figur 2C), noe som tyder på en potensiell selektiv hemming av NSCLC-tumorer.
(A) Celler ble behandlet med PF -228 og erlotinib i 48 timer og undersøkt med hensyn til cellenes levedyktighet ved hjelp av MTT-analyse. Dataene angir gjennomsnitt ± SEM for cellelevedyktighet presentert som en prosentandel av kontroll DMSO-behandlede celler (100% levedyktighet) fra to uavhengige eksperimenter utført. (B) Fraksjon påvirket /Kombinasjon indeks (CI) plott som viser synergis cytotoksisitet av erlotinib og PF-228. Konfigurasjons 1 anses synergistisk, CIS 1 anses antagonistisk, og CIS = 1 anses additiv. (C) FAK hemming reduserer celleviabilitet i human lunge svulstvev, men ikke normalt lungevev
ex vivo
. Vev fra fem uselekterte pasienter ble behandlet i 48 timer med kjøretøy kontroll (DMSO), erlotinib (10 mm), PF-271 (5 mm), eller en kombinasjon av erlotinib og PF-271. Cellelevedyktigheten ble vurdert for både tumorvev og normalt vev ved alamarBlue fra tre brønner pr tilstand med hver brønn inneholdende tre 2 mm x 1 mm vev stykker. Fluorescens ble normalisert til baseline fluorescens avlesninger for hver brønn tatt før behandling. Eksperimentering ble utført uavhengig av hverandre på hver pasientprøve Mean fluorescens er angitt for hver tilstand som en horisontal linje og statistisk signifikante forskjeller ble bestemt av ANOVA og angitt som
P
verdier over sammenligningen.
for å bestemme om den observerte reduksjon i celleviabilitet korrelert med et økt nivå av apoptose i behandlede celler, vi analyserte SubG1 populasjon av celler etter behandling med enten erlotinib eller PF-228 alene eller i kombinasjon ved hjelp av propidiumjodidfarging av DNA-innhold og strømningscytometri-analyse. I A549-celler, en kombinasjon behandling av erlotinib og PF-228 (5 uM behandling) førte til en statistisk signifikant økning i SubG1 populasjon av celler sammenlignet med kontrollen (~ 6-gangers økning), i tillegg til å utvise en betydelig økning i prosent~~POS=TRUNC av SubG1 celler i forhold til både erlotinib behandling alene (
P
0,001) og PF-228 behandling alene (
P
0,001) (figur 3A).
