Abstract
Withaferin A (WA), en stor bioaktive komponent i indisk urt
Withania somnifera
induserer celledød (apoptose /nekrose) i flere typer kreftceller, men den molekylære mekanismen bak dette cytotoksisitet fortsatt ukjent. Vi rapporterer her at 2 mikrometer WA indusert celledød selektivt i androgen-insensitive PC-3 og DU-145 prostata adenokarcinomceller, mens dens toksisitet var mindre alvorlig i androgen-sensitive LNCaP prostata adenokarcinomceller og normale humane fibroblaster (TIG-1 og KD ). WA drepte også PC-3 celler i spheroid dannende medium. DNA mikromatriseanalyse viste at WA betydelig økt mRNA-nivåene av c-Fos og 11 varmesjokkproteiner (HSP) i PC-3 og DU-145, men ikke i LNCaP og TIG-1. Western-analyse viste økt ekspresjon av c-Fos og redusert ekspresjon av anti-apoptotiske protein C-FLIP (L). Uttrykk av HSP som HSPA6 og Hsp70 ble tydelig forhøyet; imidlertid, fordi siRNA-mediert nedbrytning av HSF-1, et HSP-induserende transkripsjonsfaktor, redusert PC-3-celle-levedyktighet, er det sannsynlig at disse varmesjokk-gener som er involvert i å beskytte mot celledød. Dessuten, WA indusert produksjon av reaktive oksygenarter (ROS) i PC-3 og DU-145, men ikke i normale fibroblaster. Immunocytokjemi og immuno-elektronmikroskopi viste at WA forstyrret vimentin cytoskjelettet, muligens indusere ROS generasjon, c-Fos uttrykk og c-FLIP (L) undertrykkelse. Disse observasjonene tyder på at flere hendelser fulgt av avbrudd i vimentin cytoskjelettet spille sentrale roller i WA-mediert celledød
Citation. Nishikawa Y, Okuzaki D, Fukushima K, Mukai S, Ohno S, Ozaki Y, et al. (2015) Withaferin En induserer celledød Selektivt i androgen uavhengig prostatakreft celler, men ikke i normal fibroblast celler. PLoS ONE 10 (7): e0134137. doi: 10,1371 /journal.pone.0134137
Redaktør: Hiroyasu Nakano, Toho University School of Medicine, JAPAN
mottatt: 13 februar 2015; Godkjent: 06.07.2015; Publisert: 31.07.2015
Copyright: © 2015 Nishikawa et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet: All relevant data er i avisen og dens saksdokumenter filer
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet delvis av Grants-i-aid for Scientific Research S (nr 15101006), Scientific Research B (nr 20370081 og 23370086) og Utforsk Forskning (nr 21651085) for å HN og forskning C (nr 22570185) til NY fra departementet for utdanning, kultur, sport, vitenskap og teknologi i Japan (https://www.mext.go.jp/engelsk /)
konkurrerende interesser:.. forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Withaferin A (WA), en stor bioaktive bestanddelen i ayurvedisk medisinsk plante
Withania somnifera
induserer celledød i mange kreftceller [1-3]. Nærmere bestemt, WA doseavhengig induserer celledød ved apoptose mediert av den ufoldede protein respons (UPR), som utløses ved akkumulering av misfoldede proteiner i det endoplasmatiske retikulum (ER), og det fører også apoptose mediert av reaktive oksygenarter (ROS) i humane nyrekreft (Caki celler) [4], [5]. WA utøver potente antiproliferative effekter ved å hemme HSP90 anstand aktivitet, og dermed indusere nedbrytning av HSP90 klient proteiner i bukspyttkjertelen kreft cellelinjer Panc-1, MiaPaCa2, og BxPc3; denne effekten reverseres ved proteasominhibitor MG132 [6]. WA undertrykker uttrykk for HPV E6 /E7 onkogener, gjenoppretter p53 pathway aktivitet, og induserer apoptose i livmorhalskreft CaSki celler [7]. WA forårsaker cellesyklus-stans i G2 /M fase i prostata cancer-cellelinjer [8], og induserer apoptose i humane melanomceller ved å generere ROS og nedregulere Bcl-2 [9].
WA bindes direkte til vimentin av kovalent modifisering av en cysteinrest (Cys328), forårsaker vimentin filamenter til å aggregere og colocalize med F-aktin og derved forstyrre den vimentin cytoskjelettet [10], [11]. WA-indusert aggregasjon vimentin er ledsaget av endringer i celleform, nedsatt bevegelighet, og forhøyet vimentin fosforylering ved Ser38 [12]. Disse observasjoner tyder på at WA kunne brukes til å målrette metastatiske tumorceller [12], [13]. Selv WA hemmer epiteliale-mesenchymale overgang (EMT) ved å undertrykke vimentin funksjon [14], kan effekten på vimentin alene ikke høyde for alle de WA-mediert subcellulære hendelser som fører til celledød. Faktisk, WA binder også β-tubulin, indusere alvorlig forstyrrelse av normal spindelen morfologi [15], og forstyrrer også den cellulære organisasjon av flere andre mellomliggende filament (IF) nettverk, inkludert peripherin, neurofilament-triplett-protein, og keratin [12]. Derfor, for å fullt ut forstå den molekylære mekanismen for WA-indusert celledød, må vi identifisere ytterligere molekylære mål av WA.
onkogene transkripsjonsfaktor c-Fos regulerer genekspresjon, i forbindelse med jul eller andre grunnleggende leucin glidelås proteiner, som en komponent av aktivator protein 1 (AP-1) dimer kompleks. Selv om c-Fos utøver anti-apoptotiske funksjoner, siste rapportene tyder på at det kan også fremme apoptose [16], [17]. Aktivert c-Fos /AP-1-primer PC-3 og LNCaP prostatakreft (PCA) celler til å gjennomgå apoptose ved direkte binding av promotorområdet av anti-apoptotiske genet c-FLIP (L), for derved å undertrykke dens transkripsjon [18]. Apoptose krever også aktivering av tumor nekrose faktor (TNF) -relaterte apoptose-induserende ligand (TRAIL) /Apo-2L; Dette TRAIL-indusert apoptose er knapt synlig i normale celler [18]
patogenesen av prostatakreft er i utgangspunktet androgen-avhengige.; imidlertid mange pasienter utvikle seg til metastatisk kastrering-resistente (androgen-uavhengig) PCa (mCRPC) [19]. Androgen-uavhengig PCA celler (f.eks PC-3 og DU-145) utstilling stilk-lignende egenskaper, mens androgen-responsive PCA celler (f.eks LNCaP) ikke [20-22]. Annexin A1, et fosfolipid-bindende protein og regulator av glukokortikoid-indusere [23]. NANOGP8, en retrogene som koder for et NANOG1-lignende protein, spiller også en rolle i regulering av stammen lignende PCA-celler [24]. Side-befolknings celler fra menneskelige PCA cellelinjer og xenograft vev gjennomgår mer komplett EMT og er mer aggressive enn homologe bulk-befolknings celler [25]. Dermed ser det EMT å være nært knyttet til utviklingen av mCRPC. Til dags dato har ingen medikamenter er utviklet som effektivt og potent drepe mCRPCs men ikke normale celler.
I denne studien, søkte vi å undersøke om WA kan drepe mCRPCs men ikke normale celler, og hvis så, for å identifisere essensielle molekylære mål av WA. Vi fant at WA (2 uM) selektivt indusert celledød i androgen-uavhengig PC-3 og DU-145 PCA-celler, men ikke i LNCaP-androgen responsiv PCA-celler eller TIG-1 normale fibroblaster. DNA microarray og vestlige analyser avdekket nye molekylære mål av WA som kan definere forskjellige svar på disse cellelinjene til WA. Fordi WA drepte PC-3-celler i sfæroide dannende kulturer, foreslår at WA kan tjene som et startmolekyl for utvikling av legemidler som induserer celledød i kreft stamceller (cscs).
Resultater
TIG-en og LNCaP er mindre følsomme for WA enn PC-3 og DU-145
Vi først fant ut at WA effektivt indusert celledød i PC-3 og DU-145, men LNCaP var mindre følsom til WA behandling (fig 1). For å bestemme hvorvidt normale humane fibroblaster (TIG-1) viser også endret motstand mot WA, sammenlignet vi levedyktigheten til TIG-en utsettes for 2 uM eller 4 uM WA til viabilities av LNCaP, PC-3 og DU-145. Levedyktigheten til PC-3 og DU-145 sank betraktelig 8 timer etter fire mikrometer WA behandling (rosa piler i figur 1A). I motsetning til dette, levedyktigheten av TIG-1 holdt seg høy, på et nivå lik den av LNCaP, opp til 8 timer etter 4 uM WA behandling, når mer enn halvparten av PC-3 og DU-145 hadde dødd (grønne piler i fig 1A ). Celleviabilitet av DU-145 var høyere enn for PC-3 ved 4, 8 og 24 timer.
(A, B) Cellelevedyktigheten ble målt ved 4, 8 og 24 timer etter 2 uM ( A) eller 4 uM (B) WA behandling. NT, ubehandlet. Grønne og blå piler indikerer barer for overlevende celler, mens rosa og røde piler indikerer barer for celler som døde under de samme betingelsene. Gule piler indikerer prøvene brukes til DNA microarray analyse. Barer representerer betyr ± SEM for tre uavhengige eksperimenter. Purple piler indikerer betydelige reduksjoner i celle viabilities (*,
P
0,05; **
P
0,01).
Etter behandling med to uM WA, levedyktigheten av PC-3 ble redusert ved 4, 8 og 24 timer, mens DU-145 ble inviable bare ved 24 timer (røde piler i figur 1B). I motsetning til TIG-1 og LNCaP forble levedyktige ved 24 timer (blå piler på figur 1B). Inkubasjon av disse cellene for lengre perioder vist at TIG-en fortsatt levedyktig selv ved 96 h, mens LNCaP ble inviable på 72 timer (S1 A og S1C Fig), noe som tyder på at to mikrometer WA behandling ikke induserer død TIG-en, men død LNCaP ble bare forsinket. Et annet menneske normal fibroblast linje (KD) viste også motstand mot 2 mikrometer WA behandling (S1B fig). Samlet utgjør disse resultatene tyder på at TIG-en og LNCaP cellene er mer motstandsdyktig mot WA enn PC-3 og DU-145 celler.
Up-regulering av c-Fos etter WA behandling korrelerer med cellenes levedyktighet
for å identifisere gener som var opp- eller nedregulert i disse cellelinjene følgende WA behandling, undersøkte vi de transcriptomes av TIG-en, LNCaP, PC-3 og DU-145 ved hjelp av Agilent SurePrint G3 menneske Mikromatriser. Vi undersøkte mRNA-nivåer for PC-3 og TIG-1 i 4 timer og 24 timer henholdsvis etter 2 uM WA behandling, og for LNCaP og DU-145 ved 4 timer og 8 timer, henholdsvis, etter 4 uM WA behandling (gul pilene i figur 1A og 1B). Fold endringer i genekspresjon ble bestemt ved sammenligning av hybridiserings-signal intensitetene mellom prøvene som er behandlet med WA og de som ble behandlet med dimetylsulfoksyd (løsningsmiddel). S1 Tabell viser en liste over differensielt uttrykte gener, arrangert i synkende rekkefølge ganger endring i PC-3; alle gener oppført var også oppregulert med mer enn fire ganger i DU-145. Scatterplots indikerer at mRNA-nivåene av analyserte genene var høy nok (rå signalintensitet 10). For å tillate fysiologisk betydningsfulle sammenligninger (S2 Fig)
På grunn overekspresjon av c-Fos induserer apoptose i humane kolorektale carcinom-celler [ ,,,0],17], har vi fokusert på c-Fos og FosB gener, som var tydelig oppregulert i PC-3 og DU-145, men var svakt oppregulert i TIG-en og enda mindre i LNCaP (S1 Table, rosa og turkise piler i S2 fig). I PC-3, disse proteinene var signifikant oppregulert ved 4 timer etter fire mikrometer WA behandling etterfulgt av en gradvis økning etterpå (Fig 2A). I DU-145, c-Fos var påfallende oppregulert ved 4 h, men dens uttrykk redusert gradvis etterpå; et lignende mønster ble observert i TIG-1, selv om oppregulering var mindre iøynefallende enn i DU-145 (figur 2A). I LNCaP, var den c-Fos nivå meget lav, og var påvisbar bare ved 24 timer. Spesielt, rangert rekkefølge av cellelevedyktighet (se figur 1A) var identisk med den rekkefølgen av c-Fos ekspresjonsnivået ved 8 timer etter 4 uM WA behandling (LNCaP TIG-1 DU-145 PC-3 ). Dessuten, etter 2 uM WA behandling, et lignende mønster av c-Fos oppregulering ble observert i både PC-3 og DU-145; imidlertid, ble meget lite c-Fos ekspresjon observert i TIG-1 og LNCaP (figur 2B); Slik ble WA-indusert c-Fos uttrykk korrelert med celle levedyktighet. I motsetning FosB og FosB2 var ikke signifikant oppregulert, og deres ekspresjonsnivåer ble ikke korrelert med cellelevedyktighet (figur 2A).
(A, B) Western blot-analyse for å påvise c-Fos (FosB) i TIG-1, LNCaP, DU-145, og PC-3-celler ved 4, 8 og 24 timer etter behandling med 4 um (A) eller 2 uM (B) WA. NT, ubehandlet. (C) Western blot-analyse for å påvise c-Fos, PARP, FLIP og GAPDH i PC-3-celler 12 timer etter 4 uM WA behandling i nærvær (+) eller fravær (-) av tre forskjellige sirnas (X-Z) fra OriGene. (D) Livskraftig av PC-3 celler etter SIFOs behandling. Data er representert som betyr ± SEM av tre uavhengige eksperimenter; rosa piler indikerer en statistisk signifikant reduksjon i celletallet etter SIFOs behandling (**,
P
0,01). (E) Befolkning av apoptotisk, nekrotisk, og levende celler tydelig farget med Annexin V-EnzoGold, 7-AAD-Red, og GFP. Data er representert som betyr ± SEM av tre uavhengige eksperimenter; rød, blå og grønne pilene viser statistisk signifikante endringer (**,
P
0,01). (F) Western blot analyse av c-Fos, PARP, FLIP, og GAPDH i DU-145 på 12 timer etter fire mikrometer WA behandling i nærvær (+) eller fravær (-) av sirnas; SIFOs eller siGL2 (siControl). (G) Livskraftig av DU-145 celler etter eksogene overekspresjon av pcDNA3-FLIP eller vektor alene i nærvær av DMSO (væske) eller 4 mikrometer WA.
siRNA-mediert knockdown av c-Fos ( SIFOs) redder celledød i PC-3 [18]. Derfor, undersøkte vi hvilken type celledød (dvs., apoptose eller nekrose) blir reddet ved SIFOs. For disse eksperimentene, brukte vi siFos_Z (Fig 2C). Først bekreftet vi i PC-3 som levedyktighet signifikant redusert etter 48 timer og 72 timer etter behandling WA (figur 2D). FACS-analyse (S3 figur) viste at frekvensen av nekrose var lavere i SIFOs-behandlede celler enn i celler behandlet med siGL2 (negativ kontroll) 8 timer etter behandling med enten DMSO alene eller WA (2 uM eller 4 uM), noe som tyder på at overekspresjon av c-Fos indusert ved WA spiller en rolle ved indusering av nekrotisk celledød (røde piler i figur 2E-i). I motsetning til dette, under samme betingelser, nedsatt levedyktighet (blå piler i figur 2E-II), og andelen av apoptotiske celler økes (grønne piler i figur 2E-iii og 2E-iv). Således overekspresjon av c-Fos korrelerer med WA-indusert celledød i PC-3. Det gjenstår unnvikende hvis c-Fos er involvert i bestemmelse av cellenes levedyktighet, eller bare omdanner celledød modus fra apoptose til nekrose uten at det påvirker induksjon av celledød. Vi kunne ikke undersøke dette i DU-145 fordi begge siGL2 og SIFOs forårsaket celledød på et tilsvarende nivå.
c-Fos utøver sin proapoptotiske funksjon i PC-3 og LNCaP celler delvis av undertrykke uttrykk for c- FLIP (L), som vi vil referere til som «Flip» heretter [18]. Den FLIP nivået ble redusert etter WA behandling i alle celler som ble testet (fig 2B); reduksjon av FLIP var spesielt bemerkelsesverdig i DU-145, spesielt ved 24 timer etter 2 uM WA behandling (figur 2B, spor 16), sammenlignet med de reduksjoner i TIG-1, LNCaP, og PC-3 (figur 2B, kolonnene 4 , 8 og 12). Denne observasjonen antyder at WA-mediert celledød oppstår delvis på grunn av redusert uttrykk for FLIP. Western blot analyse viste at nivået av FLIP ikke ble redusert med siFos_Z behandling i PC-3 (figur 2C, felt 6), mens siFos_X eller siFos_Y behandling svakt redusert FLIP nivå (figur 2C, baner 4 og 5). I DU-145, ble det FLIP nivå tilsvarende redusert ved behandling med siControl eller siFos_Z (figur 2F, kolonnene 3 og 4). Disse resultater antyder at modulering av c-Fos nivå er noe relatert til, men ikke direkte påvirke det reduserte FLIP-nivå. Likevel, eksogene uttrykk for FLIP i DU-145 reddet WA-indusert celledød (Fig 2G). Samlet utgjør disse resultatene tyder på at WA forårsaket to uavhengige hendelser, nemlig en økning i c-Fos nivå og en reduksjon i FLIP nivå, for å indusere celledød.
Uttrykk av HSP gener er oppregulert etter WA behandling
Deretter la vi merke til at 11 varmesjokk protein (HSP) gener (
HSPA6
,
DNAJA4
,
HMOX1
,
HSPA1B
,
HSPA1L
,
HSPA1A
,
DNAJB1
,
DNAJB4
,
HSPH1
, og
SERPINH1
) var blant de 45 mest up-regulerte gener i PC-3 (S1 tabell). HSP er molekylære anstand som er utsatt for rask og sterk induksjon av stress. I PC-3 og DU-145, HSPA6 ble brått oppregulert 4 timer etter behandling WA, mens det i TIG-1 og LNCaP, nivået av HSPA6 protein var meget lav (figur 3A). I motsetning uttrykk nivåer av DNAJA4 (HSP40 heretter) og HSPA1B (HSP70 heretter) viste tilsvarende gradvis økning i disse cellene (figur 3A).
(A) Western blot analyse for å oppdage HSPA6, HSP40, HSPA70, EGR -1, par-4, og GAPDH (lasting kontroll) i TIG-en, LNCaP, DU-145, og PC-3 celler ved 0, 4, 8 og 24 timer etter fire mikrometer WA behandling. Pil viser bandet for bona fide EGR-en. (B) Influence of siHSPA6 uttrykk på PC-tre cellevekst. (I) Skjematisk for dette eksperimentet. (Ii) Western blot-analyse for å bekrefte knockdown av HSPA6 protein ved siHSPA6, i forhold til celler behandlet med siGL2 (negativ kontroll). (Iii) Innvirkning av siHSPA6 og siGL2 på PC-3 cellevekst, med eller uten WA behandling. Pilen markerer reduksjon i PC-3 cellevekst. (C) Influence of siHSF-1 uttrykk på PC-tre cellevekst. (i) Skjema for dette eksperimentet. (Ii) Western blot-analyse for å bekrefte knockdown av HSP-proteinet ved siHSF-en, i forhold til celler behandlet med siGL2 (negativ kontroll), og for å bestemme hvorvidt HSF-1 knockdown påvirket HSP proteinnivåer ved påvisning av HSPA6, HSP40, HSPA70, og GAPDH i PC-3 celler. (Iii) Innvirkning av siHSF-1 og siGL2 på PC-3 cellevekst, med eller uten WA behandling. Pilen markerer reduksjon i PC-3 cellevekst. Data er representert som betyr ± SEM av tre uavhengige eksperimenter; rosa, grønne og blå piler indikerer signifikant reduksjon i celle viabilities (*,
P
0,05; **
P
0,01).
for å redusere nivået av protein i HSPA6 WA-behandlede celler, utførte vi siRNA-mediert knockdown i PC-3 (figur 3B-i). Vi har bekreftet vellykket knockdown ved western-blotting (fig 3B-ii). Men vi har observert liten endring i celle levedyktighet i siHSPA6-behandlede celler i forhold til celler behandlet med en negativ kontroll RNA (siGL2) (røde piler i figur 3B-iii), noe som tyder på at overekspresjon av HSPA6 er ikke årsaken til celledød etter WA behandling.
Vi utførte neste siRNA-mediert knockdown av varmesjokkfaktor-protein 1 (HSF1), den viktigste transkripsjonsfaktor involvert i opp-regulering av HSF genene [26], ved bruk av en lignende forsøksplanlegging (fig 3C-i). Western-analyse bekreftet at HSF1 knockdown bruker siHSF1 redusert uttrykk for både HSF1 og HSPA6 (figur 3C-ii). I motsetning nivåene av HSP40 og HSP70 var uendret (figur 3C-ii), sannsynligvis på grunn av de høye baseline nivåer av endogen HSP40 og HSP70 (se figur 3A). Ikke desto mindre, behandling av PC-3-celler med siHSF1 øket celledød (grønn og blå piler på figur 3C-iii), men økningen var ikke iøynefallende. Disse resultatene tyder på at ukjente proteiner oppregulert ved HSF1 beskytte PC-3 celler mot celledød.
Fire av tidlig vekstrespons (EGR) gener ble rangert blant de 40 beste WA-indusert gener (S1 Table) . Nivåene av EGR-1 og EGR-3 vært konstant følgende WA behandling (S3 figur); derfor vi ignorert disse proteinene i senere analyser. I motsetning til en tidligere rapport [27], prostata apoptose respons-4 (par-4) var ikke oppregulert etter WA behandling enten på mRNA (grønne pilspisser i S1 figur) eller proteinnivå (S3 fig). Derfor kan disse genene ikke være involvert i å bestemme celleviabilitet (se figur 1).
WA induserer stressrespons initiert på ER og mitokondriene i prostata kreft celler
WA induserer apoptose mediert av ER stress i humane renale karsinomceller [4] og
Xenopus laevis
A6 nyre epitelceller [28]. Gene ontologi analyse av DNA microarray data (S5 Fig) ved hjelp av NextBio system bekreftet at de topprangerte beriket gensettene inneholdt ER stressrelaterte UPR gener (ID, GO: 0006986, S4 fig). For å bestemme hvorvidt ER stress ble indusert i forskjellig grad i TIG-1 og PC-3 etter behandling WA, utførte vi western-analyse ved 2, 4 og 8 timer etter 4 uM WA behandling. I PC-3, ble observert induksjon av CHOP uttrykk og aktivering av caspase 3 og PARP cleavage, noe som antyder at det ER stressrespons via aktivering av CHOP er viktig (figur 4). Men siRNA-mediert knockdown av CHOP tyder på at CHOP ikke spiller en rolle i aktivering av caspase 3 (S6 fig). I motsetning fosforylering av eIF2α på Ser51 var ineffektiv, muligens på grunn av svak aktivering av PERK; følgelig nedstrøms arrangementer som caspase 3-aktivering og PARP cleavage var knapt synlig i TIG-1 (lengst til venstre paneler i figur 4). Denne svake reaksjon på ER stress kan forklare hvorfor TIG-1 er resistent mot WA behandling (se figur 1B). I LNCaP, ble caspase 3-aktivering og PARP cleavage ikke observert på 8 timer; således, i denne cellelinjen ER stress respons ble aktivert ved et nivå som ligger mellom de i TIG-1 og PC-3; motstanden av LNCaP til WA kan skyldes denne forsinkelsen i nedstrøms hendelser. Imidlertid, selv om nivået av CHOP ble indusert etter WA behandling i DU-145, ble litt caspase 3-aktivering og PARP-spaltning observert (lengst til høyre paneler i figur 4). Således kan apoptotisk celledød av DU-145 være primært på grunn av øket c-Fos ekspresjon og redusert FLIP uttrykk i stedet for ER stress respons (se figur 3).
(A) Western blot-analyse for å detektere IRE -1α, ekstra fordel, PS51-eIF2α, CHOP, caspase 3, PARP, BIP og GAPDH (lasting kontroll) i TIG-en, LNCaP, DU-145, og PC-3 celler ved 4, 8 og 24 timer etter fire iM WA behandling. NT: ubehandlet. (B) Skjematisk fremstilling av de analyserte proteiner i apoptotiske reaksjonsvei indusert av ER stress. (C) Typiske fluorescens bilder av TIG-1 (i), LNCaP (ii), PC-3 (iii), og DU-145 (iv) som ble behandlet med 4 uM WA i 24 timer og deretter behandlet med ROS påvisningsreagenser ved hjelp av Image-iT LIVE Grønn ROS Detection Kit. Sammenslåtte Bildene vises i cytoplasma ROS-signaler (grønn) og kjernefysiske DNA-signaler farget med Hoechst33342 (blå). Grønn bar, 100 mikrometer. Svart bar, 10 mikrometer.
Ashwagandha
leaf extract inneholder WA forårsaker brystkreft celler til å generere ROS, som er en stressrespons initiert ved mitokondriene [29]. Vi undersøkte om behandling med WA induserer også ROS generasjon i prostatakreftceller og normale fibroblaster ved en fluorescens sonde metode. Vi først bekreftet deteksjon av ROS signaliserer når cellene ble behandlet med
tert
butyl hydroperoksid (TBHP), en induser av ROS generasjon. Alle testede celler viste cytoplasma signaler (grønn) stammer fra ROS produksjon (S7A fig). Ved behandling med 4 uM WA i 24 timer ble bare et lavt nivå av cytoplasmisk ROS påvist i TIG-1 (figur 4B-i) og KD (S7b figur), som er lik til funn av en tidligere rapport som TIG-3- generere små ROS etter WA behandling [29]. I motsetning til dette var sterke ROS-signaler detektert i LNCaP, PC-3 og DU-145 (figur 4C-ii, iii, iv og-). Disse resultater antyder at TIG-1 og KD, i motsetning til LNCaP, PC-3 og DU-145, ikke generere ROS etter WA behandling, noe som kan forklare hvorfor TIG-1 og KD er motstandsdyktig mot WA.
WA induserer BAG3-mediert autofagi i PC-3 celler
WA induserer autofagi i brystkreftceller, men den detaljerte mekanismen fortsatt ukjent [30]. Våre DNA microarray data (S1 tabell) indikerte at mRNA nivået av BCL-2-forbundet athanogene 3 (BAG3), et medlem av BAG co-anstand familien innblandet i autofagi [31], er oppregulert etter WA behandling. Derfor undersøkte vi om WA indusert autofagi i PC-3 ved å uttrykke EGFP-merket microtubule-assosiert protein lett kjede 3 (LC3), en autofagi markør som spesifikt etiketter autophagosomal membraner [32]. Faktisk EGFP-LC3 puncta dukket opp etter to mikrometer eller 4 mikrometer WA behandling (figur 5A) med en frekvens lik som i serum-sultet celler (figur 5B).
A) Observasjon av EGFP og EGFP-LC3 signaler ved immunfluorescens mikroskopi. Bar, 10 mikrometer. (B) søylediagram som viser prosentandelen av celler inneholdende punktformet EGFP-LC3; Pilene viser at verdiene økes gradvis under de angitte betingelser. Data blir representert som gjennomsnitt ± SEM av tre uavhengige eksperimenter; grønne piler indikerer statistisk signifikant økning (**,
P
0,01). (C) Western blot-analyse for å detektere LC-3 og GAPDH (lasting kontroll) i PC-3 under de angitte betingelser. (D) søylediagram som viser cellelevedyktighet (%) under de angitte forhold. (E) Western blot-analyse for å detektere BAG3, LC-3, og GAPDH (lasting kontroll) i PC-3-celler i nærvær av de angitte betingelsene for siBAG3 eller siGL2 (negativ kontroll). (F) søylediagram som viser cellelevedyktighet (%) ved de angitte forhold. (D, F) Data er representert som gjennomsnitt ± SEM av tre uavhengige eksperimenter; røde piler indikerer statistisk signifikant reduksjon i celle levedyktighet (**,
P
0,01). (A-F) Prøver ble oppsamlet ved 4 timer etter behandling WA. (G) Expression profiler av de Autophagy-relaterte proteiner BAG3 og LC3 i PC-3-celler ved 4, 8 og 24 timer etter behandling med 4 uM WA. NT. Ubehandlet
For å finne ut om WA-mediert autofagi påvirker celle levedyktighet, vi lagt farmakologiske hemmere av klasse III phosphatidylinositol 3-kinaser, 3-metyladenin (3-MA) eller Wortmannin som undertrykker kanoniske autophagy, til PC-3-celler i nærvær (+) eller fravær (-) av 4 uM WA behandling. Western-analyse indikerte at WA indusert LC3 uttrykk er uavhengig av tilstedeværelse av 3-MA eller Wortmannin (figur 5C). Videre undertrykt verken narkotika reduksjonen i celle levedyktighet (figur 5D).
Fordi BAG3 aktiverer noncanonical autofagi utløst av proteasomhemmere som MG132 [33] undersøkte vi om siRNA-mediert knockdown av BAG3 vil påvirke PC- 3 celle levedyktighet. siBAG3 hell trykt BAG3 uttrykk i forhold til siGL2, en negativ kontroll (øvre delen av figur 5E). Som ventet ble LC3 uttrykk trykt av siBAG3 etter enten behandling med DMSO, 2 mM MG132, 20 mikrometer MG132, eller 4 mikrometer WA (midten panel av figur 5E). Dessuten ble cellelevedyktigheten reduseres ved siBAG3 følgende WA behandling (figur 5F), sannsynligvis på grunn av hemming av den anti-apoptotiske aktivitet av BAG3. Tatt sammen tyder disse resultater på at WA-indusert BAG3 medierer noncanonical autophagy, som beskytter PC-3-celler mot celledød.
Western blot-analyse viste at intensiteten av ~ 70 kDa bånd av BAG3 (pilen i fig 5G) ble redusert i TIG-1 ved 24 timer etter WA behandling (figur 5G, spor 4), mens nivået var allerede høy (kolonnene 9 og 13) og uforandret etter WA behandling i PC-3 (kolonnene 10-12), og DU-145 (spor 14-16). Videre ~ 62 kDa bånd av BAG3 (en antatt bearbeidet form av BAG3) ble tydelig økt i PC-3 og DU-145 (pilspiss i figur 5G); det fortsatt ukjent om 62 kDa BAG3 er mer aktive enn 70 kDa BAG3 eller er inaktiv. Disse resultatene indikerer at det BAG3 proteinnivå er høyere i PC-3 og DU-145 enn i TIG-1 og LNCaP. Likevel var det LC3 nivået lavt i PC-3 og DU-145 (midterste panelene i figur 5G), noe som tyder på at en reguleringsmekanisme knytte BAG3 aktivitet og LC3-II produksjonen ble endret i disse cellene. Faktisk en fersk rapport viste at DU-145 ikke kan produsere LC3-II på grunn av en genetisk svekkelse av autofagi vei [34]. I motsetning LC3 uttrykk var høy i TIG-en og LNCaP (midtre paneler i Fig 5G). Det gjenstår å bli analysert hvis disse resultatene tyder på at disse celler er en eller annen måte beskyttes mot WA-indusert celledød lignende til beskyttelse av Caco-2 celler fra oxaliplatin-indusert celledød [35].
TIG-1 og PC-3 utviser tydelige mønstre av subcellulære vimentin lokalisering følgende WA behandling
WA forbinder med vimentin og forårsaker rask omlegging av vimentin intermediate filamenter (VIF) i perinukleære aggregater i BJ-5ta humane fibroblaster [12]. Selv mRNA nivåer av vimentin var høy og uendret etter WA behandling i TIG-en, LNCaP, PC-3 og DU-145 (svarte piler i S1 figur), western analyse indikerte at vimentin protein nivåer ble forhøyet etter WA behandling i PC- 3 (figur 6A). Derimot, var vimentin nivå allerede høyt før WA behandling, og holdt seg høy, i DU-145 (figur 6A). I TIG-en ble vimentin nivået reduseres, med cleavage produkter av vimentin [10] tydelig på 24 timer (pilspisser figur 6A), mens ingen vimentin bandet ble påvist i LNCaP (Fig 6A). Disse observasjonene stemmer overens med det faktum at PC-3, men ikke LNCaP, gjennomgikk EMT for å erverve vimentin uttrykk.
(A) Western blot-analyse for å detektere vimentin og aktin i TIG-1, LNCaP, PC- 3 og DU-145 ved 4, 8 og 24 timer etter behandling med 2 uM eller 4 uM WA. NT: ubehandlet. (B) Typiske bilder av TIG-en (i) og PC-3 (ii) farget med anti-vimentin-antistoff, phalloidin (for F-aktin) og Hoechst 33342 (for DNA) ved 2, 4 og 6 (h ) etter WA behandling. NT: ubehandlet. Rosa og gule piler indikert colocalized vimentin og F-aktin aggregater. Sammenslåtte Bildene vises i den nederste raden. Bar, 10 mikrometer. (C) Prosent av alle observerte celler som inneholder punkter for akkumulert eller ikke-aggregerte vimentin er vist for TIG-en (i) og PC-3 (ii). Celler som over 10 vimentin aggregater ble scoret som «aggregeres», mens celler med ikke-aggregert vimentin ble scoret som «ikke-aggregert». Data er representert som betyr ± SEM av tre uavhengige eksperimenter; stjernene indikerer statistisk signifikante endringer i celle levedyktighet (**,
P
0,01; ***,
P
0,001). (D) Jasplakinoloide (JSP) ikke påvirke PC-tre celle levedyktighet. (I) Skjematisk av eksperimentell design. (Ii) søylediagram som viser cellelevedyktighet (%) i nærvær (+) eller fravær (-) av 4 uM WA eller Jasp 8 timer etter tilsetning av WA. NT: ubehandlet. Søylediagrammer representerer betyr ± SEM for tre uavhengige eksperimenter. Rosa, blå og grønne pilene viser statistisk signifikant reduksjon i celle levedyktighet (*,
P
0,05; **
P
0,01).
immunofarging ved 2, 4 og 8 timer etter 4 uM WA behandling forårsaket vimentin aggregering rundt plasmamembranen i TIG-1 (rosa piler, figur 6B-i). I motsetning til dette, PC-3 viste en homogen fordeling av vimentin, med ingen slike aggregater (figur 6B-i og 6B-ii); Dette tyder på at vimentin uttrykte etter EMT i PC-3 serverer en annen funksjon enn det gjør i mesenkymale celler. Spesielt, det cytoplasmatiske volumet av PC-3 var mindre enn den for TIG-1. Prosentdelen av celler som disse aggregater økes tydelig ved TIG-1 (figur 6C-i) i forhold til PC-3 (figur 6C-ii).
Immuno-elektronmikroskopi avslørte vimentin signaler ved IFS i cytoplasma i fravær av WA behandling (S8A figur), bekrefter mesenchymale opprinnelse TIG-en. Spesielt mange vimentin signaler forskjøvet til den perifere området av cytoplasma nær plasmamembranen, i et mønster som reflekteres nærværet av de nevnte vimentin aggregater (se figur 6B-i), etter 4 timer av 4 uM WA behandling (S8B fig) . I motsetning til dette ble bare spredte vimentin signaler ble observert i PC-3 i fravær av WA behandling (fig S8C);
