Abstract
onkogene signal fremmer tumorinvasjon og metastase, delvis ved å øke uttrykket av tre- og fire-forgrenede N-glykaner. De forgrenede N-glykaner bindes til galectins danner en flerverdig gitter som forbedrer celleoverflate-residens av vekstfaktorreseptorer, og fokal adhesjon omsetning. N-acetylglucosaminyltransferase I (MGAT1), den første forgrening enzym i reaksjonsveien, er nødvendig for tilsetningen av alle etterfølgende grener. Her har vi innført MGAT1 shRNA inn i humane HeLa cervical og PC-3-Yellow prostata tumorcellelinjer, generering av cellelinjer med redusert transkript, enzymaktivitet og forgrenede N-glykaner på celleoverflaten. MGAT1 knockdown hemmet HeLa celle migrasjon og invasjon, men endret ikke celleproliferasjon priser. Swainsonine, en inhibitor av α-mannosidase II umiddelbart nedstrøms for MGAT1, også inhiberte celle invasjon og er ikke adderes med MGAT1 shRNA, i samsvar med en felles virkningsmekanisme. Focal heft og fila organisasjon i MGAT1 knockdown celler indikerer også en mindre bevegelige fenotype.
In vivo
, MGAT1 knockdown i PC-3-Yellow orthotopic prostatakreft xenograft modell betydelig redusert primær tumorvekst og forekomsten av lungemetastaser. Våre resultater viser at blokkering MGAT1 er et potensielt mål for anti-kreft terapi
Citation. Beheshti Zavareh R, Sukhai MA, Hurren R, Gronda M, Wang X, Simpson CD, et al. (2012) Suppression of Cancer Progresjon av MGAT1 shRNA knockdown. PLoS ONE 7 (9): e43721. doi: 10,1371 /journal.pone.0043721
Redaktør: Ming Tat Ling, Queensland University of Technology, Australia
mottatt: 4 mai 2012; Godkjent: 23 juli 2012; Publisert: 05.09.2012
Copyright: © Beheshti Zavareh et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Forsknings var støttet med tilskudd fra den kanadiske Institutes of Health Research (CIHR) (MOP-62975) og Canada Research Chair (CRC) (950-202079) til JWD og kanadiske Institutes of Health Research (CIHR) til ADS, som er en CIHR Lege forsker og en leukemi og lymfom Society Scholar i klinisk forskning. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Metastatisk kreft generelt har en dårlig prognose, og viser begrensede respons på kjemoterapi og nyere målrettet terapi [1]. Den redundans i vekst reseptorer og signalering bidrar til invasjonen og narkotika motstand, et problem som kan løses ved å vurdere flere nivåer med tilbakemeldinger regulering. I denne forbindelse, reseptorer er N-glykosylert i ER og N-glykaner ombygd i Golgi på veien til cellene overflaten [2]. Onkogen transformasjon øker Ets-drevet transkripsjon av N-acetylglucosaminyltransferase V kodet av Mgat5, en medial Golgi enzym som initierer β1,6GlcNAc antennen i tri- og tetra-forgrenede N-glykaner [3] – [5]. Over-ekspresjon av Mgat5 i immortaliserte epitelceller har vist seg å slappe av vekstkontroll og markeds tumorogenesis når cellene blir injisert i mus [6]. Den onkogene indusert uttrykk for Mgat5 og dens β1,6GlcNAc tre- og fire-forgrenede N-glykaner produkter korrelerer med fjernmetastaser og redusert overlevelse i menneskelige mammary og tykktarm kreft [7], [8]. I mus, er tumorprogresjon forsinket i den polyoma-virus midten T transgen (PyMT) og PTEN
+/- modeller av kreft på et Mgat5 mangelfull bakgrunn [9], [10]. Dessuten hemmer Golgi α-mannosidase II-inhibitor swainsonine tumorcellemetastase hos mus, og ble testet med lovende resultater i kliniske forsøk [11], [12].
Galectins binder seg til de N-glykaner på reseptorer og oppløste transportører med slektskap proporsjonale med forgrening og antall N-glykaner (NXS /t feste nettsteder) [13], [14]. Galectin-3 har blitt vist å kryssbinde glykoprotein-reseptorer på celleoverflaten, danner en dynamisk gitter som bremser kjøring av inn belegges-gropen endosomer og caveolin-en lipid flåter, og dermed fremme overflate bosted og følsomhet for ligander [14], [15 ]. Gitteret er heterogen og har vist seg å regulere overflate retensjon av EGF, TGF-β og VEGF-reseptorer [14], [16], så vel som glut-2, -4 glukosetransportører og TRPV5 Ca
++ kanal [13 ], [17], [18] (figur 1). Forgrenede N-glykaner også forbedre omsetning på undergrunnen og cellesammenvoksninger, støtter epiteliale-mesenchymale overgang (EMT) i kreftceller [19], [20]. Videre Mgat5 transgene uttrykk i mus huden fremmer EMT-lignende fenotype og sårtilheling [21]. Mgat5
– /- PyMT-mammary tumorceller i kultur viser redusert overflate bosted av cytokin reseptorer, som kan bli reddet av (i) Mgat5 re-uttrykk, (ii) hemme konstituerende endocytose, (iii) utarming av caveolin-en og (iv) ved å GlcNAc tilskudd til UDP-GlcNAc den felles donor for de MGAT enzymene [13], [14]. GlcNAc tilskudd i Mgat5
– /- celler som øker innholdet av bi- og tri-antennary N-glykaner, som redder affiniteter for galectin-3 uten Mgat5 produkt [13]. Dette tyder på redundans i N-glykan strukturer og profiler som kan støtte den ondartede fenotype.
Oligosaccharyltransferase (OST) erstatter NXS /T områder av proteiner i grove endoplasmatiske retikulum (RER), overføre ferdig montert glykan fra GLC
3Man
9GlcNAc
2-pp-dolichol til Asn. Glykoproteiner trafikk til Golgi, hvor de N-glykaner blir omformet, og de konstruktive detaljer er avhengig av enzym ekspresjon og UDP-GlcNAc forsyning. Forgreningsenzymer Mgat1, Mgat2, Mgat4, og Mgat5 forskjellig Km-verdier for UDP-GlcNAc «D» og for glykoprotein-akseptor «A». Den veien har utviklet seg for veien ultrasensitivity til UDP-GlcNAc. De epitoper er gjennomført i den trans-Golgi (liten boks) hvor effektiv substitusjon med Gal genererer LacNAc epitop, og kan forlenges med poly-LacNAc. Ytterligere forlengelse med galaktose genererer epitoper til galectin-binding, med effekter på reseptor-dynamikk, interaksjoner og handel.
Mgat1 katalyserer tilsetningen av den første gren, og produktet er nødvendig for virkningen av α-mannosidase II og Mgat2, og deretter Mgat4 og Mgat5 i et katalytisk reaksjonsvei bestilte [2] (figur 1). Lav Mgat1 aktivitet begrenser produksjonen av tri- og tetra forgrenet end produkter, men høye nivåer kan også gjøre det samme ved å frata UDP-GlcNAc forsyning til Mgat4 og Mgat5 enzym senere i veien. Faktisk, enzymer MGAT skjerm avtagende affinitet for UDP-GlcNAc, noe som resulterer i pathway ultrasensitivity, med en karakteristisk sigmoidal produksjon av Mgat5 produkter som reaksjon på denne delte metabolitt [13]. De hexosamin pathway substrater skjærer med basalstoffskifte som er kjent for å gjennomgå omfattende forandring i kreftceller [22]. UDP-GlcNAc syntese av hexosamin-reaksjonsveien er avhengig av glukose, glutamin, og acetyl-CoA tilførsel til hexosamin-reaksjonsveien, så vel som GlcNAc berging. GlcNAc og GlcNAc-p kan løftes ved et mellomliggende stadium i sykdomsprogresjon [23], og kan spille en rolle i å fremme tumorprogresjon [24]. Derfor hemme forgrening tidlig i veien kan være en levedyktig strategi for å unngå metabolske kompensasjon.
For å begynne å utforske den rollen MGAT1, vi genererte humane tumorcellelinjer stabilt uttrykker MGAT1 shRNA, og oppnådde ~70% undertrykkelse av forgrenet
N
-glycans og invasive fenotype, uten å endre proliferasjon og levedyktighet i cellekultur. MGAT1 knockdown redusert vekst og metastasering av menneskelige prostata kreft celler i en xenograft orthotopic musemodell. Selv MGAT1 er nødvendig for mus utvikling utover dagen E9.5 [25], [26], tyder våre resultater at delvis systemisk utarming av MGAT1 hos voksne kan være utholdelig og har viktige anti-kreft effekt.
Materialer og metoder
Cell kultur
HeLa menneskelige livmorhalskreftceller (kjøpt fra ATCC) ble opprettholdt i Dulbeccos modifiserte Eagle Medium (DMEM). PC-3-celler (Gul et høyt metastatisk klon av PC-3 human prostatacancer cellelinje som stabilt uttrykker rød fluorescerende protein (RFP) og grønt fluorescerende protein (GFP) som var en gave fra G. Glinsky, Ordway Research Institute, [27 ]) ble holdt i RPMI 1640. Alle celler ble supplert med 10% føtalt bovint serum (FBS) (Hyclone, Logan, UT), antibiotika, dyrkes i et standard fuktet inkubator ved 37 ° C i en 5% CO
2 atmosfære.
L-PHA-binding til celleoverflate-glykaner
cellene ble sådd ut i 96-brønners plater på 500 celler per brønn. Etter at man følger over natten, ble cellene fiksert med 3,7% formaldehyd og vasket. Surface tri- og tetra forgrenet
N
-glycans ble farget med L-PHA (20 mg /ml) konjugert til Alexa Fluor 488 eller Alexa Fluor 647 og kjerner ble farget med 5 ng /ml 4 «, 6-diamidino-to-phenylindole, dilactate (DAPI, dilactate) (Molecular Probes, Eugene, OR, USA). Den totale intensiteten av L-PHA flekker på hver celle ble kvantifisert ved hjelp Cellomics ArrayScan II (Cellomics, Pittsburgh, PA) [13].
MGAT1 stanse ved lentiviral levert RNA interferens
Bygging av hårnål-pLKO.1 vektorer (som bærer en puromycin antibiotisk resistensgen) inneholdende kort hårnål RNA (shRNA) sekvenser og produksjon av shRNA virus har blitt beskrevet i detalj [28]. De shRNAs rettet mot MGAT1 sekvensene er som følger:
MGAT1
-sh1 (NM_002406), 5′-CCCTGAGATCTCAAGAACGAT-3 «; og
MGAT1
-sh2 (NM_002406), 5′-GCACCTCAAGTTTATCAAGCT-3 «. Kontroll shRNA-kodende sekvenser er som følger: RFP, 5»-CTACAAGACCGACATCAAGCT-3 «og LacZ, 5′-CCGTCATAGCGATAACGAGTT-3». Lentivirale infeksjoner ble utført i det vesentlige som tidligere beskrevet [28]. I korthet, adherente celler ble behandlet med 0,5 ml av viruset, etterfulgt av inkubering over natten (37 ° C, 5% CO
2) uten å fjerne viruset. Neste dag, viral medium ble erstattet med friskt medium som inneholdt puromycin (1 mg /ml) for å velge en populasjon av resistente celler.
Reverse-transkriptase real-time PCR
Første cDNA ble syntetisert fra 1 pg DNase-behandlede total cellulær RNA ved hjelp av tilfeldige primere og Superscript II revers transkriptase (Invitrogen) i følge produsentens protokoll. Real-Time PCR-analyser ble utført i tre eksemplarer med 5 ng av RNA tilsvarende cDNA, SYBR Grønn PCR Master Mix (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA), og 400 nM av gen-spesifikke primere. Reaksjonene ble behandlet og analysert på en ABI 7900 Sequence Detection System (Applied Biosystems). Forover /bakover PCR primerpar for menneskelig cDNA var som følger: human GlcNAc-TI: Spiss 5’CGGAGCAGGCCAAGTTC-3 «, Omvendt 5’CCTTGCCCGCAGTCCTA-3», 18S: Spiss 5’AGG AAT TGA CGG AAG GGC Ac- 3 «, Omvendt 5′-GGA CAT CTA AGG GCA TCA CA-3». Relative mRNA-ekspresjon ble bestemt ved anvendelse av metoden som er beskrevet ΔΔCT.
GlcNAc-transferase aktivitet
Enzymaktiviteten av MGAT1was målt ved bruk av en syntetisk reseptorer som tidligere beskrevet [29]. Kort sagt ble cellelysater inkubert med MGAT1 akseptor Manα (1,3) [Manα (1,6)] Glcβ1-O- (CH
2)
7CH
3 (Toronto Research Chemicals, Toronto, ON ), i en løsning inneholdende 0,5 mM UDP- [
3 H 6] GlcNAc (44 400 dpm /nmol), 125 mM MES (pH 6,5), 50 mM GlcNAc, 1 mM UDP-GlcNAc, 0,8 mM AMP og 10 mM MnCl2 . Etter inkubering, ble reaksjonen stoppet ved tilsetning av iskald H
2O. Overføring av [
3 H 6] GlcNAc til akseptor ble kvantifisert ved væskescintillasjonstelling.
migrering og invasjon assays
bølgen og migreringsforsøk i HeLa-celler ble utført som tidligere beskrevet [30 ]. Kort oppsummering HeLa-celler (2 × 10
5) ble høstet og sådd i ubestrøket invasjons kamre for migrasjon analysen eller i BioCoat Matrigel invasjonen Chambers (BD Biosciences, Mississauga, ON) for invasjon analyser. For både migrering og invasjon analyser, vekstmedium inneholdende 10% FBS ble anvendt som en kjemoattraktant i den nedre brønnen. Etter 48 timers inkubering, celler som hadde migrert eller invadert den nedre overflate av membranen ble farget med Diff-Quik Stain (BD Biosciences). Antallet trekkende eller invaderende celler ble fotografert og telles ved hjelp av Aperio ScanScope CS hele lysbilde Scanner (AperioTechnologies, Vista, CA) og Image-Pro Plus-programvare (versjon 4.5; Media Kybernetikk Inc., Silver, MD). For å teste effekten av samtidig MGAT1 hemming og swainsonine behandling, ble HeLa-celler behandlet med 2 mikrometer swainsonine i 72 timer før migrasjon og invasjon analyse som beskrevet ovenfor.
For å vurdere invasjon og migrasjon i PC- 3-Yellow-celler, celler ble serum fratatt over natten og podet i det øvre kammer av 16-brønns CIM-plate (Roche Applied Sciences) for migrasjon analyser eller Matrigel (BD Biosciences, Mississauga, ON) belagte plate for invasjon analyser. Det nedre kammer inneholdende 20% FBS som chemo-lokkemiddel, og platene ble plassert i den Roche xCELLigence Real-Time Analyzer Cell (RTCA) DP plattformen (Roche Applied Sciences). Sanntidsmålinger ble gjort hvert femte minutt i 36 timer. Den RTCA Analyzer måler elektrisk motstand av celler som beveger seg til nedre overflate av membranen, og sammenligner godt med den celle-tellemetoden ovenfor.
Immunocytochemistry
Cellene ble sådd ut på fibronektin-belagte dekkglass (Sigma-Aldrich, Oakville, ON). Etter at man følger over natten, ble cellene fiksert med 2% paraformaldehyd i 10 minutter, etterfulgt av permeabiliseringen anvendelse av 0,2% Triton-X-100. Etter blokkering med 5% BSA i 1 time, ble celler inkubert over natten ved 4 ° C med mus anti-integrin β1 (1:200, Millipore) eller anti-fosfo-paxillin (pY31) antistoff (1:400, Epitomics). Dekkglass ble vasket med PBS og deretter inkubert med esel-anti-muse-IgG-Cy3 konjugert sekundært antistoff (1:200, Millipore) for β1 integrin eller anti-kanin-IgG-FITC-konjugert antistoff (1:500, Millipore) for paxillin. Farging for aktin ble gjort av phalloidin konjugert til tetramethylrhodamine B isotiocyanat (TRITC, Sigma-Aldrich) i 10 minutter. Etter vask med PBS, ble dekkglass montert på lysbilder ved hjelp av fluorescerende montering medium og avbildes med 40 × linsen på Zeiss LSM700 konfokal mikroskop (Carl Zeiss MicroImaging GmbH, Jena, Tyskland).
In vivo modell av prostata kreft metastase
Distant tumordannelse ble evaluert
in vivo
som tidligere beskrevet [31]. Kort, PC-3-Gul-celler som stabilt uttrykker RFP med og uten MGAT1 knockdown, ble injisert orthotopically inn i prostata av sublethally bestrålt (3,5 Gy) SCID mus. Mus injisert med tumorceller ble opprettholdt i 4 uker etter injeksjon, og ved denne tid ble dyrene avlivet via cervikal dislokasjon for fullstendig undersøkelse. Røde fluorescerende svulster ble oppdaget via hele kroppen bildebehandling og hele organet bildebehandling ved hjelp av en Leica MZ FLIII fluorescerende stereomikroskop med en 100 W kvikksølvlampe, en 560/40 eksitasjonsfilteret, og en 610 lang pasning utslipp filter. Bilder ble ervervet ved hjelp av en Olympus DP70 digitalt kamera med 0,8 x forstørrelse og analysert ved hjelp av Image Pro Plus 6.0 (Medie kybernetikk). En enkelt, felles terskel ble brukt for å identifisere og måle fluorescens i hvert organ som antallet fluorescerende flekker per lunge lapp. Musene ble hentet fra en in-house avlsprogram og holder til i laminær-flow bur stativer under standardiserte miljøforhold med
ad libitum
tilgang til mat og vann. Alle forsøkene ble godkjent av den lokale institusjonelle etikk Review Board (University Health Network-Ontario Cancer Institute Animal Care og bruk komité) og ble utført i henhold til bestemmelsene i den kanadiske Council on Animal Care. Alle forsøk ble gjennomført for å redusere lidelse.
Diskusjon
Resultater og MGAT1 shRNAi reduserer N-glykan forgrening, cellemigrasjon og invasjon
For å vurdere cellestyrte effekter av MGAT1 uttømming på ondartet cellevekst og invasjon, ble HeLa menneskelige livmorhalskreftceller infisert med lentivirus shRNA vektorer rettet mot MGAT1 eller kontrollsekvenser, og stabile cellepopulasjoner ble valgt med puromycin. Target knockdown ved hjelp av to uavhengige shRNA sekvenser ble bekreftet ved QRT-PCR (figur 2A). shRNA1 og shRNA2 reduseres også MGAT1 enzymatisk aktivitet og redusert L-PHA celleoverflatefarging i forhold til nedbryting av mRNA og enzymaktivitet (figur 2B, C). L-PHA binder seg til produkter ned-stream av MGAT1, den β1,6GlcNAc tri- og tetra forgrenet N-glykaner [32]. MGAT1 knockdown ikke forandre cellenes levedyktighet eller proliferasjon (figur 2D og data ikke vist).
A) HeLa-celler ble infisert med lentivirale vektorer som målretter MGAT1 (shRNA1 eller shRNA2) eller kontrollsekvenser shRNA. Stabile cellepopulasjoner ble selektert ved tilsetning av puromycin (1 pg /ml). A) MGAT1 mRNA ble målt ved QRT-PCR, B) MGAT1 enzymaktivitet, C) L-PHA reaktive overflate N-glykaner med Array skanning mikroskop, D) Formerinasanalyse over 4 dager Data representerer gjennomsnittet ± SD relative ekspresjon av mRNA i forhold til kontrollsekvens (n = 3 uavhengige eksperimenter utført i tre eksemplarer).
for å evaluere effekten av MGAT1 shRNA2 knockdown på HeLa celle migrasjon og invasjon, ble cellene sådd inn i kammer på porøse filtre i serumfritt medium, og 10% FBS ble plassert i det nedre kammer som en chemo-lokkemiddel. Cellemigrering inn i bunnkammeret ble målt 48 timer senere. Lignende studier ble utført ved bruk av Matrigel-belagte filtre for å måle celle invasjon skjønt en barriere. Knockdown av MGAT1 redusert cellemigrering og invasjon, i forhold til MGAT1 uttømming (figur 3A, 3B). Blokkerer banen ett skritt nedstrøms MGAT1, ved α-mannosidase II, ved hjelp swainsonine også hemmet invasjon som tidligere rapportert [33], [34]. Swainsonine behandling alene hemmet migrasjon og invasjon, men i mindre grad enn shRNA2. Dette kan være på grunn av paralog α-mannosidase IIx, som er mindre følsom for swainsonine. Viktigere, swainsonine hadde ingen ytterligere effekter i MGAT1 shRNA2 celler, noe som tyder på at optimal undertrykkelse av migrasjon og invasjon ved å målrette den forgrening veien er observert med ~70% reduksjon av MGAT1 (figur 3C, 3D).
A) HeLa cellene ble sådd ut i kammer med 8-um porer og 10% FBS ble anvendt som et kjemotiltrekkende. B) HeLa-celler ble sådd ut i invasjons kamre med Matrigel. Etter 48 timer ble celler som hadde migrert gjennom porene fiksert, farget og tellet automatisk. C) migrasjon og D) invasjons analyser med eller uten forhåndsbehandling i 72 timer med 2 uM swainsonine (SW) i 72 timer før. Gjennomsnittlig antall migrerte celler ± SD av 3 uavhengige eksperimenter utført i triplikat ble fremstilt grafisk. (E) Cell morfologi ved farging med fosfor-paxillin og TRITC-konjugert phalloidin for F-aktin, vist som en sammenslåtte bildet.
Cell migrasjon priser er delvis avhengig α5β1 inte reseptor kontakt med underlaget fibronektin , som stimulerer fokale sammenvoksn signalanlegg, omsetning og fremdrift [35]. De forgrenede N-glykaner produkter av MGAT5 er tilstede på α5β1, blant andre reseptorer og celleoverflateproteiner, og har vist seg å fremme α5β1 aktivering, signalisering, og tumorcellevandring [19]. Integrin-aktivering resulterer i fosforylering av paxillin av FAK og Src, som fører til F-aktin remodellering og cellemotilitet [36]. I HeLa celler med MGAT1 knockdown, F-aktin stress-fibre var mindre i diameter, mindre konvergent på celle anslag, og en tendens til å omskrive cellen (Figur 3E). Farging av p-paxillin avdekket mindre og mer klynger på kanten av cellulære anslag. I motsetning til kontroll HeLa-celler hadde fremtredende og lange spennings fibre som stikker inn pseudopodia slutter med større phospho-paxillin flekker fokale sammenvoksninger, karakteristisk for en mer bevegelige fenotype enn MGAT1 knockdown cellene.
MGAT1 knockdown reduserer tumorvekst og metastaser
in vivo
for å vurdere virkningene av MGAT1 knockdown i en dyremodell for kreft metastase, brukte vi de menneskelige PC-3-Yellow prostatakreftceller, et veletablert xenograft modell. PC-3-Yellow-celler ble infisert med lentivirus inneholder MGAT1 shRNA2 eller kontrollsekvenser, og stabile cellepopulasjoner ble valgt som ovenfor. MGAT1 mRNA, enzymatisk aktivitet, og celleoverflaten forgrening ble alle oppbrukt av ~70% (Figur 4A-C). MGAT1 knockdown redusert både cellemigrering og celle invasjon i en in vitro- og in vivo-modellen (figur 4D, E). MGAT1 knockdown endret ikke vekst og levedyktighet av PC-3-Yellow-celler (data ikke vist). Dermed blir
in vitro
fenotyper var bemerkelsesverdig lik effekten av MGAT1 knockdown i HeLa-celler. For å vurdere virkningene av MGAT1 knockdown på tumormetastase, kontroll eller MGAT1 knockdown PC-3-Yellow prostatakreftceller ble injisert orthotopically i prostata kjertler i under lethally bestrålt SCID mus (n = 15 per gruppe). Fire uker etter injeksjon ble musene avlivet og fjernt tumordannelse i organene ble fotografert ved fluorescerende mikroskopi. Svulster utviklet i prostata i alle mus injisert med MGAT1 knockdown og kontroll RFP-merkede PC-3-Gul celler. I mus injisert med kontrollceller, ble tumordannelse detektert ved klinisk relevante områder av metastaser, inkludert lunge-, lymfeknuter og leveren. Imidlertid tumorer volum ble redusert og færre fjernere lungemetastaser ble observert i mus injisert med MGAT1 knockdown-celler (figur 4F, G). Totalt sett mer av musene i MGAT1 knockdown gruppen var fri for metastaser. Dermed tas sammen, hemmer MGAT1 knockdown fjernt svulstdannelse
in vivo
.
PC-3-Gul celler med MGAT1-shRNA2 eller kontroll shRNA sekvenser ble vurdert for A) MGAT1 mRNA nivåer av QRT-PCR. B) MGAT1 enzymaktivitet, C) L-PHA reaktiv overflate N-glykaner av Arrayscan mikroskop, D) invasjon gjennom en Matrigel barriere og migrasjon (E) ved hjelp av xCELLigence Real-Time Cell Analyzer. Data representerer gjennomsnittlig ± SD celleindeks (3 uavhengige eksperimenter med quadruplicates). (F) Tumor størrelse og (G) metastaser hos mus injisert med PC-3-Yellow celler med MGAT1-shRNA2 eller kontroll shRNA sekvenser. Musene ble injisert orthotopically, med 0,5 x 10
6 celler per mus, inn i prostata av sub-letalt bestrålte SCID-mus. Fire uker etter injeksjon ble musene avlivet, og deres organer ble fotografert ved hjelp av et fluorescerende mikroskop. Antallet metastatiske knuter i alle fem lapper i lungene ble kvantifisert ved hjelp av bildeanalyse programvare. Hvert punkt representerer en mus.
I sammendraget, ~70% MGAT1 knockdown undertrykke N-glykan forgrening og invasiv fenotype i HeLa og PC-3-Yellow celler. Viktigere, redusert MGAT1 knockdown vekst og metastasering av PC-3-Yellow celler i en orthotopic prostatakreft xenograft modell. Hver av de N-glykan grener er en epitop for galectins, og kumulativt de kan støtte veksten signalering på celleoverflaten. Kompensasjon og redning av galectin gitter av epitop overføring mellom grenene har blitt observert i Mgat5
– /- kreftceller [13] og i Mgat4
– /- mus vev [37]. Onkogene signalisering i kreftceller opp-regulerer transkripsjon og aktivitetene til MGAT4 og Mgat5 [4], [5], [38] samt hexosamin pathway mellomprodukter [23], men rettet mot MGAT1 unngår disse mekanismene for redning. Derfor kan MGAT1 være nyttig mål i kreftbehandling for å blokkere metastase så vel som tumorvekst.
