Abstract
L-karnitin (LC) er generelt antatt å transportere langkjedede acylgrupper fra fettsyrer i den mitokondrielle matriks for ATP produksjon
via
sitronsyresyklusen. Basert på Warburg teori om at de fleste kreftceller i hovedsak avhengig av glykolyse for ATP generasjon, hypotese vi at LC behandling ville føre til forstyrrelse av cellenes stoffskifte og cytotoksisitet i kreftceller. I denne studien human hepatoma HepG2, SMMC-7721 cellelinjer, primære dyrkede thymocytter og mus som bærer HepG2 tumor ble anvendt. ATP-innholdet ble detektert ved HPLC-analyse. Cellesyklus, celledød og cellelevedyktigheten ble analysert ved strømningscytometri og MTS respektivt. Gene, mRNA uttrykk og proteinnivå ble oppdaget av genet microarray, Real-time PCR og Western blot hhv. HDAC-aktiviteter og histon-acetylering ble detektert både i prøverør og i dyrkede celler. En molekylær docking studie ble utført med CDOCKER protokoll fra Discovery Studio 2.0 for å forutsi molekyl samspillet mellom L-karnitin og HDAC. Her har vi funnet at (1) LC behandling selektivt hemmet veksten av kreft celler
in vivo Hotell og
in vitro
; (2) LC behandling selektivt induserer ekspresjon av p21
cip1 genet, mRNA og protein i kreftcellene, men ikke p27
kip1; (4) LC øker histon acetylering og induserer akkumulering av acetylerte histoner både hos normale thymocytter og kreftceller; (5) LC direkte hemmer HDAC I /II-aktiviteter
via
binding til de aktive områder av HDAC og induserer histone acetylering og lysin-acetylering opphopning
in vitro
; (6) LC behandling induserer opphopning av acetylerte histoner i kromatin knyttet til p21
cip1 genet, men ikke p27
kip1 oppdaget av Chip analysen. Disse data understøtter den LC, foruten å transportere acylgruppe, virker som en endogen HDAC-inhibitor i cellen, noe som ville være av fysiologisk og patologisk betydning
relasjon:. Huang H, Liu N, Guo H, Liao S, Li X, Yang C, et al. (2012) L-karnitin er en endogen HDAC hemmer selektivt hemme veksten av kreft celler
In Vivo Hotell og
In Vitro
. PLoS ONE 7 (11): e49062. doi: 10,1371 /journal.pone.0049062
Redaktør: Wei-Guo Zhu, Peking University Health Science Center, Kina
mottatt: 21 desember 2011; Akseptert: 9. oktober 2012; Publisert: 05.11.2012
Copyright: © 2012 Huang et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av National High Technology Research and Development Program of China (Prosjekt 2006AA02Z4B5), National Natural Science Foundation of China (Projects 81070033, 30770835, 81170608, 81072091); Prosjekter (9251018201002, 94510018201003604) i Guangdong-provinsen Natural Science Foundation og prosjekter fra Guangzhou Municipal Education Commission (10A 057S, 08A 108) (til JL, HH og CZ). Denne studien er delvis støttet av National Institutes of Health stipend R01HL072166 og R01HL085629 (til XW). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
carnitine er biosynthesized fra aminosyrer lysin og metionin og dets biologisk aktive formen er L-karnitin (LC). Det er generelt antatt at carnitin transporterer langkjedete acyl-grupper fra fettsyrer i den mitokondrielle matriks, hvor de kan brytes ned gjennom β-oksydasjon til acetyl-CoA for å oppnå nyttig energi
via
sitronsyresyklusen [ ,,,0],1] – [3]. Derfor LC er nødvendig for generering av metabolsk energi i levende celler.
Det har vært kjent at de fleste kreftceller hovedsakelig generere energi ved en høy hastighet av glykolyse, etterfulgt av en melkesyregjæring i cytosol, snarere enn av en forholdsvis lav hastighet på glykolyse, etterfulgt av oksydasjon av pyruvat i mitokondriene som de fleste normale celler. Dette er kjent som Warburg største effekt i kreftceller [4], [5]. Raskt voksende ondartede celler vanligvis har glykolytiske priser som er opptil 200 ganger høyere enn de av sine normale vev av opprinnelse. Selv om Warburg-effekten har blitt utfordret og videreutviklet, forblir denne teorien den mest omtalte bevis for at svulstene viser dysfunksjonell metabolismen [6].
Basert på denne teorien om at sitronsyklusen er skadelig i de fleste kreftceller [7 ], [8], hypoteser om vi at LC ville føre til forstyrrelse av cellulær metabolisme hos kreftceller, men ikke i normale celler. I denne studien undersøkte vi effekten av LC på cytotoksisitet både i kreft og normale celler. Vi fant ut at LC selektivt hemmet kreft celle vekst både
in vitro Hotell og
in vivo
. Vi videre undersøkt mekanismen for LC-mediert cytotoksisitet og fant at fysiologiske konsentrasjoner av LC kan direkte hemme HDAC aktiviteter.
Materialer og metoder
Materialer og midler
LC, R D-carnitin, ble oligomycin (nr 04876), smørsyre (Buty) og trichostatin A (TSA) kjøpt fra Sigma-Aldrich (St. Louis, MO). HDAC
TM I /II-analyse og screening systemet ble kjøpt fra Promega Corporation (Madison, WI). L-glukose og D-glukose ble erholdt fra Alfa Aesar (Karlsruhe, Tyskland). Føtalt bovint serum (FBS) ble anskaffet fra Invitrogen Co. (Carlsbad, CA). Rabbit monoklonale antistoffer mot acetyl-H3 (Lys9) (C5B11), kanin polyklonale antistoffer mot PARP, acetylert-lysin, acetyl-H4 (Lys8) og mus monoklonale antistoffer mot p21
Waf1 /Cip1 (DCS60) ble alle kjøpt fra Cell Signaling (Beverly, MA). Antistoffer mot Rb (G401), ble Phospho-Rb (S780) innkjøpt fra BioWorld Technology, Inc. mus monoklonalt antistoff p27 (F-8), kanin polyklonale antistoffer mot GAPDH (FL-335) og pepperrotperoksidase (HRP) -merket sekundære antistoffer var fra Santa Cruz Biotechnology Inc. (Santa Cruz, California). Forbedrede Chemiluminescence reagenser ble kjøpt fra Amersham Biosciences (Piscataway, NJ).
Mus og kosthold
Mann normal Balb /c og Balb /c nakne mus i alderen 5 uker (18-22 g) var kjøpt henholdsvis fra Guangdong Animal Center og plassert i rustfritt stål wire-maske bur i en dyrerommet ved konstant temperatur med en 12-h-lys /-Mørk syklus. Musene forbrukes en kommersiell nonpurified diett og vann ad libitum. Alle forsøksprotokoller var i samsvar med Guangdong Animal Senter for etisk behandling av dyr og godkjent av Animal eksperimentelle Committee of Guangzhou Medical College (SCXK2008-2002). Mann normale Balb /c mus ble randomisert til to grupper (n = 8 mus /gruppe) var
i.p.
. injisert med enten bærer (saltvann) eller LC på 400 mg /kg for påfølgende 15 dager. Kroppsvekt og organvekt ble funnet og oppsummert. Mann Balb /c nakne mus var
s.c
. inokulert i venstre armhule med HepG2 celler (1 x 10
6 celler /mus). Når tumorstørrelsen når 50-75 mm
3, ble musene tilfeldig delt inn i to grupper (n = 8 mus /gruppe) og ble
ip
injisert med enten bærer (saltvann) eller LC (400 mg /kg, en gang /dag) i 15 dager med unntak dag 8. kroppsvekt og tumorvekt ble funnet og sammenfattet. For bedre å illustrere disse resultatene, ble alle primærdata endret til det relative nivået (%).
Cell kultur
Menneskelig hepatom HepG2 og SMMC-7721 cellelinjer, kjøpt fra American Type Culture Collection (Manassas, VA), ble dyrket i RPMI 1640 supplementert med 10% FBS, 100 U /ml benzylpenicillin, og 100 U /ml streptomycin, pH 7,4, i en fuktet atmosfære med 5% CO
2 ved 37 ° C. Thymocytt isolasjon og primærkultur ble utført som følger: I korthet ble thymus fra Balb /c mus sammenrullet på et stykke av sterilt gasbind for å fjerne festet fett og bindevev og pakkboksen ble plassert i en 60 mm petriskål inneholdende 5 ml kald media (HBSS ved pH 7,0 inneholdende 5% føtalt kalveserum ved 4 ° C) og forsiktig ertet thymus fra hverandre med nåler og pipettert opp og ned flere ganger for å tilfreds bryte opp eventuelle celleklumper. Blandingene ble ført gjennom en 75 pm rustfri mesh for å fjerne klumper av vev, sentrifugert cellesuspensjoner (250 g, 10 min, 4 ° C) og resuspendert cellepelletene med 5 ml RPMI 1640-medium. De totale celletall ble telt med trypanblått i en hvit blodcelleteller.
Celledød analysen
Dette ble utført ved hjelp Annexin V-FITC og propidiumjodid (PI) dobbel farging, etterfulgt av flowcytometri, som tidligere beskrevet [9]. I korte trekk, ble dyrkede HepG2 cellene høstet og vasket med kald PBS og resuspendert med bindingsbuffer, etterfulgt av Annexin V-FITC inkubering i 15 minutter og farving PI i 15 min ved 4 ° C i mørke. De fargede celler ble analysert ved strømningscytometri i løpet av 30 min.
ATP-innholdet bestemmelse
ATP-innholdet bestemmelse ble utført som beskrevet tidligere [10]. I korthet ble Samme antall dyrkede celler oppsamlet og cellepelleten ble umiddelbart frosset og lagret i flytende nitrogen for senere ATP analyser. Lysatene ble sentrifugert ved 12 000 r.p.m. i 10 minutter ved 4 ° C. Supernatanten ble samlet opp for analyse av ATP ved anvendelse av en reversfase C18 HPLC (LC-6AD, Shimadzu, Japan) analyse etter at pH var justert 7,4. 180 mM KH
2PO
4 (5% metanol) ble anvendt som mobil fase (pH 6,25) som løper på 0,8 ml /min. Analysen var lineær 0,05 til 200 ug /ml for ATP med determinantkoeffisient (R
2) 0,999. Validering variasjonskoeffisient for intra- og inter-dagers analyser var mindre enn 1,5% og 5,1%, henholdsvis. Relativ ATP innhold er beregnet i henhold til toppareal
versus
ATP stå kurven.
Celleviabilitet analysen
Effekten av legemidler på cellen levedyktighet ble bestemt av MTS analysen (CellTiter 96® vandige løsning Cell Proliferation analysen, Promega Corporation, Madison, WI, USA) som rapportert tidligere [9]. I korthet ble cellene dyrket i 96-brønners plater og behandlet med den angitte midler for 24 eller 48 timer. Deretter behandlede celler ble inkubert med 20 ul av MTS for ytterligere 3 timer. Absorbansen ble målt ved 490 nm med automatisk mikroplateleser (Sunrise, Tecan). Cellelevedyktigheten ble beregnet ved følgende formel: cellelevedyktighet (%) = (gjennomsnittlig absorbans av behandlede gruppen – gjennomsnittlig absorbans av blank) /(midlere absorbans av ubehandlet gruppe- gjennomsnittlige absorbans av blindprøve)] x 100%
Histone og protein acetylering
in vitro Hotell og i dyrkede celler
for
in vitro
protein acetylering, ble cellelysat fra enten kreftceller eller muse thymocytter inkubert med ulike doser av LC og TSA eller Buty i en HDAC analysebuffer ved 37 ° C i 1,5 timer, deretter acetylert-H3, -H4, og lysin-acetylerte proteiner ble påvist ved Western blot. For protein acetylering i dyrkede celler, ble enten kreftcelle eller mus thymocytt behandlet med forskjellige konsentrasjoner av LC eller TSA og Buty for forskjellige tidspunkter ble cellene oppsamlet og deretter protein acetylering ble påvist ved Western Blot.
Western Blot
Western blot ble utført som beskrevet tidligere [11], [12]. I korte trekk ble en lik mengde av totalt protein utvunnet fra dyrkede celler separert ved 12% SDS-PAGE og overført til polyvinylidendifluorid (PVDF) membraner. Primære antistoffer og pepperrot peroksidase (HRP) -konjugert egnede sekundære antistoffer ble benyttet for å påvise de angitte proteiner. De bundne sekundære antistoffer på PVDF-membran ble omsatt til ECL påvisningsreagenser og utsatt for røntgenfilmer (Kodak, Japan). Den x-ray film eksponering ble skannet og digitalisert ved hjelp av et høyoppløselig skanner. Tettheten av ønskede band ble kvantifisert med nummer én-programvaren (BioRad).
Cell syklus analyse
Cellesyklus analyse ble utført som rapportert tidligere [12]. HepG2-celler ble sådd i 6-cm skåler over natten i RPMI 1640 medium supplert med 10% føtalt bovint serum, deretter behandlet med LC ved angitte tidspunkter. Cellene ble oppsamlet, vasket med PBS, og farget med PI i nærvær av RNAase. Data ble analysert basert på fordelingen av cellepopulasjoner i ulike faser av cellesyklus.
Computational modellering
For å forstå den molekylære interaksjonen mellom L-karnitin og HDAC, en molekylær docking studien var utføres med CDOCKER protokoll fra Discovery Studio 2.0 (Accelrys Software Inc). Krystallstrukturen av HDAC (PDB ID: 1ZZ0) ble anvendt som forankrings protein. Først var bare en kjede A-underenheten opprettholdes etter andre kjede subenheter, alternative konformasjoner, den opprinnelige liganden ACT, kalium metaller og vannmolekyler ble fjernet. Deretter ble hydrogenatomer og Gasteiger satte tilsatt til subenheten. Til slutt ble det bare hydrogen posisjoner optimalisert med Dreiding lignende Force bruker Clean Geometry menyen. I mellomtiden, det sammensatte L-karnitin valgt som docking inhibitor ble også optimalisert med Dreiding lignende Force bruker Clean Geometry menyen. Proteinet HDAC var stiv, mens liganden LC var fleksibel under forankringsprosessen. Inngangs Nettstedet Sphere var sentrert på den opprinnelige ligand ACT med radius 12 Å. Topp hits, Tilfeldige konformasjoner og orienteringer å avgrense parametrene ble alle satt til 20. konformasjon som tilsvarer den laveste CDOCKER Interaksjon Energy ble valgt som den mest sannsynlige binding konformasjon. Endelig ble docking kompleks videre anslått bindende fri energi ved Beregn bindende energier protokollen. Alle parametre som brukes i beregningen var standard, med unntak for forklart.
HDAC aktivitetsanalyse
in vitro Hotell og i dyrkede celler
HDAC aktivitet
in vitro Hotell og i dyrkede celler ble påvist med The HDAC-Glo ™ i /II-analysen og Screening System (Promega, USA) etter standard protokoll. HDAC-analyse ble utført i hvite 96-brønns plate. For
in vitro
HDAC aktivitetsanalyse, cellelysat (optimal proteininnhold: 1 ug) ble inkubert med forskjellige agenter i en HDAC analysebuffer (100 ul) ved 37 ° C i 60 minutter og deretter ble 100 ul HDAC
TM I /II-reagens ble tilsatt, etter 30 minutter, ble luminescens målt. For HDAC analyse i dyrkede celler, celler (10000 celler /brønn) ble behandlet med LC-eller positive kontrollmidler i 6 timer eller 12 timer, deretter cellemediet ble skiftet til serumfritt medium plus HDAC-buffer (50 pl + 50 ul). Etter 15 min inkubasjon, HDAC
TM I /II reagenser (100 ul) ble tilsatt til cellene, luminescens ble målt etter 30 minutter.
kvantitativ real-time PCR
Totalt RNA Det ble tatt ut fra HepG2-celler med TRIzol reagens. Revers transkripsjon av renset RNA ble utført ved hjelp av hevet III revers transkripsjon i henhold til produsentens instruksjoner (Invitrogen). Kvantifisering av alle genet transkripsjoner ble gjort av kvantitativ hjelp av Takara SYBR Premiks Ex Taq kit med Applied Biosystems 7500 Fast Real-Time PCR system. Verdiene av P21 og P27 ble vist mot verdien av GAPDH som ble benyttet som en kontroll. De primersett for forsterkning er listet nedenfor: p21-F: 5’GTC CAG CGA CCT TCC TCA TCCA3 «; p21-R: 5’CCA Tags CCT CTA CTG CCA CCA TC3 «; p27-F: 5’ACT GAG GCG GAG ACG AAG GT3 «; p27-R: 5’CCT GAC AAG CCA CGC AGT AGAT3 «; GAPDH-F: 5’CCA GCA AGA GCA CAA GAG GAA3 «; GAPDH-R. 5’GGT CTA CAT GGC AAC TGT GAGG3 «
chip analyser
1 × 10
7 HepG2 celler ble forberedt for chip-analyse, utført som beskrevet tidligere [ ,,,0],13] av KangChen bioteknologiselskapet (Shanghai). For hver brikke analyse av prøven var en blanding av 3 uavhengige celleprøver. Anti-H3K9 antistoff ble anvendt for å immunoutfelle histoner. Alle chip prøver ble gjort ved real-time PCR, ved hjelp av Takara PCR termosykler og Rotor-Gene 3000 Realtime PCR. P21 og P27-primere var som følger: p21-F: 5’GCC GAA GTC AGT TCC TTG TG3 «; p21-R: 5’CGG GGT CCC CTG TTG TCT3 «; p27-F: 5’CTC TGA GGA CAC GCA TTT GGT3 «; p27-R: 5’TGC AGG TCG CTT CCT TAT TC3 «. Data er presentert som fold berikelse beregnes ved hvert antistoff ChIP verdi (IP /Input, andelen av input) i forhold til IgG kontroll chip verdi.
DNA microarray analyse og analyse
HepG2 celler ble behandlet forskjellige doser av LC til 24 timer, og deretter ble cellene oppsamlet og ekstrahert med TRIzol midler. RNA kvantitet og kvalitet ble målt ved Nanodrop ND-1000. RNA integritet ble bedømt ved standard denaturerende agarosegel-elektroforese. DNA microarray ble utført av KangChen bioteknologiselskapet (Shanghai) i henhold til MIAME retningslinjer. Menneske 12 × 135K Gene Expression Array ble produsert av Roche NimbleGen. Kort fortalt var ca 5 mikrogram total RNA for hver prøve som brukes for merking og rekke hybridisering som følgende trinn: (1) Revers transkripsjon med av Invitrogen Hevet ds-cDNA syntese kit; (2) ds-cDNA merking med NimbleGen en farge DNA merking kit; (3) Array hybridisering ved bruk av NimbleGen Hybridisering System og etterfulgt av vasking med en vaskebuffer NimbleGen kit; (4) Array skanning ved hjelp av Axon GenePix 4000B microarray scanner (Molecular Devices Corporation). Skannede bilder (TIFF-format) ble deretter importert til NimbleScan programvare (versjon 2.5) for grid justering og uttrykk dataanalyse. Fold økning av genekspresjon ble beregnet sammenlignet med bærerkontroll.
Statistiske metoder
Dersom ikke annet er angitt, Midlere + SD er presentert der dette er aktuelt. Uparede Student
t
-test eller enveis ANOVA brukes når det er hensiktsmessig for å bestemme statistiske sannsynligheter.
P
verdi mindre enn 0,05 er ansett som signifikant.
Resultater
LC behandling selektivt hemmer veksten av kreft celler
in vivo Hotell og
in vitro
Det er vel kjent at de fleste kreftceller avhenge glykolyse for ATP generasjon. For ytterligere å bekrefte at i våre cellesystemer, ble flere kreftcellelinjer brukes til å teste om oligomycin kunne hemme ATP produksjon. Resultatet i representative kreftceller ble vist. Det ble funnet at i nærvær av L-glukose i kulturmediet, oligomycin raskt oppbrukt ATP produksjon, mens i nærvær av D-glukose i dyrkningsmediet oligomycin ikke påvirke ATP generasjon (fig. 1
en
). Ettersom L-glukose ikke kan anvendes for å fremstille ATP produksjon [10], antyder dette resultatet at kreftceller i hovedsak avhengig av D-glukose glykolyse for ATP produksjon, i samsvar med tidligere rapporter [4], [5]. Vi neste undersøkt om LC behandling kan øke intracellulær ATP produksjon i kreftceller. Konsekvent til vår prognose, kunne LC behandling ikke øke ATP produksjon i både lever HepG2 og SMMC-7721 kreftceller (Fig. 1
b
). Men i motsetning til effekten i kreftceller, oligomycin, når de tilsettes i mus thymocytter dyrket med D-glukose, tidsavhengig inhibert ATP generasjon (fig. 1
c
) mens LC øket intracellulært ATP-innholdet effektivt ved forskjellige tidspunkt under denne tilstanden (fig. 1
d
). Disse resultatene bekrefter at LC er i stand til å generere ATP i normale mus thymocytter, men ikke på hepatisk HepG2 og SMMC-7721 kreftceller.
(a) Kreftceller er resistente mot oligomycin i nærvær av D-glukose ( 2 g /l), men ikke L-glukose (2 g /l). Humane HepG2-kreftceller ble dyrket i nærvær eller fravær av enten D-glucose eller L-glukose i kulturmedium og behandlet med forskjellige doser av oligomycin (0,1, 0,25, 0,5. 1,0 ug /ml) i 6 timer, og ATP-innhold var vurdert. Gjennomsnittlig + SD (n = 3). *
P
0,01,
versus
kontroll. DM: DMSO. (B) LC ikke øker intracellulært ATP-innholdet i kreftceller. Humane lever HepG2 og SMMC-7721-celler ble dyrket i vanlig kulturmedium henholdsvis og behandlet med forskjellige doser av LC i 6 timer, ATP-innholdet ble detektert. LC: L-karnitin. (C) Thymotytes er følsomme for oligomycin i nærvær av D-glukose (2 g /l). Muse thymocytter ble behandlet med oligomycin (1 mg /ml) for forskjellige tidspunkter (1, 3, 6, 9-H), ble samlet ATP-innhold detektert. (D) LC øker effektivt cellulære ATP-innhold. Muse thymocytter ble behandlet med LC (1 mM) i forskjellige tidsrom, ble cellulære ATP-innholdet assassed. Veh. Kjøretøy
Neste vi sammenlignet effekten av LC på normalt vev og kreft vekst
in vivo
. Normale Balb /c-mus eller Balb /c nakne mus inokulert med HepG2-cancerceller var
i.p.
. injisert med LC (400 mg /kg) i 15 dager, bortsett fra dag 8, etterfulgt av terminering av eksperimentet. Dette doseskjema er et tolerert dose for Balb /c nakne mus. Organvekt og tumorvekt hos hver mus ble behandlet ved LC eller kontroll ble sammenlignet. Det ble funnet at LC behandling hemmes mer enn 70% av kreft vekst, mens minsket den samme behandling som er mindre enn 20% av den normale organutvikling og kroppsvekt (fig. 2
a
).
(a) LC selektivt hemmer HepG2 tumorvekst sammenlignet med normalt vev. BALB /c nakne mus var
s.c
. inokulert i venstre armhule av hver mus med HepG2 celler (1 x 10
6 celler /mus). Når svulsten størrelsen når 50-75 mm
3, nakne mus var
i.p.
. injisert med 400 mg /kg for påfølgende 15 dager. Normale Balb /c-mus ble behandlet som i nakne mus. Kropp og organvekt ble oppdaget. B. W: Kroppsvekt. Gjennomsnittlig + SD (n = 8). *
P
0,01, **
P
0,05,
versus
hver kontroll hhv. % Inhibering = kroppsvekt eller organvekt i LC-behandlede gruppen /gjennomsnittlig kroppsvekt eller organvekt i kontrollgruppen x 100. (B) inhiberer LC HepG2-celle proliferasjon på en doseavhengig måte. HepG2-celler ble behandlet med forskjellige doser av LC (1,25, 2,5, 5, 10 mM) i 24 timer eller 48 timer, celleformering ble påvist ved MTS-analyse. Gjennomsnittlig + SD (n = 3). *
P
0,01, **
P
0,05, sammenlignet med kontrollgruppen. (C) LC induserer cellesyklus arrest på Go /G1 fase. HepG2-celler ble behandlet med forskjellige doser av LC i 24 timer, cellesyklus ble detektert ved strømningscytometri. Representative resultater ble vist. (D, e) LC induserer svakt celledød. HepG2-celler ble utsatt for forskjellige doser av LC i 24 timer og celle apoptose ble detektert ved strømningscytometri. Oppsummering av dataene er vist i (d) og representative strømningsbilder er vist i (e). ** P 0,05, sammenlignet med kontroll. (F) LC ikke dramatisk påvirke thymocytt cellenes levedyktighet. Muse thymocytter ble behandlet med forskjellige doser av LC (2,5, 5, 10 mM) i 24 timer ble cellelevedyktigheten detektert ved MTS-analyse og celleantallet var tall.
Vi undersøkte effekten av LC på celleproliferasjon av MTS analysen. Det ble funnet at LC doseavhengig redusert HepG2 cellenes levedyktighet (fig. 2
b
), assosiert med cellesyklus-stans i G0 /G1 fase (fig. 2
c
) og lave nivåer av celledød (fig. 2,
d Hotell og
e
). Disse resultatene antydet at LC overveiende indusert hemming celleproliferasjon, men litt indusert celledød i kreftceller. Til slutt, i normale mus thymocytter, LC hadde liten effekt på thymocytt levedyktighet og celletall innen 24 timer behandling (fig. 2
f
). Disse resultatene bekrefter at LC selektivt indusert kreft celle cytotoksisitet i
vitro Hotell og
in vivo
.
LC behandling induserer ekspresjon av p21
cip1 genet, mRNA og protein i kreftceller
neste fastsatte den molekylære mekanismen for hvordan LC kunne selektivt hemme tumorvekst. For å gjøre dette, ble genekspresjonen profilen undersøkt i HepG2-celler etter tre doser av LC behandling (2,5, 5 og 10 mM) i 24 timer. Alle oppregulert og ned-regulert gener (minst to ganger øker eller reduserer på alle de tre doser) etter LC behandling ble oppsummert (data ikke vist). Blant de oppregulert gener, p21
cip1 genet, men ikke p27
kip1 genet, to viktige gener assosiert med cellesyklusregulering, ble funnet å være høyt og doseavhengig uttrykk (Fig. 3
a
). Effektene av LC behandling på p21
cip1 og p27
kip1 mRNA nivåer ble neste bestemmes av real-time PCR. HepG2-celler ble dyrket med eller uten LC (2,5, 5, 10 mM) i enten 12 timer eller 24 timer, RNA ble preparert fra cellene. Etter behandling med LC, den p21
cip1 mRNA nivå doseavhengig økt både på 12 timer og 24 timer tidspunkter, og p21
cip1 mRNA nivået er relativt høyere etter 12 timer behandling enn 24 timer behandling, mens p27
kip1 mRNA viste ikke mye forandring på disse to tidspunkter (fig. 3
b
). For å bestemme protein nivåene av p21
cip1 og p27
kip1, ble Western blot-assay utført på de behandlede HepG2 celler. Resultatene viste at etter behandling med forskjellige doser av LC i 48 timer, p21
kip1 proteinnivåer økte på en doseavhengig måte i HepG2 kreftcellelinjer (fig. 3
c
,
venstre
). Videre dynamisk studie i HepG2 celler viste at etter behandling med LC (5 mm) for 12, 24, 36, og 48 timer, p21
cip1 tidsavhengig økt (Fig. 3
c
,
midten
). I SMMC7721 celler LC behandling også økt p21-protein ekspresjon i en doseavhengig måte i likhet med i HepG2-celler (Fig. 3
c
,
høyre
). Uventet, økt p27-protein i både dose- og tidsavhengige oppførsel etter LC behandling (fig. 3
c
) selv om p27
kip1 mRNA-nivå er stabilt, noe som tyder på at LC kan hemme nedbrytningen av p27 protein. For ytterligere å undersøke effekten av LC på nedstrøms virkningene av p21
cip1 og p27
kip1, nivåer av ufosforylerte Rb og fosforylert Rb (phos-Rb) ble påvist. Det ble funnet at LC behandling sank noe Rb-protein, men dramatisk redusert Phos-Rb-proteinet (fig. 3
d
). Resultatene viste at LC selektivt indusert p21
cip1 uttrykk.
(a) LC induserer p21
cip1 genekspresjon, men ikke p27 og GAPDH. HepG2-celler ble behandlet med LC (2,5, 5,0, 10 mM) i 24 timer; celler ble samlet inn for genekspresjon profilanalyse. I genet chip, det er 2 prober for p21
cip1 og en sonde for p27
kip1. Alle gangers økninger av p21
cip1 og p27
kip1 genuttrykk
versus
kontroll ble vist. (B) LC doseavhengig induserer p21
cip1 mRNA uttrykk, men ikke p27
kip1 i HepG2 celler. HepG2-celler ble inkubert med forskjellige konsentrasjoner av LC (2,5, 5, 10 mM) for enten 12 timer eller 24 timer; cellene ble samlet inn for mRNA-analyse av p21
cip1 og p27
kip1 ved real-time PCR. Dobling av LC-behandlet
versus
kontroll ble vist. Gjennomsnittlig + SD (n = 3). *
P
0,01, **
P
0,05, sammenlignet med kontrollgruppen. (C) LC doseavhengig måte og tidsavhengig induserer p21
cip1 akkumulering av proteiner i HepG2 kreftceller. HepG2 og SMMC7721 celler ble behandlet med forskjellige doser av LC i 48 timer eller HepG2-celler ble utsatt for 5 mM LC for 12, 24, 36, 48 timer; P21 og P27-proteiner ble påvist ved Western blot. (D) LC doseavhengig reduksjon Rb-fosforylering. HepG2-celler ble behandlet med LC i 48 timer; Rb og fosforylert Rb ble dectected av Western blot. Typiske vestlige bildene ble vist (til venstre) og bandet intensiteten ble kvantifisert (til høyre).
LC behandling økt histone acetylering i dyrkede celler
Basert på Warburg teori, vi antatt at tilskudd av LC i kreftceller ville forstyrre protein acetylering. Tidligere rapporter har vist at histone acetylering av HDAC hemmere selektivt indusert p21
cip1 uttrykk, men ikke p27
kip1 [14], [15]. Våre resultater har vist at LC selektivt indusert p21
cip1 uttrykk, men ikke p27
kip1 (fig. 2). Derfor, undersøkte vi effekten av LC på histon acetylering og akkumulering av lysin-acetylerte proteiner i dyrkede celler. HepG2, SMMC-7721 kreftceller og mus thymocytter ble behandlet med LC. Som vist på fig. 4,
en
og
b
, økt LC acetylering av histon H3 og H4 i en dose- og tidsavhengig måte i HepG2 kreftceller. LC kan også forårsake akkumulering av lysin-acetylert proteiner i både HepG2 og SMMC-7721 kreftceller (Fig. 4
c
). Ved primær thymocytt kultur, LC doseavhengig øket histon acetylering lik den i kreftceller (Fig. 4
d
). Disse resultatene tyder på at LC behandlingen økte protein (histon) acetylering i dyrkede celler.
(a) LC doseavhengig induserer akkumulering av acetylerte histoner. HepG2-celler ble utsatt for LC (1,25, 2,5, 5,0 mM) i 48 timer, acetylerte histoner H3 og H4 ble påvist ved Western blot. GAPDH ble anvendt som en kontroll lasting. (B) LC tidsavhengig induserer akkumulering av acetylerte histoner. HepG2-celler ble behandlet med LC (5 mM) for forskjellige tidspunkter (12 h, 24 h, 36 h, 48 h) og acetylerte histoner ble detektert. (C) LC behandling øker lysin-acetylert akkumulering av proteiner i menneske HepG2 og SMMC-7721 kreftceller. Human HepG2 og SMMC-7721-celler ble behandlet med LC (10 mM) i 12 timer, og deretter ble cellene oppsamlet for Western blot for å detektere acetylerte proteiner med lysin acetylert antistoff. (D) LC øker dose depentently akkumulering av acetylerte histoner i mus thymocytter. Muse thymocytter ble behandlet med LC i 24 timer, histon acetylering ble påvist ved Western Blot. Buty (1 mM) ble brukt som en positiv kontroll.
LC direkte hemmer HDAC aktiviteter
in vitro Hotell og i dyrkede celler
Siden LC induserer histone acetylering, vi deretter undersøkt om LC kan direkte påvirke HDAC aktiviteter. En beregnings docking-modellen ble først etablert. Krystallstrukturen av en HDAC-lignende protein fra bakterien hyperthermophilic
Aquifex aeolicus
med HDAC-inhibitoren TSA er blitt rapportert [16]. Strukturen viser stillingen av de essensielle sink atom som er involvert i katalyse av klasse I /II HDAC. Den kjemiske struktur av LC og dokk modell av komplekset (L-karnitin og HDAC) ble vist i fig. 5,
en
og
b
, og dens CDOCKER Interaksjon Energi og bindingsenergien var -29,01 og -85,79 kcal /mol, henholdsvis. Fig. 5
b
viser at en oksygenatom av karboksyl anion og oksygenatomet i hydroksylgruppen danner koordinasjons interaksjoner med sink-ion, med avstander på 2,696 Å og 2,640 Å, respektivt. Dette samspillet modellen er forskjellig i forhold til opprinnelige ligand ACT med sine to oksygenatomer av karboksyl anion koordinert til sink ion. Karboksylsidekjeden anion dannet en svak hydrogenbinding med Gly310, med avstand på 2,966 Å, og hydroksyl dannet hydrogenbinding med Tyr312, med avstand på 1,839 Å. I tillegg er (CH
3)
3N
+ gruppe lokalisert i en hydrofob inngangsparti og interaksjon med den hydrofobe overflate bestående av sidekjedene av Leu21, Ile100, Phe152, Phe208 og Leu275. Videre gruppe dannet kationer π interaksjoner med benzenringene av Phe152 og Phe208. Denne modellen spådd at LC har potensial til å interagere med HDAC-aktive seter.
(a) Den kjemiske strukturen til LC ble vist. Som vist på fig. Som vist på fig.
