Abstract
Anvendelsen av fagocytterende reseptoragonister i kreft immunterapi ble studert. Agonister (Laminarin, molekyler med terminal mannose, N-formyl-methioninyl-leucyl-fenylalanin) ble fast forankret til det tumorcelleoverflaten. Når særlige agonister av fagocyterende reseptorer ble brukt sammen med LPS (Toll-like receptor agonist), var høy synergi forårsaker svulst krymping og en midlertidig eller permanent forsvinning observert. Metoder for å forankre fagocyterende reseptoragonister (gebyr interaksjoner, forankring basert på hydrofobe kjeder, kovalente obligasjoner) og ulike regimer av fagocytisk agonist /LPS blandingen søknader ble testet for å oppnå maksimal terapeutisk effekt. Kombinasjoner av mannan /LPS og f-MLF /LPS (hydrofobe ankere) i passende (puls) regimer resulterte i en 80% og 60% gjenvinning for mus, respektivt. Vi foreslår at betydelig synergi mellom agonister av phagocytic og Toll-lignende reseptorer (TLR) er basert på to hendelser. TLR-ligand induserer tidlig og massiv inflammatorisk infiltrasjon av tumorer. Effekten av denne cellen infiltrat er rettet mot tumorceller, som bærer agonister av fagocytiske reseptorer på sin overflate. Resultatet av disse prosessene var effektiv dreping av tumorceller. Denne romanen tilnærmingen representerer utnyttelse av medfødt immunitet mekanismer for behandling av kreft
Citation. Janotová T, Jalovecká M, Auerová M, Švecová jeg, Bruzlová P, Maierová V, et al. (2014) Bruk av Forankret agonister av fagocytisk reseptorer for Cancer Immunterapi: B16-F10 murine melanoma modell. PLoS ONE 9 (1): e85222. doi: 10,1371 /journal.pone.0085222
Redaktør: Lucia Gabriele, Istituto Superiore di Sanita, Italia
mottatt: 31. mai 2013; Godkjent: 25 november 2013; Publisert: 13 januar 2014
Copyright: © 2014 Janotová et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av prosjektet no. CZ.1.07 /2.2.00 /15,0361 finansiert av European Social Fund og tsjekkiske statsbudsjettet. Videre ble det støttet av selskapet Polak CZ s.r.o. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser. Denne studien ble delvis støttet av Polak CZ s.r.o. Dette endrer ikke forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikk på deling av data og materialer.
Innledning
Ifølge bredt akseptert kreft immunoediting hypotesen [1] kreftceller, som overvant eliminering og likevektsfaser, genererer de kritiske endringene er nødvendige for å omgå både medfødte og ervervede immunforsvar (flukt fase). Tallrike rømningsmekanismer som nedregulering av tumorspesifikke antigener [2], tap eller nedregulering av MHC-antigener [3], defekter i antigen prosessering og presentasjon [4], ekspresjon av immun-hemmende ligander på tumorceller [5] , induksjon av sentrale eller perifere toleranse [6] eller generering av et immunsuppressivt tumor mikromiljø [7].
Mens den viktigste komponenten i antitumorimmunitet er representert av cytotoksiske T-lymfocytter [8], blant celler av medfødt immunitet, NK-celler ser ut til å spille den viktigste rollen [9]. Rollen til andre medfødte immunitet cellene er mye mindre utforsket, og nesten ingenting er kjent om anerkjennelse av tumorceller ved ubevæpnede makrofager eller granulocytter [10].
Likevel Cui et al. [11] og Hicks et al. [12] viste at mus med et SR /CR-mutasjon, slik at gjenkjennelse av tumorceller ved hjelp av en hittil ukjent mekanisme, med hell drepte tumorceller.
In vitro
eksperimenter vist at celler av medfødt immunitet (NK-celler, makrofager, nøytrofile) var ansvarlig for kreftcelle drapet. Utnyttelse av mønstergjenkjenning reseptor (PRR) agonister for å stimulere medfødte signalveier [13] er et annet delvis vellykket tilnærming til behandling av kreft. Kompleks mekanisme av PRR agonist handling består i produksjonen av interferon type I og andre proinflammatoriske cytokiner, forbedret modning av dendritiske celler, sekresjon av Th1- cytokiner, antigen kryss-presentasjon, aktivering av NK-celler og undertrykkelse av regulatoriske T-celler og tumorassosierte makrofager [ ,,,0],14]. Kliniske studier fokusert på bruk av syntetiske ligander av Toll-lignende reseptorer (TLR) 3,7,9 for svulst behandling [15].
Men foruten det faktum at aktivering av signale reseptorene (hovedsakelig TLR) fører til etablering av sterke svaret på nivået av medfødt immunitet, tumor infiltrerer immunceller må gjenkjenne kreftceller som de sanne mål for sine angrep. Vi foreslår å manipulere fagocyttiske celler (en viktig komponent av inflammatorisk infiltrat) for å være i stand til å finne sine mål ved kobling av agonister av fagocytiske reseptorer på overflaten av tumorceller for å oppnå en sterk antitumoreffekt. Denne effekten kan bli dramatisk forbedret ved samtidig behandling av TLR-reseptorer med en agonist (f.eks LPS).
Materialer og metoder
Etikk erklæringen
Alle de eksperimentelle prosedyrer var gjennomført i samsvar med lovgivningen i Tsjekkia på bruk av forsøksdyr, sikkerhet og bruk av smittestoffer. Studien ble godkjent av Institute of parasittologi, Biology Centre for Academy of Sciences i Tsjekkia og institusjonelle og nasjonale komiteer (protokoller nr. 138/2008).
Anestesi av mus (brukes under transplantasjon av melanom -celler) var basert på intraperitoneal injeksjon av Ketamine.HCl (75 mg /kg) og Xylazine.HCl (75 mg /kg). For overlevelse analyse mus ble overvåket to ganger om dagen. Hvor tumorvekst begrenses et dyrs evne til å bevege seg normalt eller å spise eller drikke så Musene ble avlivet via halshugging.
Kjemi
Tissue kulturmedier og kosttilskudd, Laminarin fra
Laminaria digitata
, mannan fra
Saccharomyces cerevisiae,
lipopolysakkarider (LPS) fra
Escherichia coli
, lipoteichonsyre syre (LTA) fra
Bacillus subtilis
, ditiotreitol (DTT), Tris ( 2-karboksyetyl) fosfin hydroklorid (TCEP), DAPI, og f-MLF (N-formyl-methioninyl-leucyl-fenylalanin) ble oppnådd fra Sigma-Aldrich (St. Louis, Missouri, USA). 4 – (
N
-Maleimidomethyl) cyclo-hexanecarboxylic-syre N-hydroksysuccinimidester (SMCC) ble kjøpt fra Thermo Scientific (Erembodegem, Belgia). Biokompatible anker for cellemembranen (BAM, Mw 4000) og N- (Succinimidyloxy-glutaryl) -L-α-fosfatidyletanolamin, dioleoyl (DOPE) ble oppnådd fra NOF EUROPE (Grobbendonk, Belgia). Anti-CD11b-FITC konjugat ble hentet fra MACS Miltenyi Biotec.
Monomannosyldekalysine ble syntetisert av Vidia (Praha, Tsjekkia). Mannose- (G)
5- (K)
12, mannose- (G)
5- (K)
10-STE (STE betyr stearinsyre), f-MLF- (G )
5- (K)
12, f-MLF- (G)
5- (K)
10-STE, MLF- (G)
5- (K)
10-STE, og f-MLFKK ble syntetisert av Schafer-N (København, Danmark).
Syntese av Laminarin-BAM, mannan-BAM, f-MLFKK-BAM, og f-MLFKK-DOPE
Først både aminerte Laminarin og mannan ble utarbeidet av reduktiv aminering [16]. Laminarin (mannan) oppløsning i et miljø av ammoniumacetat ble redusert med natrium-borhydrid ved pH 7,5 og 50 ° C i fem dager. Oppløsningen ble ytterligere dialysert ved bruk av MWCO 3500 dialyserør (Serva, Heidelberg, Tyskland) mot PBS ved 4 ° C over natten. Peptid f-MLFKK inneholdt allerede en aminogruppe.
Binding av BAM (inneholder en alifatisk kjede) eller DOPE (to alifatiske kjeder) på aminogruppen av Laminarin (mannan, f-MLFKK) ble utført ved pH 7,3 i henhold Kato et al. [17]. I løpet av en time ved romtemperatur, N-hydroksysuksinimid (NHS) gruppe av BAM resp. DOPE omsettes med aminogruppen av Laminarin (mannan), eller med ε-aminogruppen i lysin henholdsvis. Oppløsninger oppnådd (i PBS) ble lagret frosset ved -20 ° C inntil bruk.
Syntese av Laminarin-SMCC, mannan-SMCC, f-MLFKK-SMCC, og deres
in vivo og
in vitro
søknad
Ifølge produsentens instruksjoner (Thermo Scientific, Pierce Protein biologi produkter), på samme måte som den forrige avsnitt, NHS gruppe SMCC reagert med aminogruppen av aminerte Laminarin og mannan, eller med ε-aminogruppen av lysin i f-MLFKK (molare mengder) respektivt. For å sikre binding av SMCC inneholdende ligander til tumorceller, var det nødvendig å sikre eksistensen av -SH-grupper på cellene. Den ble utført i henhold til Christiaansen et al. [18] ved reduksjon av cysteiner. I våre
in vivo
eksperimenter brukte vi 50 mM løsning av TCEP i PBS for dette formål. Denne løsningen ble injisert intratumorally (i.t.) en time før påføring av Laminarin-SMCC, mannan-SMCC eller f-MLFKK-SMCC løsninger (i PBS). I våre
in vitro
forsøk brukte vi 5 mM løsning av TCEP i PBS og én time inkubasjon på is.
Cellelinjer og mus
Murine melanom B16-F10 celler og peritoneal makrofager PMJ2R ble anskaffet fra American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA). Begge cellelinjer ble dyrket i RPMI 1640 (Sigma-Aldrich, USA) supplert med 10% føtalt kalveserum (FCS, PAA, Østerrike) og antibiotika. Celler ble opprettholdt ved 37 ° C i fuktet luft med 5% karbondioksyd.
Dame SPF C57BL /6 mus ble oppnådd fra Charles River Laboratories (Sulzfeld, Tyskland). Mus ble plassert i plastbur med tre-chip sengetøy beliggende i et bestemt patogen-fri rom med en konstant temperatur på 22 ° C og en relativ fuktighet på 65%. Pelletdiett og vann ble sterilisert. Mus ble plassert i en 12/12-timers daglengde miljø med fri tilgang til mat og vann. Mus som veier 18-20 g ble brukt i forsøkene.
Tumor transplantasjon
4 × 10
5 B16-F10 celler per mus i 0,1 ml RPMI uten FCS ble inokulert subkutant (sc) i et barbert område på høyre flanke.
behandling og evaluering av behandling
Mus ble randomisert i grupper tolv dager etter tumor transplantasjon. Terapi startet umiddelbart (intratumorale anvendelser av 50 ul av tilsvarende løsninger). Siden denne tiden, ble musene holdt individuelt.
Svulster ble målt hver andre dag ved hjelp av kalipere. Volum ble beregnet som tidligere beskrevet [19] med formelen V = π /6 AB
2 (A betyr den største dimensjon av tumormasse og B betyr den minste dimensjon).
Midlere reduksjon av tumorvekst ( %)
Reduksjon av tumorvekst (sammenlignet med kontroll) ble fastsatt som følger:
Mean (i%) av verdier målt på dag 4, 6, 8, 10, 12 og 14 etter behandlingsstart ble beregnet og merket som «gjennomsnittlig reduksjon av tumorvekst».
Analyse av celle infiltrere ved hjelp av flowcytometri. Cytokin analyse
Svulsten ble fjernet fra mus som hadde blitt avlivet via halshugging. Den ble deretter forsiktig vasket med kald RPMI 1640, kuttet i små stykker og anbragt i 1 ml kald RPMI 1640 inneholdende 0,33 mg /ml Liberase DL og 0,2 mg /ml DNase I (begge Roche Diagnostics, Tyskland). Etter 1 timers inkubering på en rotasjonsrister ved 37 ° C, ble klumper av vev aggregater sentrifugeres ved 160
g
i 10 minutter ved 4 ° C. Supernatanten ble anvendt for IL-1-beta, TNFa, IL-6, (ELISA, eBioscience), og IL-8 (R 0,2 mg /ml) B-celler (anti-mus CD19 APC; klon eBio1D3 0,2 mg /ml), T-celler (anti-mus CD3e FITC, klone 145-2C11; 0,5 mg /ml), CD4 + T-celler (anti-mus CD4 APC, klon GK1.5; 0,2 mg /ml), CD8 + T celler (anti-Mouse CD8a, klone 53 til 6,7, 0,2 mg /ml), NK-celler (anti-Mouse NK1.1 PE, klone PK136, 0,2 mg /ml), granulocytter (anti-Mouse Ly-6G (Gr-1 ) Alexa Fluor 700, klon RB6-8C5, 0,2 mg /ml) og monocytter /makrofager (MF-celler) (anti-mus F4 /80 Antigen PE-Cy7, klon BM8, 0,2 mg /ml). Merkede celleprøvene ble vasket to ganger i PBS ved sentrifugering ved 160
g
i 2 minutter ved 4 ° C og analysert ved hjelp av en BD FACSCanto II strømningscytometer (BD Biosciences, USA), som er utstyrt med to lasere med eksitasjons evner på 488 nm og 633 nm. Tjue tusen arrangementer ble målt i hver suspensjon i tre uavhengige repetisjoner. De merkede cellepopulasjoner ble analysert ved hjelp av BD FACSDiva programvare 6.1.3. Absolutte antall leukocytter undergrupper ble kvantifisert ved hjelp CountBright
TM absolutte telle perler (Invitrogen, USA). Styringen av alle spesifikke monoklonale antistoffer som gjenkjenner muse-overflateantigener ble utført på en prøve av splenocytter i hvert intervall av forsøket. Celletall ble rekalkulert og uttrykt som celler /mm
3 av svulstvev.
Histologi
Svulster ble fiksert med 4% nøytral løsning av formaldehyd. Parafinblokker ble forberedt. Seksjonene ble farget av hematoxylin /eosin.
Lung metastaser
Lunger fast med 4% nøytral løsning av formaldehyd ble undersøkt ved hjelp av en dissekere mikroskop. Tilstedeværelsen av metastaser (svarte punkter) ble evaluert.
In vitro
analyse av den cytotoksiske effekten av makrofager aktiveres av en TLR ligand på melanomceller som bærer fagocyterende reseptorer
analysen ble basert på det prinsipp som er beskrevet tidligere [20]. Murine B16-F10 melanomceller dyrket til konfluens i 96-brønners vevskultur plate (Nunc, Roskilde, Danmark) ble inkubert (30 min, 37 ° C) med en oppløsning av fagocytiske reseptoragonister (0,02 mM Laminarin-BAM eller 0,02 mM mannan- BAM eller 0,05 mm f-MLFKK-BAM i kulturmedium) og deretter vasket. Celler av murin makrofag cellelinje PMJ2R ble preinkubert med LPS (1 pg /ml) i 2 timer ved 37 ° C, deretter ble de vasket, resuspendert i RPMI 1640, 10% FCS og tilsatt til B16-F10 i forholdet 05:01 . Denne blandingen ble inkubert i 4 timer ved 37 ° C. Etter inkubering ble PMJ2R og døde celler forsiktig vasket av. Levende B16-F10 melanomceller ble utgitt av trypsinering. Trypanblått-ekskluderende celler ble kvantifisert med et hemocytometer.
Cell aliserte
2 x 10
5 i hver, B16-F10 og PMJ2R celler ble sådd sammen i nærvær av Laminarin-BAM eller B16-F10 celler med kovalent bundet Laminarin-SMCC ble anvendt. Etter den angitte tiden for inkubasjon ble cellene lysert i en modifisert RIPA-buffer (1% Nonidet P-40, 0,25% natrium-deoksycholat, 1 mM EGTA, 150 mM NaCl og 50 mM Tris-HCl (pH 7,5)) i nærvær av proteasehemmere (10 ug /ml aprotinin, 1 pg /ml leupeptin, 1 mM fenylmetylsulfonylfluorid, 1 ug /ml pepstatin) og fosfatase-hemmere (25 mM natriumfluorid og 2 mM natrium ortovanadat). Cellelysatene ble blandet med 4 x Laemmli-prøvebuffer, enn proteinene ble separert ved SDS-PAGE, og overført til Immobilon-P-membran. Blottene ble inkubert med anti-fosfo-NF-kB p65 (Ser536, Cell Signalling) og med anti-β-actin Santa Cruz Biotechnology) antistoff ved fortynning 1:1000. Proteinene ble visualisert ved ECL (forbedret chemiluminiscence, Pierce), og sin overflod ble bestemt ved hjelp av CCD-bildesystem (ChemiDoc
TM MP Imaging System, BIO-RAD) og ImageLab programvare.
Mulighet for BAM og DOPE å forankre molekyler på cellemembraner
Bøyning av BAM eller DOPE med B-Phycoerythrin (PE) ble utført ved pH 7,3 i mørket som tidligere beskrevet [17]. En time varige interaksjoner av PE-BAM, PE-DOPE og PE med 1 × 10
5 melanomceller ble utført ved 37 ° C i mørket i tre paralleller. Etter sentrifugering (2 min. 4 ° C, 400 g) supernatanter ble høstet og dens fluorescens målt ved Infinite M200 leser (Tecan, Sveits) ved 545 nm.
Statistisk analyse
Statistisk analyse var utføres ved hjelp av to-halet t-test. Mus overlevelse ble evaluert med Kaplan-Meier test (MedCalc).
Resultater
Effekten av Laminarin i kreftbehandling
Effekten av forankrede Laminarin (Laminarin-BAM) på tumorvekst og dens synergi med LPS.
melanom B16-B10 ble transplantert inn 20 C57BL /6 mus. Tolv dager etter dette, ble mus randomisert i fire grupper som inneholder fem mus hver. På denne dagen, ble tumorvolumet målt og tumorterapi startet umiddelbart etterpå. Som figur 1A viser, gjorde Laminarin-BAM ikke ha en betydelig effekt på tumorvekst. Effekten av LPS var statistisk signifikant resulterte i 63,2% gjennomsnittlig reduksjon av tumorvekst (se Materialer og Metoder for beregning av gjennomsnittlig reduksjon av tumorvekst). Kombinasjonen av Laminarin-BAM og LPS viste synergistisk og sterk reduksjon av tumorvekst (gjennomsnittlig reduksjon av tumorvekst var 90,2% sammenlignet med kontrollen). Vi har observert at 60% av tumorer midlertidig forsvunnet, eller en reduksjon av tumorvolumet inntraff. Reduksjon av tumorvekst var statistisk signifikant sammenlignet med kontrollgruppen, og med effekten av individuelle (Laminarin-BAM, LPS) komponenter. Når det gjelder overlevelse, dets forlengelse i tilfelle av en Laminarin-BAM /LPS blanding var ikke statistisk signifikant.
C57BL /6-mus (hunner) ble inokulert med 4 x 10
5 murine melanoma B16-F10 celler per mus i 0,1 ml RPMI subkutant i en barbert område på høyre flanke. Mus ble randomisert i grupper på 5-6 tolv dager etter tumor transplantasjon. Terapi startet umiddelbart etter intratumorale anvendelse av 50 ul av tilsvarende løsninger og fortsatte hver annen dag i 10 dager (tilsammen 6 doser). Etter behandlingen var påbegynt, ble musene holdt individuelt. Tumorene ble målt hver annen dag i 14 dager, og deres volum ble beregnet. (A) Forankret Laminarin (Laminarin-BAM). Grupper på 5 mus erholdt 0,2 mM Laminarin-BAM i PBS, LPS (0,5 mg /ml PBS), blanding av 0,2 mM Laminarin-BAM og LPS (0,5 mg /ml) i PBS og PBS alene. (B) Forankret mannose. Grupper på 6 mus ble oppnådd 3 mM mannose- (G)
5) – (K)
10-STE i PBS, LPS (0,5 mg /ml PBS), blanding av 3 mM mannose- (G)
5- (K)
10-STE og LPS (0,5 mg /ml) i PBS og PBS alene. (C) Forankret mannan. Grupper på 5 mus erholdt 0,2 mM mannan-BAM i PBS, LPS (0,5 mg /ml PBS), blanding av 0,2 mM mannan-BAM og LPS (0,5 mg /ml) i PBS og PBS alene. (D) Forankret formylpeptide reseptor agonist av oligolysin. Grupper på 6 mus ble injisert med 3 mM f-MLF- (G)
5- (K)
12 i PBS, LPS (0,5 mg /ml PBS), blanding av 3 mM f-MLF- (G )
5- (K)
12 og LPS (0,5 mg /ml) i PBS og PBS alene. (E) Forankret formylpeptide reseptor agonist av stearinsyre. Det samme regime som i (D), 3 mM f-MLF- (G)
5- (K)
10-STE benyttet i stedet for 3 mM f-MLF- (G)
5- ( K)
12. * P≤0.05, ** P≤0.01, *** P≤0.005, **** P≤0.001 sammenlignet med kontroll ■ P≤0.05, ■■ P≤0.01, ■■■ P≤0.005 forhold til LPS oP≤ 0,05, ooP≤0.01, oooP≤0.005 forhold til liganden.
Synergy av Laminarin-BAM med LPS, ulike regimer av søknaden.
En rekke eksperimenter lik den ovenfor nevnes en ble utført. Optimalisering av narkotika søknad timing ble studert. En blanding av 0,2 mM Laminarin-BAM og LPS (0,5 mg /ml) i PBS ble anvendt. Resultatene er gitt i tabell 1, fremhever den viktige betydningen av kortsiktig men tilstrekkelig effektiv terapi.
Bruk av andre modusen for Laminarin binding til celleoverflaten.
Direkte kovalent
in vivo
binding av Laminarin-SMCC til cellene (med forutgående reduksjon av cysteiner av TCEP) ble brukt. Laminarin-SMCC (0,2 mM) ble administrert sammen med LPS (0,5 mg /ml). Denne terapien forårsaket sterkere reduksjon av tumorvekst enn Laminarin-BAM /LPS, likevel denne forskjellen ikke var statistisk signifikant (data ikke vist). Reduksjon (TCEP) og SMCC bindende ikke påvirke tumorvekst.
Kontrollforsøk.
For å demonstrere nødvendigheten av Laminarin forankring til kreftceller, gratis Laminarin ble brukt i stedet for Laminarin-BAM. Laminarin ikke redusere tumorvekst og sin blanding med LPS viste ingen tegn til additivity eller synergi. Tumorvekst reduserende aktivitet av denne blandingen tilsvarte aktiviteten av LPS alene (data ikke vist). Anchor alene (lysin-BAM) viste ingen antitumor aktivitet og dens blanding med LPS viste ingen tegn til additivity eller synergi også.
Effekten av molekyler med terminal mannose i kreftbehandling
Betydningen av mannose forankring, påvirkning av LPS.
A 3 mM oppløsning av mannose i PBS ikke redusere tumorvekst når de påføres hver andre dag, seks injeksjoner helt. Tilsetning av LPS (0,5 mg /ml) førte ikke til noen additivitet eller synergi, ble blandingen redusert tumorvekst enda mindre enn LPS alene. Tumorceller er betydelig negativt ladet, så vi studerte deres interaksjon med positivt ladet mannose-K
10, som inneholder ti lysinresidier kjeden. Mannose-K
10 ved 3 mM konsentrasjon påvirket ikke tumorvekst og tilsetning av LPS (0,5 mg /ml) førte ikke til det additivitet eller synergi. En lav effekt (32,7% bety reduksjon av tumorvekst i forhold til kontroll) ble registrert ved anvendelse av 3 mM oppløsning av mannose- (G)
5) – (K)
12) i PBS, dvs. forbindelsen med 5 glycin residuet spacer mellom liganden og forankringsdelen av molekylet. Denne reduksjonen var statistisk signifikant (sammenlignet med kontrollgruppen) bare på dag 6 av behandling (data ikke vist).
Tilsetning av et lipofilt anker (mannose- (G)
5- (K)
10) -STE) førte til en ytterligere reduksjon i tumorvekst. En løsning av denne forbindelse i PBS (3 mM) forårsaket en statistisk signifikant reduksjon av tumorvekst (figur 1B). Gjennomsnittlig reduksjon av tumorvekst var 75,6%. Tilsetning av LPS (0,5 mg /ml) førte ikke til noen additivitet eller synergi omvendt, betyr reduksjon av tumorvekst falt til 71,2%. Effekten av LPS alene forble den sterkeste. Musene ble avlivet 14 dager etter begynnelsen av behandlingen. Oppløsningen av mannose- (G)
5- (K)
10-STE fullstendig undertrykt utseende av metastaser. Forekomst og intensiteten av metastaser er oppsummert i tabell 2.
Effekten av forankrede mannan (mannan-BAM) på tumorvekst og dens synergi med LPS.
Mus ble behandlet med mannan -BAM, LPS og en blanding av de to (figur 1C). Mannan-BAM forårsaket en svak (50,5%), men statistisk signifikant reduksjon av tumorvekst. Effekten av LPS var litt høyere (gjennomsnittlig reduksjon av tumorvekst var 63,2%). En kombinasjon av begge forbindelser førte til en kraftig synergistisk reduksjon av tumorvekst (88,6% sammenlignet med kontrollen) og tumorer tidsmessig forsvant i 80% av musene. Reduksjon av tumorvekst forårsaket av mannan-BAM /LPS Blandingen var i utgangspunktet statistisk signifikant sammenlignet med både kontroll og begge individuelle komponentene i blandingen, senere bare med kontrollen. Forlengelse av mus overlevelse, forårsaket av behandling med blandingen av mannan-BAM /LPS, var ikke statistisk signifikant.
Synergy av mannan-BAM med LPS, ulike regimer av søknaden.
En optimale regime ble best oppnås ved puls intratumoral anvendelse av 50 ul av 0,2 mM mannan-BAM og LPS (0,5 mg /ml) blandingen på dagene 0, 1, 2. 8, 9, 10,16, 17, 18,24, 25, 26 . Dette regimet forårsaket ikke bare betydelig reduksjon av tumorvekst (94,7%), men også statistisk signifikant forlengelse av overlevelse (P≤0.005), se figur 2. En 80% overlevelse for 100 dager ble observert.
Blanding av 0,2-BAM og LPS (0,5 mg /ml) i PBS ble påført det i puls regime (dager 0,1,2. 8,9,10.16,17,18.24,25,26). Både behandlede og kontrollgruppe inneholdt 5 mus hver. *** Indikerer P≤0.005 sammenlignet med kontroll.
Bruk av andre modusen for mannan binding til celleoverflaten.
Direkte kovalent
in vivo
binding av 0,2 mM mannan-SMCC til celler (hovedsakelig redusert med TCEP) ble testet. Mannan-SMCC ble administrert sammen med LPS (0,5 mg /ml). Som vist i tabell 3, ble det observert høy reduksjon av tumorvekst og et høyt forhold mellom mus med midlertidige forsvinnende tumorer. Bruken av fire terapeutiske pulser av mannan-SMCC /LPS blanding forårsaket nesten statistisk signifikant forlengelse av overlevelse. Bare i dette tilfelle overlevelse lengre enn 100 dager, ble observert.
Kontrollforsøk.
Som nevnt tidligere, fri mannose ikke redusere tumorvekst. Dens blanding med LPS også ikke viste noen tegn til additivitet eller synergi, alle tumor reduserende aktivitet av blandingen tilsvarte virkningen av LPS alene. De samme resultater ble oppnådd med fri mannan (data ikke vist). Testing av nye forankrings prinsipper (elektrostatiske interaksjoner, celle reduksjon av TCEP og SMCC bindende) viste ingen antitumor aktivitet og kombinasjon med LPS viste ingen tegn til additivity eller synergi også. BAM forankring viste ingen anticancer aktivitet som allerede beskrevet. Når det gjelder (G)
5- (K)
10-STE, som beskrevet nedenfor, ingen anticancer aktivitet var forbundet med denne type av forankring i tillegg.
Virkningen av formylpeptide reseptoragonister i kreft terapi
Betydningen av forankring av formylpeptide reseptoragonister.
påvirkningen av LPS. I det første eksperiment ble agonister av formylpeptide reseptorer festet til tumorcelleoverflaten på basis av ladning interaksjon som allerede nevnt ovenfor. f-MLF- (K)
12 ble anvendt som agonist. Selv på 3 mM konsentrasjon, det gjorde ikke redusere veksten av melanom. Agonisten Effekten ble forsterket ved hjelp av et mellomstykke (5 glycinrest kjede), som muliggjør høyere fleksibilitet av koblings f-MLF gruppe. Strukturen av den ovennevnte forbindelse ble f-MLF- (G)
5- (K)
12. Som vist i figur 1D, f-MLF- (G)
5- (K)
12 løsning forårsaket svak, men ikke desto mindre statistisk signifikant reduksjon av tumorvekst (gjennomsnittlig reduksjon av tumorvekst var 59,7%), hvilke ble betydelig forbedret ved tilsetningen av LPS til 78,3% gjennomsnittlig reduksjon av tumorvekst. F-MLF- (G)
5- (K)
12 /LPS interaksjonen skal betraktes som noe additiv, og deres blanding viste bare en litt høyere effekt enn de mer effektive komponent i blandingen.
molekyl formylpeptide agonist ble ytterligere endret. Charge interaksjoner ble kombinert med forankring av alifatiske kjeden i lipid lag cytoplasmamembranen. Strukturen av denne forbindelse ble f-MLF- (G)
5- (K)
10-STE. Som vist i figur 1E, f-MLF- (G)
5- (K)
10-STE virker forhold (55,0% gjennomsnittlig reduksjon av tumorvekst) som forbindelsen uten stearinsyre, anvendt i foregående eksperiment ( 59,7%). Kombinasjon av f-MLF- (G)
5- (K)
10-STE med LPS førte til en sterk synergistisk effekt, viser markert reduksjon av tumorvekst (98,7%). Denne reduksjonen var statistisk signifikant sammenlignet med begge komponentene i blandingen. Svulster i fem av seks mus (83,3%) midlertidig forsvant. Økningen av overlevelsestiden i denne gruppen var statistisk signifikant (P≤0.05).
Bruk av andre former for binding av f-MLF til celleoverflaten.
En rekke eksperimenter avslørt at ankret 0,5 mM f-MLF motiv i blanding med LPS (0,5 mg /ml) er tilstrekkelig for sterk reduksjon av tumorvekst. Ved hjelp av disse konsentrasjoner og ulike måter å forankre og timing vi utført eksperimenter med det mål å finne de beste forholdene for den sterkeste antitumor effekt.
Resultatene er oppsummert i Tabell 4. Eksperimenter bekreftet vesentlig betydning for kort, men tilstrekkelig effektiv initial terapi, hvor blandingen av 0,5 mM f-MLFKK-DOPE og LPS (0,5 mg /ml) viste seg å være den beste. 60% av mus behandlet på denne måten overlevde 100 dager, stue videre uten patologiske symptomer.
Kontrollforsøk.
Gratis 3 mm f-MLF ikke viser noen reduksjon av tumorvekst og reduksjon aktivitet av dens blanding med LPS tilsvarte aktiviteten av LPS alene. Data ikke vist. Anchors (DOPE som lysin-DOPE, (G)
5- (K)
10-STE som immunologisk inert MLF- (G)
5- (K)
10-STE) ikke viser noen antitumor aktivitet og kombinasjoner med LPS viste ingen tegn til additivity eller synergi.
Analyse av cellen infiltrere i svulster ved hjelp av flowcytometri. Cytokin analyser
Tre forsøk av samme design ble utført med tre forskjellige phagocytic reseptorligander:. Laminarin-BAM, mannan-BAM og f-MLFKK-BAM alene eller i kombinasjon med LPS
I alle forsøkene 3 mus fra hver gruppe (se forklaringen til figurene 3, 4, 5, 6) ble drept i løpet av 12, 24 og 48 timers intervaller (+3 kontrollmus ble drept ved tiden 0). Celler for strømningscytometri og supernatanter for ELISA ble fremstilt og analysert.
Grupper av 9 mus fikk en enkelt dose av 0,2-BAM i PBS, LPS (0,5 mg /ml PBS), blanding av 0,2 mM Laminarin-BAM og LPS (0,5 mg /ml) i PBS og PBS alene i 50 pl den 3 mus fra hver gruppe ble avlivet på 12, 24 og 48 timers mellomrom, ble celler fra skåret tumorer stilles ved enzymatisk behandling (Liberase DL og DNase I), og analysert ved hjelp av strømningscytometri. For granulocytt detektering anti-mus Ly-6G (Gr-1) Alexa Fluor 700 ble anvendt.
Grupper av 9 mus fikk en enkelt dose av 0,2-BAM i PBS, LPS (0,5 mg /ml PBS), blanding av 0,2 mM mannan-BAM og LPS (0,5 mg /ml) i PBS og PBS alene i 50 pl it 3 mus fra hver gruppe ble avlivet på 12, 24 og 48 timers mellomrom, ble celler fra skåret tumorer stilles ved enzymatisk behandling (Liberase DL og DNase I), og analysert ved hjelp av strømningscytometri. De følgende merkede antistoffer ble anvendt: (A) anti-mus Ly-6G (Gr-1) Alexa Fluor 700 for granulocytt deteksjon, (B) anti-mus CD19 APC for påvisning av B-lymfocytter og (C) anti-mus NK1. en PE for NK-celler.
grupper av 9 mus fikk en enkelt dose på 0,5-MLFKK-BAM, LPS (0,5 mg /ml), blanding av 0,5 mm f-MLFKK-BAM og LPS ( 0,5 mg /ml), og PBS alene i 50 pl it Fremstilling av cellesuspensjon og granulocytt-farging ble utført som i figur 3.
Grupper av 9 mus fikk en enkelt dose av 0,5-MLFKK-BAM, LPS (0,5 mg /ml), blanding av 0,5 mM f-MLFKK-BAM og LPS (0,5 mg /ml), og PBS alene i 50 pl it 3 mus fra hver gruppe ble avlivet på 12, 24 og 48 timers mellomrom. Etter preparering av celler fra skåret tumorer, ble tilsvarende supernatantene anvendt for IL-1beta-bestemmelse. IL-1beta nivåene blir uttrykt som pg av IL-1beta /mm
3 av tumorvevet.
terapi basert på bruk av Laminarin-BAM, LPS og deres blanding.
endringer i antall granulocytter (GR1 +) kun ble observert i den overvåkede perioden. [24].
