Abstract
naturprodukt embelin har vist seg å ha et bredt spekter av terapeutiske egenskaper, men de mekanismer som det utøver mot kreft effektene er ennå ikke klart. Ved å overvåke de molekylære endringer knyttet under tidlig apoptotisk fase, har vi identifisert den avgjørende rollen som oksidativt stress indusert MAP kinase signal som en dominerende mekanisme for sin kreft effekter. Behandling av A549 lungekreftceller med embelin resulterte i forbedring av fosfo-p38 og JNK fosfo-nivåer så tidlig som 4 timer. Forbehandling av celler med spesifikke inhibitorer av p38 (PD169316) og JNK (SP600125) avskaffet embelin-indusert kaspase-3 aktivering. Studier ansette embelin i nærvær eller fravær av spesifikke MAP kinase hemmere indikerte at de observerte endringene i fosforylering nivåer av p38, JNK og ERK 1/2 er utelukkende på grunn av embelin og ikke på grunn av krysstale mellom MAP kinaser. Reaktive oksygenforbindelser (ROS) spiller en avgjørende rolle i embelin indusert forandringer i MAP kinasefosforylasjon og apoptose som forbehandling av celler med FeTMPyP dempet denne effekten. De observerte endringene er ikke på grunn av den hemmende effekten av embelin på XIAP som celler behandlet med SMAC-N7-Ant peptid, en spesifikk hemmer av XIAP sin BIR3 domene gjorde ikke etterligne embelin indusert apoptotiske effekter. Funnene i denne studien viser tydelig den avgjørende rollen p38 og JNK trasé i embelin indusert apoptose og gi oss nye ledetråder for å bedre sin terapeutiske effekt
Citation. Avisetti DR, Babu KS, Kalivendi SV (2014 ) Aktivering av p38 /JNK Pathway er ansvarlig for Embelin apoptose i Lung Cancer Celler: Transitional rolle reaktive oksygen arter. PLoS ONE 9 (1): e87050. doi: 10,1371 /journal.pone.0087050
Redaktør: Shrikant Anant, University of Kansas School of Medicine, USA
mottatt: 24 september 2013; Godkjent: 17 desember 2013; Publisert: 22 januar 2014
Copyright: © 2014 Avisetti et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av smil prosjekt fra csir, India. Senior Stipendiat å DRA fra UGC, India, er takknemlig erkjent. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser: Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Embelin, en aktiv komponent av fruktene av
Embelia Ribes, etter har vært vist å ha et bredt spektrum av terapeutiske egenskaper, så som kreft, anti-inflammasjon, anti-diabetes, anti-fedme, smertestillende, anti-fruktbarhet og anti-helminthic [1] – [5]. Den opprinnelige oppdagelse av embelin som en inhibitor av XIAP i kraft av dets interaksjon med BIR3 domenet og dets observerte selektivitet mot kreftceller i forhold til normale celler inspirert oss til å vurdere det som en ledende forbindelse for videre studier mot kreft [6]. Ettersom mange av de kreft uttrykker forhøyede nivåer av XIAP og bli motstandsdyktige overfor apoptose, behandling med embelin eller i kombinasjon med andre kjente anticancer legemidler ble funnet å sensibilisere dem mot apoptose [6], [7]. Mechanism baserte studier indikerer at embelin inaktiverer NF-kB ved å hemme atom transport av p65 og også vist å hemme STAT3 fosforylering ved å fremkalle uttrykket av PTEN [8], [9].
Spesifikke arbeidet med å identifisere den nøyaktige molekylære målet embelin resulterte i identifisering av embelin som inhibitor mot XIAP sin BIR3 domene [6]. I tillegg ble embelin også vist å være en inhibitor av 5-lipoxigenase og mikrosomal prostaglandin E2-syntase-1 (mPGES) -1; plasminogenaktivator-inhibitor-1 (PAI-1) og P300 /CBP assosiert faktor (PCAF) [10] – [12]. Videre har embelin blitt vist å interferere med oksidativ fosforylering av mitokondrier og kan gjennomgå både redoks og ikke-redoks-medierte mekanismer [13], [14].
Skjønt affiniteten av embelin mot noen av de molekylære mål og cellesignaleringsmekanismer har blitt identifisert, er det primære intracellulære mål ansvarlig for sin anti-kreft-egenskapen ikke ennå klart som mange av de tidligere studier har blitt utført ved senere tidspunkter hvor signaltransduksjon kaskaden blir komplisert på grunn av krysstale mellom flere cellesignaleringsmekanismer [8], [15], [16], [17]. Derfor, i denne studien, forsøkte vi å identifisere endringer i signalveier som er ansvarlige for kreft eiendom embelin løpet av tidlig apoptotisk fase. Denne studien identifisert for første gang sentral rolle MAP kinase vei, spesielt p38 og JNK, i embelin indusert apoptose.
Materialer og metoder
Material
Embelin var renset fra fruktene av
Embelia Ribes
som beskrevet tidligere [18], [19]. Minimalt essensielt medium (MEM), Dulbeccos modifiserte Eagles medium (DMEM), Dulbeccos fosfatbufret saltoppløsning (DPBS), penicillin, streptomycin, sulphorhodamine B (SRB), Ac-DEVD-7-AFC, Ac-LEHD-7-AFC, PD169316 , SP600125, N-acetyl-L-cystein (NAC), Radioimmun utfelling analysebuffer (RIPA) og protease-inhibitor cocktail ble innkjøpt fra Sigma-Aldrich, Tyskland. U0126 og FeTMPyP ble kjøpt fra Calbiochem. SMAC-N7-Ant peptid (AVPIAQK-P-RQIKIWFQNRRMKWKK) ble syntetisert ved GenPro Biotech, Noida, India. Annexin-V assay kit ble kjøpt fra Clontech Inc, USA. Alle kjemikalier for buffermidler og finkjemikalier ble kjøpt fra Sigma-Aldrich, Tyskland.
Cell Kultur og eksperimentelle forhold
Alle cellelinjer ble oppnådd fra ATCC, USA. A549, DU145, MCF-7 og WPMY-1-celler ble dyrket i MEM (supplert med 10% FBS, 100 enheter /ml penicillin og 100 enheter /ml streptomycin) mens H9c2 og MRC-5-celler ble dyrket i DMEM (supplert med 10 % FBS, 100 enheter /ml penicillin og 100 enheter /ml streptomycin). Celler ble opprettholdt i fuktet atmosfære med 5% CO2 ved 37 ° C. Tolv timer før behandling, ble cellekulturmedium erstattet med de respektive media inneholdende 2% FBS, med mindre annet er angitt. I intervensjonsstudier ble celler forbehandlet med de respektive MAP-kinase-inhibitorer eller antioksydanter i 1 time før tilsetning av embelin (15 uM). For forsøk med SMAC-N7-Ant peptid, ble cellene behandlet med 100 uM peptid over en periode på 8 timer.
Cvtotoksisitetsmålinq
Effekten av embelin på cellelevedyktigheten ble bestemt ved sulphorhodamine B ( SRB) analyse som beskrevet tidligere [20]. SRB er en aminoxanthene fargestoff som binder seg til basiske aminosyrerester i celler (festet til vevskulturplater med trikloreddiksyre) under milde sure betingelser [20]. I korthet ble celler (i 24 brønners plater, ~ 80% konfluens) ble behandlet med forskjellige konsentrasjoner av embelin i 48 timer i medium supplert med 10% føtalt bovint serum. Etter avslutning av inkubasjonen ble cellene fiksert ved tilsetning av 30% trikloreddiksyre til mediet ved 4 ° C i 1 time. Senere ble cellene vasket med avionisert vann og lufttørket. SRB (0,04%, w /v) ble tilsatt til cellene og inkubert ytterligere i 30 minutter ved romtemperatur. Til slutt, ble cellene vasket med 1% eddiksyre (tre ganger) og lufttørket. SRB bundet til cellene ble solubilisert i 10 mM Tris-base og absorbansen ble målt ved 565 nm ved hjelp av enspire multimode plateleser (Perkin Eimer).
Caspase 3 og 9-analysen
Etter avslutning av inkubasjon ble celle caspase-3 og -9- aktiviteter målt ved anvendelse av AFC-konjugert tetrapeptid-substrater som tidligere beskrevet [21]. I korthet ble cellene vasket med is-kaldt DPBS og lysert i iskald lyseringsbuffer (50 mM HEPES pH 7,4, 5 mM CHAPS og 5 mM DTT) [22]. Lysatene ble pelletert ned ved 12.000 g i 10 min ved 4 ° C og supernatantene ble samlet. Til lysatene like volumer av analysebuffer (40 mM HEPES pH 7,4, 0,2% CHAPS, 10 mM DTT, 4 mM EDTA) inneholdende enten caspase-3-substrat (Ac-DEVD-7- AFC, 40 uM) eller caspase-9 substrat (Ac-LEHD-7-AFC, 40 uM) ble tilsatt og inkubert ved 37 ° C. Økning i fluorescens målinger på grunn av utgivelsen av AFC ble overvåket for hver 5 min intervall på λex 400 nm og λem 505 nm i 1 t ved hjelp enspire multimode plateleser (Perkin Elmer). Protein estimering ble utført ved Bradford metode og fluorescens enhetene var normalisert til total protein i inkubasjonsblandingen.
Annexin-V /FITC Analyse for apoptose
A549 celler dyrket på Dekk i 6- brønners plater ble behandlet med embelin i 4 timer. Etter behandling, ble objektglassene vasket to ganger med PBS, etterfulgt av 1 x bindingsbuffer. Cellene ble deretter farget med annexin-V /FITC-antistoff ved å inkubere i mørke i 30 min og vasket med 1 x bindingsbuffer for å fjerne eventuelt ubundet antistoff i henhold til produsentens protokoll (Clontech Inc., USA). Formaldehyd (2%) ble tilsatt for å fiksere cellene på slutten av inkubering. Fluorescens ble overvåket ved hjelp av et Olympus-IX71inverted mikroskop utstyrt med FITC og rhodamin filterinnstillinger.
Gene Expression Profilering bruker Microarray
A549 celler ble behandlet med embelin i 4 timer. Etter behandling, ble RNA isolert ved hjelp av Qiagen kit i henhold til produsentens anvisninger. Konsentrasjonen og renheten av RNA ekstrahert ble evaluert ved bruk av Nanodrop spektrofotometer (Thermo Scientific). Integriteten til den ekstraherte RNA ble analysert på Bioanalyzer (Agilent). RNA ble ansett for å være av god kvalitet basert på 260/280 verdier, rRNA 28S /18S forholdstall og RNA integritet nummer (RIN). Prøvene ble merket ved hjelp av Agilent Hurtig Amp Kit. 500 ng av total RNA ble revers transkribert ved å bruke oligo-dT-primer, knyttes til T7 promotersekvens. cDNA oppnådd på denne måten ble omdannet til dobbeltkjedet cDNA i den samme reaksjon. Ytterligere cDNA ble omdannet til cRNA i
in vitro transkripsjon
trinn ved anvendelse av T7 RNA-polymerase-enzym og Cy3 fargestoff ble tilsatt til reaksjonsblandingen. cRNA ble oppnådd ble renset ved bruk av RNeasy kolonner (Qiagen Inc), og konsentrasjonen og mengden av fargestoff innarbeides ble bestemt ved bruk Nanodrop. Den spesifikke aktivitet for alle prøvene som er større enn 8 pmol fargestoff /ug cRNA ble betraktet som ideell for hybridisering. Merket cRNA (600 ng) ble hybridisert på array (Custom Whole Genome Menneskelig 8 × 60k designet av Genotype- Technology Private Limited AMADID: 027114) ved hjelp av Gene Expression Hybridisering kit i Sure hybridisering Chambers (Agilent) ved 65 ° C i 16 timer. Hybridiserte slides ble vasket ved hjelp av genuttrykk vask buffere. De hybridiserte, vasket microarray lysbilder ble deretter skannet på en microarray scanner (G2505C, Agilent Technologies). Datauttrekk fra bildene ble gjort ved hjelp Feature Extraction programvare og bildene ble kvantifisert (versjon 10.7 av Agilent). Feature hentet rådata ble analysert ved hjelp GeneSpring GX versjon 11.5 programvare fra Agilent. Normalisering av dataene ble utført i GeneSpring GX ved hjelp av 75
persentil skift. Betydelige gener opp og ned regulert viser to ganger og over i prøvene i forhold til kontroll-prøven ble identifisert. Statistiske
t
-test p-verdi ble beregnet på grunnlag av Student
t
-test algoritme. Gener ble klassifisert basert på funksjonell kategori og trasé ved hjelp GeneSpring GX og Genotype- Biointerpreter-biologisk Analysis Software. Den microarray data har blitt sendt til GEO database med tiltredelse antall GSE50545.
Intracellulær ROS Måling
reaktive oksygenforbindelser generasjon i celler ble bestemt ved karboksy-H2-DCFDA (molekylære prober) som beskrevet tidligere [23]. Etter avslutning av behandlingene, ble mediet aspirert og cellene i 12-brønners plater ble vasket to ganger med DPBS. Serumfritt medium inneholdende 10 uM karboksy-H2-DCFDA ble tilsatt til cellene og inkubert ytterligere ved 37 ° C i 20 min. Til slutt, ble cellene vasket to ganger med DPBS før tilsetning av kulturmediet. Intracellulær fluorescens ble overvåket ved hjelp av et Olympus-IX71inverted mikroskop utstyrt med FITC filter setting.
Western Blot analyse
Etter behandling ble cellene vasket med DPBS, forsiktig skrapt og innsamlet av kort sentrifugering (300 g i 3 minutter) og resuspendert i 100 ul inneholdende RIPA-protease inhibitor cocktail og natrium-orto-vanadat, 10 mM (Sigma). Den resulterende cellesuspensjonen ble ført gjennom en 26 gauge nål 10 ganger for å sikre fullstendig lysis. Lysatet ble sentrifugert ved 12 000 g i 15 min ved 4 ° C og den klare supernatantene ble samlet opp i separate rør. Ettersom alle antistoffene som anvendes er monoklonale, i stedet for stripping og reprobing de immunoblot for samlet og fosfo-spesifikke proteiner, har vi utført immunoblotting separat for å unngå eventuelle bakgrunnssignaler. Etter protein estimering av Bradfords metode, ble proteiner (25 ug) løst i 10% SDS-PAGE og blottet på en nitrocellulosemembran. Blotter ble undersøkt med monoklonale antistoffer dannet mot totalt og phospho spesifikke antistoffer for ERK 1/2, p38, JNK (Cell Signaling Technology); og tubulin (Sigma-Aldrich). Anti-kanin Ig-G konjugert til HRP (GE Life Sciences) og anti-mus IgG konjugert til alkalisk fosfatase (Sigma-Aldrich) ble anvendt som de sekundære antistoffer til MAP-kinase og tubulin-antistoffer hhv. Bånd ble utviklet ved hjelp av ECL Prime Western blotting reagenser (GE, miljø- og biovitenskap) eller BCIP /NBT reagens for tubulin (Sigma-Aldrich) og bandet intensiteter ble beregnet ved hjelp GeneTools programvare (Syngene gel dokumentasjonssystem).
Statistisk analyse
Alle forsøkene ble utført i tre paralleller, og resultatene ble uttrykt som gjennomsnitt ± SD Statistisk signifikans ble bestemt av Student
t
test med Sigmaplot programvare.
Resultater
Embelin utstillinger Forbedret Cytotoksisitet i kreftceller sammenlignet med normale celler
anti-proliferative aktivitet av embelin ble sammenlignet ved SRB-analysen i valgt kreft og normale cellelinjer (fig. 1). Celler ble utsatt for økende konsentrasjoner av embelin (2,5, 5, 10 og 25 uM) i 48 timer. Blant de kreftceller, ble embelin funnet å være mer toksisk for A549 celler med en IC
50 verdi på 4,4 uM, etterfulgt av DU145 og MCF7 med 6.31 og 10.66 um respektivt. Imidlertid observerte IC
50 verdier var forholdsvis mindre enn den normale cellelinjer viz., MRC5, WPMY-1 og H9c2 som viste en IC
50 verdi på 24,4, 10,9 og 23,4 um respektivt. Forskjellen mellom den observerte IC
50 verdier av lungekreft og normale celler (4,44 ± 0,76 og 24,44 ± 5,32 um) viste seg å være av større betydning. Som A549-celler oppviste forbedret sensitivitet mot embelin, har alle ytterligere studier blitt utført ved anvendelse av denne cellelinjen for å forstå virkemåten av embelin for å få ny innsikt for selektivt å målrette lungekreftceller sammenlignet med deres normale celle motstykke. Derfor, for å identifisere den tidlige apoptotiske fase, har vi analysert tidsavhengige effekten av embelin på cellulær caspase-3 aktivitet i A549-celler (fig. 2A). Embelin (15 pM) indusert nesten 2 ganger økning i den caspase-3 aktivitet så tidlig som 4 h tidsperiode som ytterligere økt opp til seks ganger etter 8 timer (fig. 2A). Annexin-V /FITC farging av celler behandlet med embelin (4t) viser tydelig den tidlige fasen av apoptotiske celler som de ble farget bare med annexin-V, men ikke med propidiumjodid (Fig. 2B). Men på senere tidspunkter ie, 18 og 24, caspase-3 aktivitet ble redusert nesten til 4 og to ganger med henholdsvis indikerer at apoptotiske celler kan ha helt døde ved slutten av 18 eller 24, eller det kan også være en mulighet for multiple celledød mekanismer på grunn av krysstale mellom ulike signalmekanismer.
(A) Oppbygging av Embelin (B) Cellene ble behandlet med embelin for 48t og etter avslutningen av inkubasjon, celle levedyktighet ble målt ved sulphorhodamine B analyse og IC
50-verdier ble beregnet som nevnt i «Materialer og metoder» -delen. Dataene som vises, er gjennomsnitt ± SD for tre separate eksperimenter. * Indikerer p 0.01as sammenlignet med kontroller
(A) A549 celler ble behandlet med 15 mikrometer embelin for ulike tidsintervaller.. Etter avslutning av behandling, ble caspase-3-aktivitet målt som beskrevet i «Materialer og metoder» -delen. (B) A549-celler ble behandlet med 15 uM embelin i 4 timer og farget med Annexin V-/FITC og propidiumjodid som beskrevet i avsnittet «Materialer og metoder» -delen. Fluorescens bilder ble tatt med et Olympus-IX71 invertert fluorescens mikroskop utstyrt med FITC og rhodamin filterinnstillinger. Representative bilder fra tre forskjellige synsfelt vises. (C) Cellene ble behandlet med en XIAP inhibitor, SMAC-N7-Ant peptid (100 uM) i 8 timer. Senere, caspase-3 og -9- aktiviteter ble målt ved hjelp av tetra-peptid underlag som beskrevet under «Materialer og metoder» -delen. For både (A) og (C) data presentert er gjennomsnittet ± SD for tre separate eksperimenter. ** Angir p 0,01 og * angir p 0,05 sammenlignet med kontroller
Som embelin er kjent for å inhibere XIAP ved binding til BIR3 domene lik som SMAC, vi neste undersøkt om. observerte påvirker av embelin på cellulær apoptose kan bli demonstrert ved en cellepermeabel SMAC-N7-Ant peptid (bestående av modne SMAC sin aminoterminale 7 aminosyrepeptid – AVPIAQK bundet til Ant peptid -RQIKIWFQNRRMKWKK, for celle permeabilitet ved en prolin linker) som er kjent for spesifikt å interagere med BIR3 domene av XIAP [24], [25]. Resultatene viser at behandling av A549-celler med SMAC-N7-Ant peptid (100 uM i 8 timer) øket cellulær kaspase-9 aktivitet til nesten to ganger i forhold til ubehandlet kontroll ble det imidlertid ikke observert noen signifikant økning av caspase-3 aktivitet ( fig. 2C). Selv om de observerte effektene av SMAC-N7-Maur peptid er i samsvar med tidligere rapport [24], mangel på caspase-3-aktivering med SMAC-N7-Ant peptid, men ikke med embelin, bedt oss om å undersøke de ansvarlige trasé medier embelin Induced apoptose for å få ny innsikt i sin virkningsmekanisme.
Endring i Gene Expression profil av Embelin
for å identifisere trasé ansvarlige i embelin indusert apoptose, vi har analysert endret genuttrykk profil i A549-celler behandlet med embelin (15 uM i 4 timer). Totalt 215 oppregulert og 80 downregulated gener ble identifisert som viste minst to ganger forskjell i løpet av kontrollene med en betydning av p. 0,05
Klassifisering av disse genene basert på funksjonell kategori og trasé ved hjelp GeneSpring GX og Genotype- Biointerpreter-biologisk analyse programvare indikerte at oppregulert genene majorly hører til fem forskjellige baner (med minst 4 endrede gener i hver reaksjonsveien) og antall gener endret er i størrelsesorden Wnt (4-gener) fokal adhesjon (5 gener ) p53 (8 gener) cytokin-cytokin-reseptor-interaksjon (11 gener) MAP kinase pathway (16 gener) (fig 3 A-C).. Blant downregulated gener med minst tre gener i hver vei inneha en 2 ganger endring med en betydning av p. 0,05 tilhørte cytokin-cytokin reseptor og MAP kinase veien (Fig. 3A og B)
A549 cellene ble behandlet med embelin (15 uM) i 4 timer. Microarray analyse ble utført som beskrevet i «Materialer og metoder» -delen. Gener som viste differensial regulering av minst to ganger med p 0,05 ble klassifisert basert på funksjonell kategori og trasé ved hjelp GeneSpring GX og Genotype- Biointerpreter-biologisk Analysis Software. Trasé som overveiende viste differensial uttrykk var (A) MAP kinase vei, (B) cytokin-cytokin reseptor interaksjon og (C) p53 veien. Dataene er sendt til GEO database med tiltredelse antall GSE50545.
På et øyeblikk, de oppnådde resultatene tyder på at blant de endrede trasé, vises MAP kinase signalveien til å bli mer dominerende og betydelig påvirket med nesten 16 endrede gener og mange av de gener som er enten oppstrøms eller nedstrøms til p38 /JNK /ERK-reaksjonsveien, slik som p53 eller regulatorer av disse reaksjonsvei (fig. 3A). Fra funksjonelt synspunkt, fosforyleringen status for de identifiserte proteiner (for eksempel, DUSPs, GADD45A /B, p53 etc), men ikke bare deres transkripsjonsnivåer diktere mobil skjebne. Likevel, de oppnådde resultatene indikerte betydelig rolle MAP kinase signal og inspirerte oss til å fokusere på involvering av MAP kinase veien i embelin indusert apoptose.
Embelin Induced Aktivering av p38 og JNK Pathway
basert på de første sporene hentet fra microarray studier på den potensielle rolle MAP kinase veien i embelin indusert apoptose, forsøkte vi å undersøke nærmere på involvering av MAPK signal og overvåkes embelin indusert endringer i fosforylering status av ERK, p38 og JNK proteiner ( fig. 4). Resultatene som er vist i fig-3 viser at embelin (15 pM) indusert fosforylering av p38 til nesten 2,5 og 3 ganger ved 4 og 8 timer henholdsvis. Fosfo-JNK 1/2 nivåer ble også øket til 1,2 og 1,9 ganger henholdsvis 8 timer. Imidlertid, under lignende behandlingsforhold var det en signifikant reduksjon i fosforylering status av ERK 1/2 (p42 og P44), og verdiene ble funnet å være 0,3 og 0,2 ganger mindre enn for kontrollene (fig. 4A og B). For å forstå hvorvidt endringene i fosforyleringen status for disse MAP-kinase-proteinene har noen relevans til den observerte apoptose, har vi forbehandlede celler i 1 time individuelt med spesifikke inhibitorer av p38 (PD169316), JNK (SP600125) og MEK (U0126) i 5 uM konsentrasjon fulgt av embelin (15 uM) i 4 timer. Embelin-indusert caspase-3 aktivitet ble betydelig inhibert av både p38 og JNK-inhibitorer for (fig. 4C) nesten kontrollverdier. Imidlertid, under lignende eksperimentelle betingelser MEK-inhibitor (U0126) ikke oppviser noen beskyttende effekt mot embelin indusert apoptose, og heller ingen signifikant økning av caspase-3 aktivitet ble observert i celler behandlet med inhibitorer alene (figur 4C.). De observerte endringene tydelig viser at endringer i fosforylering status for både p38 og JNK ser ut til å være avgjørende i embelin indusert apoptose.
(A) A549 celler ble behandlet med 15 mikrometer embelin for 4 og 8 timer. Total samt fosforylert ERK 1/2, p38, JNK 1/2 og tubulin (lasting kontroll) ble målt ved Western blot som beskrevet i «Materialer og metoder» -delen. (B) Normaliserte verdier av de båndintensitetene som oppnås ved densitometrisk analyse av dataene fra (A). (C) Caspase-3-aktivitet i celler forbehandlet med eller uten U0126 (5 uM), PD169316 (5 uM), SP600125 (5 pM) i 1 time, etterfulgt av embelin (15 uM) i 4 timer. Kontrollverdiene er normalisert til en, og dataene som er angitt er gjennomsnitt ± SD for tre separate eksperimenter. * Angir p 0,05 sammenlignet med kontroll og # indikerer p. 0,05 sammenlignet med embelin behandlede celler
For å kunne bestemme hvorvidt de observerte endringer i MAPK fosforylering er på grunn av embelin behandling alene eller på grunn av den regulerende effekt av en MAP-kinase over den andre MAPK-tallet, har vi behandlede cellene individuelt med embelin (15 uM) i nærvær og fravær av MEK-inhibitor (U0126, 5 uM) eller p38-inhibitor (PD169316, 5 uM) eller JNK-inhibitor (SP600125, 5 mM) i 4 timer og analysert fosforyleringen nivåene av alle de tre MAP-kinaser (fig. 5). Den MEK hemmer U0126 hemmer dens nedstrøms mål ERK. p38 inhibitor, PD169316 og JNK-inhibitor, SP600125 spesifikt inhibere p38 og JNK-aktivitet henholdsvis ved kompetitiv binding til ATP-bindende lommer hindrer fosforylering av proteiner nedstrøms, men som sådan ikke resulterer i redusert fosforylering nivåer av enten p38 eller JNK [26 ], [27]. Resultatene tyder på at behandling av celler med MEK inhibitor (U0126) hemmet fosfor-ERK 1/2, men endret ikke nivåene av embelin indusert fosfor-p38 og fosfor-JNK nivåer. Tilsvarende behandling av celler med p38 inhibitor (PD169316) påvirket ikke nivået av fosfo-JNK og ERK-fosfo forårsaket av embelin. Også behandling av celler med JNK-inhibitor (SP600125) påvirket ikke nivået av fosfo-p38 og fosfo-ERK i nærvær eller fravær av embelin (fig. 5). De ovennevnte resultater indikerer at de observerte endringene i fosforylering nivåer av p38, synes JNK og ERK å være direkte formidlet av embelin behandling, men ikke på grunn av krysstale mellom MAP kinaser.
A549 celler ble pre -behandlet med eller uten U0126 (5 uM), PD169316 (5 uM), SP600125 (5 pM) i 1 time, etterfulgt av embelin (15 uM) i 4 timer. ble oppdaget Totalt og fosforylerte nivåer av ERK 1/2, p38, JNK 1/2 og tubulin (lasting kontroll) ved Western blotting, som beskrevet i «Materialer og metoder» -delen.
ROS formidler MAP kinase Regulering av Embelin
MAPK-proteiner er kjent for å bli regulert av oksidativt stress [28]. Videre har benzokinon strukturen av embelin blitt demonstrert å danne semiquinone radikal av redox-mekanisme som til slutt fører til reaktive oksygenarter generasjon [13], [29]. Disse observasjonene tyder på en viktig rolle for ROS i embelin indusert apoptose. For å evaluere de pro-oxidant egenskaper embelin studerte vi effektene på generering av oksidativt stress i A549 celler. De intracellulære ROS genereres av embelin ble påvist ved en forbedring i den intracellulære fluorescens av DCF (fig. 6). Embelin (15 pM) indusert ROS generering i en tidsavhengig måte med nesten fem og ti-gangers økning i forhold til ubehandlede kontroller i løpet av 2 og 4 timer henholdsvis (fig. 6). Forbehandling av celler med antioksidanten, FeTMPyP (10 uM) eller N-acetyl-L-cystein (NAC) (10 mM) i betydelig grad hemmet embelin-indusert DCF farging med den i kontrollverdier (Fig. 6).
(A) A549-celler ble forbehandlet med eller uten FeTMPyP (10 uM) eller NAC (10 mM) i 1 time, etterfulgt av embelin (15 uM) i 4 timer og ROS-generasjon ble detektert ved DCF farging som beskrevet i «Materialer og metoder» seksjon. Cellular fluorescens ble tatt med et Olympus-IX71 invertert fluorescens mikroskop utstyrt med FITC filterinnstillingene. (B) Gjennomsnittlig fluorescensintensitet fra tre forskjellige synsfelt ble erholdt ved hjelp av ImageJ programvare. * Angir p 0,05 sammenlignet med kontroll og # indikerer p. 0,05 sammenlignet med embelin behandlede celler
Vi vurderte virkningen av ytterligere embelin-indusert ROS på MAPK-signalisering i nærvær og fravær av antioksidant, FeTMPyP (fig. 7). Resultatene tyder på at embelin indusert ROS er ansvarlig for de observerte endringer i fosfor-protein nivåer av p38, JNK og ERK 1/2 som forbehandling av celler med FeTMPyP opphevet denne effekten (Fig. 7A). I samsvar med de ovenfor angitte resultater, forbehandling av celler med FeTMPyP (10 pM) hemmet også de apoptotiske virkninger av embelin indikerer at forandret MAP kinase signalering på grunn av økt ROS spiller en sentral rolle i embelin-indusert apoptose (Fig. 7B).
A549-celler ble forbehandlet med eller uten antioksidant FeTMPyP (10 pM) i 1 time, etterfulgt av embelin (15 uM) behandling i 4 timer. (A) Cellular nivåer av total og fosforylert ERK 1/2, p38, JNK 1/2 og tubulin ble oppdaget av Western blot fulgt av chemiluminescence deteksjon som beskrevet under «Materialer og metoder» -delen. (B) Under lignende eksperimentelle forhold som (A), ble celle caspase-3-aktivitet målt som beskrevet under «Materialer og metoder» -delen. Dataene presentert er gjennomsnittet ± SD for tre separate eksperimenter. * Indikerer p 0,01 i forhold til kontroll og # indikerer p 0,05 i forhold til embelin behandlede celler
Diskusjoner
I denne studien rapporterer vi at oksidativt stress indusert MAPK. signalisering spiller en viktig rolle i embelin indusert apoptose. Analyse av genuttrykk profilering av microarray studier indikerte mulig involvering av MAP kinase vei i A549 celler behandlet med embelin i 4 timer. Forbehandling av celler med spesifikke inhibitorer av enten p38 eller JNK signifikant hemmet embelin indusert kaspase-3 aktivering så vel som oppheves embelin-induserte endringer i fosforylering nivåer av p38, JNK og ERK MAP-kinaser 1/2. Reaktive oksygenforbindelser (ROS) ser ut til å spille en sentral rolle mellom embelin og MAP kinase veien. Alle de observerte virkninger av embelin er ikke på grunn av hemming av XIAP som behandling av celler med cellepermeabel SMAC-N7-Ant peptid, som binder til BIR3 domenet av XIAP ikke påvirke cellulær kaspase-3 aktivering.
Den naturprodukt, embelin, har blitt betalt mer oppmerksomhet i den senere tid for sine anticancer egenskaper. Enda viktigere er det blitt vist å ha flere selektivitet mot kreftceller i forhold til normale celler (6). Selv i det foreliggende arbeid, observerte vi en lignende trend, og en signifikant forskjell i IC
50 verdier av embelin var tydelig mellom lungekreft og normale cellelinjer (Fig. 1). Selv om embelin ble først identifisert til å være en inhibitor av XIAP ved hjelp av dets interaksjon ved BIR3 domene, etterfølgende studier viste den direkte
in vitro
effekter av embelin på oksidativ fosforylering av mitokondrier, inhibering av 5-lipoksygenase (5 -LO) og mikrosomal prostaglandin E2-syntase-1 (mPGES) -1 og inaktivering av plasminogen aktivator inhibitor-1 (PAI-1) [10], [11]. Men identifikasjon av den primære intracellulære mål som er ansvarlig for kreft eiendom embelin slutt kanskje hjelpe i det strukturelle foredling av embelin for å forbedre sin effektivitet og selektivitet.
Nylig ulike studier har blitt gjennomført for å forstå virknings~~POS=TRUNC til embelin og det har blitt vist å ha en rolle i inaktivering av NF-kB, inhibering av STAT3 signalering via protein tyrosin fosfatase PTEN, lysosomal destabilisering og AKT og mTOR trasé [8], [9], [15] , [30], [31]. Men om alle de observerte effekter er innbyrdes avhengige eller uavhengige av hverandre, er ennå ikke klart så mange av de rapporterte eksperimenter ble utført ved en fast varighet på enten 24 eller 48t [8], [10], [16], [17 ].
data~~POS=TRUNC fra microarray studier i de tidlige stadiene av embelin indusert apoptose pekte oss til endringer i reguleringen av transkripsjonsfaktorer nedstrøms til MAPK proteiner (fig. 3). I denne studien har vi identifisert en fremtredende rolle MAP kinase vei, (økte nivåer av fosfor-p38 og fosfor-JNK) i embelin-indusert apoptose.
