Abstract
Mange prostatakreft tilbakefall på grunn av den generasjonen av chemoresistance gjengivelse førstelinjebehandling stoffer som paclitaxel (PTX) ineffektiv. Denne studien tar sikte på å bestemme hvilken rolle miRNAs og Hedgehog (Hh) sti i kjemoresistent prostatakreft og å vurdere kombinasjonsbehandling med Hh inhibitor cyclopamine (CYA). Studier ble utført på PTX motstandsdyktig DU145-TXR og PC3-TXR cellelinjer og kliniske prostata vev. Drug følsomhet og apoptose analyser viste signifikant forbedret cytotoksisitet med kombinasjon av PTX og CYA. For å skjelne tilstedeværelsen av kreft stamcelle som side populasjoner (SP), ble Hoechst 33342 strømningscytometri metode som brukes. PTX motstandsdyktig DU145 og PC3-celler, så vel som human prostata kreftvev har en distinkt SP fraksjon. Nesten 75% av SP-cellene er i G0 /G1 fasesammenlignet med 62% for ikke-SP-celler og har høyere ekspresjon av stamcelle markører også. SP cellefraksjon ble økt følgende PTX monoterapi og behandling med CYA eller CYA pluss PTX effektivt redusert sine tall tyder effekten av kombinasjonsbehandling. SP fraksjons Cellene fikk differensiere og analyseres på nytt ved Hoechst farging og analyse av genuttrykk. Post differensiering, SP celler utgjør 15,8% av totalt antall levedyktige celler som reduserer til 0,6% på behandling med CYA. Uttrykket nivåer av P-gp utstrømming protein ble også betydelig redusert på behandling med PTX og CYA kombinasjon. MikroRNA profilering av DU145-TXR og PC3-TXR celler og prostatakreft vev fra pasienter viste redusert uttrykk av tumor suppressor mirnas som miR34a og miR200c. Behandling med PTX og CYA kombinasjon restaurert uttrykk for miR200c og 34a, som bekrefter deres rolle i moduler chemoresistance. Vi har vist at supplere mitotiske stabilisator stoffer som PTX med Hh-hemmer CYA kan reversere PTX chemoresistance og eliminere SP fraksjonen i androgen uavhengige, metastatisk prostatakreft cellelinjer
Citation. Singh S, Chitkara D, Mehrazin R , Behrman SW, Wake RW, Mahato RI (2012) Chemoresistance i prostata kreft celler reguleres av mirnas og Hedgehog Pathway. PLoS ONE 7 (6): e40021. doi: 10,1371 /journal.pone.0040021
Redaktør: Wing-Kin Syn, Institute of Hepatology London, Storbritannia
mottatt: 26 januar 2012; Godkjent: 30 mai 2012; Publisert: 29 juni 2012
Copyright: © 2012 Singh et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet støttes av en idé Award (W81XWH-10-1-0969) fra det amerikanske forsvarsdepartementet Prostate Cancer Research Program. Økonomisk støtte ved Kosten Foundation (www.kostenfoundation.com) er også takknemlig erkjent. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Prostatakreft er den nest største årsaken til kreft dødsfall hos menn i USA [1]. Mens anti-androgen terapi er for tiden den første linje av behandling for pasienter diagnostisert med prostatacancer, vil de fleste pasientene til slutt utvikle den androgen-uavhengig form av prostatakreft, som er svært metastatisk og har dårlig prognose [2]. Mikrotubul-stabilisatorer så som PTX er effektive i behandling av pasienter diagnostisert med androgen-uavhengig prostatacancer [3]. Mens kliniske studier har vist den opprinnelige effekten av taxaner i økende overlevelse hos pasienter med prostatakreft [4], er det i dag få effektive metoder for behandling av kjemoresistent prostatakreft.
De fleste svulster er heterogene og er sammensatt av bulk og tumor initierende celler (tics) med sistnevnte danner en distinkt undergruppe i mange kreftformer. Tics er ofte referert til som kreft stamceller (cscs) og er ansvarlig for startfasen, selvfornyelse, og chemoresistance [5], [6]. Mange prostatakreft tilbakefall på grunn av tilstedeværelsen av svært kjemoresistent tumor initierende /cancer stamceller [7], [8]. Chemoresistance til kreft narkotika inkludert PTX, etter disse cellene kan bli bidratt med narkotika efflukspumper som effektivt kan fjerne lipofile molekyler, inkludert hydrofobe kreft narkotika. Denne iboende egenskap ved kjemoresistent celler brukes for identifikasjon og isolering av en side populasjon (SP), som er en type kreft stamceller. SP fraksjon, først identifisert av Goodell, er en liten subpopulasjon av celler med anriket stamcelle aktivitet og er kjent for å demonstrere utpreget lave nivåer av Hoechst 33342 fargestoff flekker [9]. SP fraksjons celler har vist seg å være ufølsomt overfor forskjellige kjemoterapeutiske medikamenter [10] på grunn av deres evne til i effluxing cytostatika (og lipofile fargestoffer som for eksempel Hoechst 33342) på grunn av høy ekspresjon av ATP-bindende kassett-familien, for eksempel MDR1 (P -glycoprotein) og ABCG2 [11]. Kjemoresistent SP cellene vil overleve og opprettholde sin clonogenicity under første eksponering for cytostatika, og dermed lar tilbakefall av sykdommen når behandlingen trekkes tilbake. Disse undergrupper av cscs blir dermed betraktet som en levedyktig mål for forbedret terapeutisk intervensjon og forebygging chemoresistance og kreft tilbakefall.
Utviklingen av chemoresistance gjennom en økning i antall kreft stammen som celler, inkludert SP fraksjoner har blitt tilskrevet endringer i nivået av microRNAs (miRNAs) i ulike krefttyper. Disse ikke-kodende RNA-molekyler som kan virke som onkogener, så vel som tumor-suppressor [12], [13], [14]. Feilregulering av miRNAs har vært innblandet i tumorigenesis og stoffet motstand også. Nyere arbeider ved Cochrane et al. har identifisert mirnas involvert i moduler chemoresistance i flere krefttyper [15].
I denne studien, hypotese vi at chemoresistance til PTX med metastatisk prostata kreft celler kan være på grunn av endret miRNA uttrykk i disse cellene, og at kombinasjonen av antimitosemekanisme legemiddel med et annet lite molekyl som hemmer cscs er sannsynlig å være effektive i ikke bare å gå tilbake chemoresistance ved å undertrykke cscs men også målrette mirnas involvert i chemoresistance. Således, mens svikt av tradisjonell kjemoterapi er på grunn av en manglende evne til å ødelegge cscs /SP fraksjoner, er en kombinatorisk metode sannsynlig vil gi bedre resultater fordi den CSC-inhibitoren vil drepe pluripotente kreftceller, og vil tillate det antimitotiske middel (i dette tilfelle PTX) å angripe bulk tumorceller. Mot dette formål, har vi kombinert PTX med cyclopamine (CYA), en naturlig steroid alkaloid som hemmer Hedgehog (Hh) sti som resulterer i redusert spredning og økt apoptose [16]. I de senere årene har Hh signalveien vært involvert i utvikling og spredning av prostatakreft [17], [18]. Bevis har også indikert at Hh signalering støtter androgen signalering og androgen-uavhengig vekst i prostatakreftceller i en lav androgen miljø [19]. Hemming av Hh-sti fører til nedregulering av gener involvert i stamcelleselvfornyelse samt regresjon av prostatatumor uten tilbakefall [20]. Kombinasjon av docetaxel med CYA og epidermal vekstfaktor reseptor (EGFR) hemmer gefitinib indusert større antiproliferative og apoptotiske effekter på SP cellefraksjoner isolert fra metastatiske prostata kreft celler enn individuelle legemidler [21]. Vi har nylig vist at tilsetning av EGFR-inhibitor lapatinibs kan forsterke virkningen av PTX til å indusere apoptose i en paclitaxel-resistent, androgen-uavhengig metastatisk prostata kreft celler linje DU145-TXR, både
in vitro
så vel som i xenografttumorer [22].
for å forstå fenomenet chemoresistance, i denne studien har vi brukt androgen uavhengig (AI) metastatisk prostatakreft cellelinjer DU145 og PC3 og deres PTX-resistente versjoner, DU145-TXR og PC3-TXR, respektivt. Vi har vist at PTX motstanden i prostatakreftceller kan moduleres på nivået av miRNAs. Vi viser videre at kombinasjonsbehandling med CYA og PTX effektivt kan redusere celleviabilitet, redusere SP-cellefraksjon ved doser langt lavere enn det som brukes for CYA monoterapi og støt mirnas putatively involvert i moduler chemoresistance. Våre data viser at kombinasjonsterapi involverer tilskudd av PTX med HH-hemmere kan målrette bestemte mirnas og kreft stamcelle som SP cellepopulasjoner ved doser som er effektive i kombinasjon, men ikke i monoterapi. Denne tilnærmingen kan representere en bedre tilnærming i å forebygge metastase og tilbakefall i ildfast prostatakreft siden det er mindre sannsynlighet for å være giftig, og vil presentere med langt færre bivirkninger for pasienten, sikre bedre etterlevelse og redusere sjansene for et tilbakefall.
Materialer og metoder
Material
PTX og CYA ble kjøpt fra LC Labs (Woburn, MA). SYBR Grønn real-time PCR Master Mix og revers transkripsjon reagenser ble kjøpt fra Applied Biosystems (Foster City, CA). Geit-anti-kanin-P-gp-antistoff og tilsvarende sekundære antistoff ble levert fra Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA). Alle andre kjemikalier ble hentet fra Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) og brukes som mottatt, med mindre annet er oppgitt.
Cellelinjer
Den menneskelige metastatisk prostatakreft cellelinjer DU145 og PC3 og sine PTX resistente versjoner DU145-TXR og PC3-TXR var en slags gave Prof. Evan T. Keller (University of Michigan). Alle cellelinjer ble holdt i RPMI kulturmedium supplementert med 1% penicillin /streptomycin og 10% føtalt bovint serum (FBS) (Gibco) i en fuktet inkubator inneholdende 5% CO
2 ved 37 ° C som tidligere beskrevet [22] .
Menneskeprostatavevet
Menneskeprostatavevet (kreft og godartet) ble hentet fra Veterans Affairs (VA) Hospital, Memphis, TN følge etablerte protokoller og i samsvar med informert samtykke avkall gitt av Institutional Review Board (IRB) ved UTHSC og på VA Hospital. Prostatavevet ble tatt ved bruk av en 18-gauge nål kjerne biopsi pistol og en del av denne vev ble skylt og enten flash-frosset i flytende nitrogen og deretter lagret ved -80 ° C eller plassert i kaldt serum-fritt RPMI-medium inneholdende antibiotika for fremstilling av enkelt cellesuspensjoner. Vev ble klassifisert som ondartet eller godartet basert på diagnose laget av en patolog.
Drug følsomhet og apoptose analyser i DU145-TXRCells
For å fastslå omfanget av cellulær apoptose etter medikamentell behandling, DU145- TXR celler ble sådd ut i 6-brønns plater (7,5 x 10
5 celler /brønn). Etter 24 timer ble mediet fjernet og friskt medium inneholdende varierende konsentrasjoner av PTX, ble CYA eller deres kombinasjoner tilsatt. Cellene ble deretter farget med Annexin-V og propidiumjodid (PI) ved hjelp av Vybrant apoptose analysesett som per produsentens protokoll (molekylære prober). I korthet ble cellene trypsinert, vasket to ganger med kald PBS og pelletert ved sentrifugering ved 800 rpm i 5 min. Pelletene ble resuspendert i 100 ul 1X Annexin bindingsbuffer og 5 ul fluoresceinisotiocyanat (FITC) -Annexin-V. Propidiumjodid (100 ug /ml) ble tilsatt til hver 100 pl cellesuspensjon. De fargede cellene ble umiddelbart analysert ved hjelp av strømningscytometri.
DU145-TXR celler ble også brukt for å bestemme hemming av cellevekst evne til PTX og CYA. Celler (5 x 10
3 /brønn) ble sådd ut i 96-brønners cellekulturplater og inkuberes i 24 timer for å tillate cellefesting. Media ble deretter byttet ut med ferskt medium inneholdende PTX (0,5 /1 uM) eller CYA (10/25 uM) eller kombinasjon (PTX 0,5 uM og 10 uM CYA) og inkubert videre i 48 timer ved 37 ° C /5% CO
2. Celleviabilitet ble deretter vurdert av MTT-analyse. For dette ble mediet fjernet og cellene ble vasket med PBS og 200 ul friskt medium inneholdende 3- (4,5-dimetyl-tiazol-2-yl) -2, 5-difenyl-tetrazolium-bromid (MTT) (0,5 mg /ml ) ble tilsatt, etterfulgt av inkubasjon ved 37 ° C /5% CO
2 i 4 timer. Etter 4 timer ble mediet fjernet og dannede formazankrystaller ble oppløst i 200 ul DMSO og absorbansen ble målt ved 560 nm. Celleviabilitet ble beregnet ved hjelp av følgende formel:
DMSO ble brukt til å oppløse PTX og CYA og DMSO kontroller ble inkludert i alle forsøkene
Side Befolkning analyse og celle sortering av FACS
Side populasjonsanalyse i DU14-TXR og PC3-TXR cellelinjer ble utført ved hjelp av Hoechst 33342 flowcytometri metode. I korte trekk, ble adherente celler trypsinisert og vasket med fosfatbufret saltvann (PBS). -Celler (1 x 10
6 celler /ml) ble deretter suspendert i RPMI-medium supplert med 2% FBS og 1 mM HEPES-buffer med eller uten medikamentløsninger (Verapamil, PTX eller PTX + CYA). Hoechst 33342 (5 ul; 1 mg /ml) farvestoff ble deretter tilsatt etterfulgt av inkubasjon i 90 minutter ved 37 ° C. Cellene ble gjenvunnet ved sentrifugering og vasket flere ganger med PBS for å fjerne ubundet fargestoff og til slutt suspendert i iskald PBS inneholdende 2% FBS. SP-fraksjonen i kliniske prøver ble analysert som beskrevet ovenfor med ytterligere trinn. I korthet, ble nylig resected prostatavev skylt, mekanisk hakket og spaltet i 4 timer ved 37 ° C med 100 U /ml kollagenase IV (Worthington Biologicals) i serumfritt RPMI. Vevet ble pipettert ofte med en 5-ml serologisk pipette og ved slutten av inkubasjonen digestionen ble ført gjennom en 18.5- gauge nål, sentrifugert kort og supernatanten ble siktet gjennom en 100 um celle sil for å oppnå enkel cellesuspensjon. Fortynnede enkeltcellesuspensjoner ble så ført en gang gjennom 40 nm mesh filter, deres levedyktighet bestemt ved trypan blå farging og holdt på is inntil analysert.
Celler dyrket i 6-brønners plater ble behandlet med A) 0,3% DMSO, B) 0,5 mikrometer PTX C) 10 mm CYA, D) 25 mikrometer CYA, E) 0,5 mikrometer PTX 10 mikrometer CYA for 48t og F) i DU145-TXR celler etter ulike medikamentelle behandlinger. Deretter ble cellene trypsinert, vasket med PBS og farget med Annexin V-FITC og PI før apoptotisk analyse ved strømningscytometri. A-E er representative plott fra tre individuelle eksperimenter. Dataene i panel F er kvantifisering av% celledød og representerer middelverdi ± SD (n = 3). *
p
0,05 vs. kontroll. For MTT-analysen (fig. 1G), ble celler dyrket i 96-brønners plate ble behandlet med den angitte konsentrasjon av medikamenter i 48 timer. Deretter ble MTT-reagens i PBS tilsatt og inkubering ble utført i ytterligere 4 timer. Det resulterende formazanprodukt ble solubilisert i DMSO og fargeintensiteten ble bestemt ved anvendelse av en plateleser. ble observert når kombinasjonen av 0,5 mikrometer PTX og 10 mikrometer CYA ble brukt; En statistisk signifikant forskjell (0,05 *
p
verdi 0,05 vs kontroll DU145 cellene i (A). PTX, Paclitaxel, CYA, Cyclopamine.
A) PC3-TXR-celler, B-celler) ble behandlet med verapamil (10 uM, 90 min), C), PC3-celler behandlet med TXR CYA (20 uM, 12 h) eller, D) CYA og PTX (20 uM og 0,5 pm, henholdsvis 12 timer). SP fraksjon, som ble fjernet ved behandling med verapamil, ble gated (P8) i alle paneler og er vist som prosentandel av hele levedyktige cellepopulasjon. De numeriske verdiene som er angitt er gjennomsnitt ± SD av tre individuelle eksperimenter. *
p
0,05 vs kontroll DU 145 celler (A). PTX, Paclitaxel, CYA, Cyclopamine.
Etter flyt sortering, ble rene SP celler belagt og lov til å differensiere i 2 uker. Representative mikrofotografier av SP (A) og NSP-celler (B) er vist med flere SP-celler som innehar en fibroblastiske, langstrakt fenotype i forhold til NSP. Sanntid RT-PCR ble benyttet for å bekrefte høyere ekspresjon av stamcelle markører OKT 4 og Nanog og kreft stamcellemarkører CD133 og ALDH1 (C). Lignende metode ble brukt til å vise høyere uttrykk av pluripotency og effluks markør ABCG2 og lavere uttrykk for MCM7 transkripsjoner i innledende SP celler (SP), sammenlignet med blandede bestander post-differensiering (diff) hvor redusert ABCG2 og økte MCM7 nivåer ble observert (D) . Ett sett av celler ble også behandlet med 25 uM CYA i 48 timer. Deretter ble cellene trypsinert og re-farget med Hoechst fargestoff og analysert ved strømningscytometri. Post-differensiering, celler avledet fra flyt sortert SP celler hadde høyere andel av SP cellefraksjoner enn tidligere hentet fra ikke-sortert DU145-TXR celler. CYA behandling betydelig redusert (
p
0,001 vs. kontroll) prosentandelen av SP fraksjons celler fra 15,8 (± 2,1)% (Panel E) til 0,6 ± (0,09)% (Panel F). Representative prikkplotter fra tre individuelle eksperimenter er gitt. Data representerer gjennomsnitt ± SD (n = 3).
In vitro differensiering studie
Evne til SP celler til å differensiere ble bestemt ved å dyrke de rene cellefraksjoner i en 6 brønns plate i 14 dager ettersortering. SP-fraksjon celler fra DU145-TXR og PC-TXR (1 x 10
5 /brønn) ble sådd ut i 6-brønners plate og tillatt å vokse i RPMI kulturmedium supplert med 10% FBS. Etter 14 dager, ble Hoechst farging og SP-analyse utført på behandlede eller ubehandlede cellepopulasjoner som er beskrevet ovenfor. Genekspresjonsanalyser ble også utført på SP og ikke-SP celler både før og etter-differensiering.
Etter behandling, med ulike medikamenter som beskrevet, ble totalt protein ekstrahert og separert med SDS-PAGE før sondering med P -gp antistoff. Aktin ble anvendt som en kontroll lasting. En kombinasjon av 0,5 mikrometer PTX og 10 mikrometer CYA var mer effektive i downregulating P-gp uttrykk i multiresistent prostatakreft celler enn monoterapi med enten CYA eller PTX på 10 og 0,5 mikrometer konsentrasjon. P-gp nedregulering med 25 pM CYA var nesten lik den som oppnås ved kombinasjonsterapi. (B) Uttrykk for Hh sti og stamcellemarkørgener i DU145-TXR celler. Total RNA ble ekstrahert fra celler og revers transkribert til cDNA. Real time RT-PCR ble utført ved hjelp av SYBR Grønn kjemi og Ct-verdiene dermed oppnådd ble brukt til å beregne ganger endring. Medikament-resistente DU145-TXR celler har høyere ekspresjon av alle tre gener som ble testet. PTX sensitive DU145-celler ble anvendt som kontroll og genekspresjon verdier for DU145-TXR celler ble normalisert i forhold til kontrollverdiene. *
p
. 0,05 vs. kontroll
Western blot analyse
Etter behandling, DU145 TXR cellene ble lysert ved hjelp av RIPA buffer og total proteinkonsentrasjon ble bestemt ved hjelp av Bio-Rad RC DC-proteinanalysesettet (Hercules, CA). SDS-PAGE ble deretter utført for å løse de proteiner som deretter ble overført til Immobilon polyvinylidenfluorid (PVDF) membran ved hjelp av iBlot tørrblotting systemet (Invitrogen, Carlsbad, CA). Blokkering ble utført ved bruk av 5% ikke-fett tørrmelk i 1 x PBST (PBS inneholdende 0,05% Tween-20) i 1 time ved romtemperatur. Membranene ble deretter inkubert med primært antistoff i 16 timer ved 4 ° C. Aktin ble anvendt som kontroll lasting og mål-proteinet ble påvist ved forsterket kjemiluminescens (ECL) deteksjonssett (GE Healthcare Life Sciences, PA).
Totalt RNA inkludert mirnas ble isolert fra DU145-TXR og DU145-celler (A ) eller PC3 og PC3-TXR celler (B) med miRNEasy RNA isolering kit. SYBR Green basert sti-fokusert miScript miRNA PCR Array (Qiagen, MD) ble brukt for miRNA profilering studier. Platene ble kjørt på en Roche Lys Cycler 480® instrument og ekspresjon av enkelte mirnas ble analysert ved hjelp av de oppnådde C
p-verdiene og den ΔΔCt metoden. Tabell i innsatsen (C) bekrefter validering av miRNA profilering data ved miScript primer analysen. Validering av miRNA profilering data ble gjort av en SYBR Green basert real time RT-PCR-analyse av utvalgte miRNAs. Som en normalizer, ble SNORD6 brukt som en rengjøring miRNA. (D) Effekt av kombinasjonsbehandling på restaurering av MIR 200 c og 34a ble bestemt ved å behandle DU145-TXR celler med PTX (0,5 mm) og CYA (10 mm) kombinasjon i 48 timer etter hvilken total RNA ble ekstrahert, konvertert til cDNA og anvendt som templat for primer miScript assay for å bestemme ekspresjon av mirnas 200c og 34a. Ubehandlede DU145-TXR celler ble brukt som kontroll for beregning ganger endring etter en SYBR Grønn real time RT-PCR-analyse. Data representerer middelverdi ± SD (n = 3). *
p
. 0,05 vs. ubehandlet kontroll
Real time RT-PCR
Total RNA ble ekstrahert fra sorterte og usorterte prostatakreftceller ved hjelp RNeasy RNA isolasjon kit (Qiagen, MD), etterfulgt av bestemmelse av dens kvalitet ved Nanodrop 2000 instrument. Den ble så revers transkribert inn i cDNA templat som tidligere beskrevet [23]. cDNA (100 ng) ble deretter amplifisert ved sanntids-PCR ved anvendelse av SYBR grønn farge universell konsentrat-blanding på en Lys Cycler 480 instrument (Roche, Indianapolis, IN) ved anvendelse av primerne for gener av interesse til førti perioder Relativ mengde av mRNA sammenlignet med S19 (husholdningsgenet) nivået ble beregnet ved hjelp av krysningspunkt (CP) verdier og skalert i forhold til kontrollprøver settes til en verdi på 1. Resultater for genekspresjon i eksperimentelle prøver ble plottet sammenlignet med kontrollen.
flere gener som er involvert i kreftrelaterte biologiske prosesser og kjente mål av forskjellig uttrykt mirnas i vår studie er endret hos PTX resistente DU145 TXR celler. Etter RNA-ekstraksjon og SYBR Green basert sanntids RT-PCR ved anvendelse av spesifikke gen-primere, ble Cp-verdiene beregnet og resistente DU145-celler ble anvendt for å normalisere ekspresjonen av individuelle gener. Data representerer gjennomsnittlig ± SD (n = 3).
mikroRNA (miRNA) profilering og datavalidering
Total RNA som inneholder små ikke-kodende miRNA ble isolert fra ubehandlet og narkotika -behandlet DU145-TXR og DU145 cellene eller PC3 og PC3-TXR celler ved hjelp miRNEasy RNA isolering kit (Qiagen MD) etter produsentens anvisninger. Av de samme reagenser ble anvendt for å isolere total RNA fra humant prostatavev. I korthet ble flash-frosset vev suspenderes i utvinning buffer og utsatt for forsiktig oppløsningen ved hjelp av et håndholdt elektrisk homogeniseringsapparat i 30 sekunder ved en lav-til-middelhastighet. Homogenatet ble sentrifugert i 3 minutter ved 4 ° C og supernatanten ble anvendt for å ekstrahere total RNA. Post-isolasjon, ble RNA kvalitet bestemmes ved hjelp av en Nanodrop 2000 instrument.
(A) Menneskelig prostatakreft vev ble omgjort til enkeltcellesuspensjoner som beskrevet i «metoder». Celler ble farget med Hoechst fargestoff og analysert som beskrevet tidligere. Nesten 1% av totale levedyktige cellepopulasjon ble gated som SP fraksjon. (B) Total RNA ble isolert fra et annet sett av humane prostata-vev (kreft og benigne) ved hjelp av miRNEasy RNA isolering kit. SYBR Green basert sti-fokusert miScript miRNA PCR Array (Qiagen, MD) ble brukt for miRNA profilering studier. Platene ble kjørt på en Roche Lys Cycler 480® instrument og ekspresjon av enkelte mirnas ble analysert ved hjelp av de oppnådde C
t-verdier og den ΔΔCt metoden. Brette endringer i tumorvev ble normalisert med hensyn til den godartet prostatavevet. (C) Tabell i innsatsen bekrefter validering av miRNA profilering data ved miScript primer analysen. Validering av miRNA profilering data ble gjort ved RT-PCR estimering av valgt miRNAs200c, 34a og 29b. SNORD6 ble brukt som en rengjøring miRNA for data normalisering.
For miRNA profilering studier, SYBR grønn basert sti-fokusert miScript miRNA PCR Array (Qiagen, MD) ble brukt. Kreften pathway array (katalognummer 102ZF) tillater samtidig påvisning av 84miRNAs tidligere identifisert i humane kreftformer, så vel som egnede rengjørings analyser og RNA kvalitetskontroller. Analysen ble utført i henhold til produsentens protokoll. Tre hundre nanogram (ng) av total RNA ble omdannet til cDNA ved hjelp av miScript II RT Kit. Fortynnet cDNA ble blandet med universal primer og SYBR grønn farge og tilsatt til brønnene i 96-brønners plater inneholdende lyofilisert primer. Platene ble kjørt på en Roche Lys Cycler 480®instrument og ekspresjon av enkelte mirnas ble analysert ved hjelp av de oppnådde C
t-verdier. Flippen endringen for hver miRNA ble beregnet ved å plugge C
p-verdiene inn i produsentens web-basert programvare. DU145 celler eller PC3-celler, så vel som godartet prostata prøvene ble betraktet som «kontroller» for å beregne ganger endring i DU145-TXR og PC3-celler og kreft TXR prostatavev, respektivt. Endogene kontroller, RT negative og positive kontroller og genomisk DNA forurensning kontroller ble også testet for hver gruppe.
Betydelig innbyrdes eksisterer mellom chemoresistance, epitelial til mesenchymale overgang og metastasering, noe som negativt påvirker behandlingsresultatene. Chemoresistance, en viktig funksjon i cscs og celler som gjennomgår EMT, er regulert av feilregulering av miRNAs. Vårt forslag til kombinasjonsbehandling med PTX og CYA samtidig rettet cscs og bulk kreftceller, reverserer EMT og gjenoppretter uttrykk for miRNAs endret under generasjon chemoresistance og er en levedyktig strategi for behandling av legemiddelresistent prostatakreft.
Validering av miRNA profilering data ble gjort ved real-time PCR estimering av utvalgte miRNAs. For hver av de valgte miRNA, ble en PCR-primer miScript anskaffet fra Qiagen. Denne analysen mål bare modne mirnas, ikke deres forløpere. Som en normalizer, ble SNORD6 brukt som en rengjøring miRNA. I korthet ble fortynnet cDNA anvendt for miRNA profilering anvendt som et templat i nærvær av SYBR grønn farge, universal primer og miScript primer. Platen ble kjørt som beskrevet over og folde endringer i miRNA ekspresjon ble beregnet ved bruk av C
t verdien av normaliseringskontroll. En tilsvarende tilnærming ble brukt til å måle uttrykk for miR200c og MIR 34a i DU 145-TXR celler behandlet med 0,5 mikrometer PTX + 10 mikrometer CYA. Etter behandling, total-RNA ble isolert, revers transkribert til cDNA og anvendt for å måle miRNA uttrykk som beskrevet ovenfor.
Statistical Analysis
Alle verdier i tall og tekst ble uttrykt som gjennomsnitt ± SD . Resultatene ble analysert og individuelle gruppe midler ble sammenlignet med Students uparede
t
-test. En
p
verdi på minst 0,05 ble betraktet som signifikant og er merket med en stjerne (*).
Resultater
Kombinasjon av CYA og PTX reduserer celleviabilitet og forbedrer apoptose i medikamentresistente prostatakreftceller
Enes evne til kombinasjonskjemoterapi for å hemme veksten av PTX motstandsdyktig prostatakreft-cellelinjen ble bestemt ved cellelevedyktigheten og apoptose assay. Det ble observert at kombinasjonen av PTX og CYA signifikant (
p
verdi 0,05) avtar cellelevedyktigheten til 40% sammenlignet med enten PTX eller CYA alene (figur 1, panelene A-F.). Lignende resultater ble oppnådd i Annexin V celledød målemetode hvor kombinasjonsbehandling resulterer i en betydelig høyere celledød sammenlignet med monoterapi kjemoterapi (fig. 1, G). Selv om en kombinasjon av PTX og CYA resulterte i nesten 70% av cellene dør, den prosentvise celledød observert med PTX eller CYA monoterapi var henholdsvis 15% og 25%. Men behandling med 25 mikrometer CYA var signifikant mer effektiv enn kontroll, og resulterte i nesten 40% celledød.
Side Befolknings fraksjoner eksisterer i PTX motstandsdyktig prostatakreftceller og har unike genuttrykk
Figurene 2 og 3 viser SP-analyse av prostatacancercellelinjer DU145-TXR og PC3-TXR, henholdsvis, så vel som effekten av behandling med PTX og CYA. Kontroll DU145 celler har små mengder av SP (0,2%, fig. 2A) mens PTX resistent cellelinje DU145-TXR har ~3.2% av SP-celler (fig. 2B) som angitt av Hoechst farging (
p
0,05 i alle prøver). I PC3-TXR-celler, ble SP fraksjon markert redusert etter behandling med CYA (fig. 3C) eller CYA og PTX kombinasjon (fig. 3D). Real time RT PCR-analyse indikerer høyere uttrykk av pluripotency markører OCT4 og Nanog og kreft stamcellemarkører CD133 og ALDH1 i SP fraksjoner sammenlignet med ikke-SP (NSP) fraksjoner i begge DU145-TXR og PC3-TXR celler. Post-differensiering skjebne av SP-celler ble studert ved sanntids RT-PCR og Hoechst-farging etter deres isolering og re-dyrkning. Disse cellene differensiert i en blanding som omfatter populasjon SP og NSP fraksjoner som var forskjellig i deres fenotype (Fig. 4, panelene A og B henholdsvis). Expression analyse av post-differensiering blandet populasjoner indikerer redusert transkripsjoner av ABC-transportør og kreft stemness markør ABCG2 og høyere uttrykk av celleproliferasjon markør minichromosome vedlikehold 7 (MCM7) sammenlignet med udifferensierte SP-fraksjoner (fig. 4D). Videre behandling av post-differensierings SP populasjoner med 25 uM CYA i 48 timer resulterte i SP-fraksjonen i betydelig grad avtagende fra 15,8% (panel E) til 0,6% (panel F,
p
0,05). Tabell 1 viser cellesyklusanalyse av strømnings sortert SP og NSP celler. Det ble observert at 62% NSP-celler var i G0-G1 og 30% i S-fasen i motsetning til 71,5% og 21% for SP-celler, henholdsvis (
p
0,05).
Gene og protein uttrykk i DU 145-TXR Cells
uttrykk av P-glykoprotein (P-gp) ble vurdert ved Western blotting. Fig.
