Abstract
kreft i urinblæren (UBC) rangerer niende i hele verden kreft. I Egypt, mønsteret av blærekreft er unikt ved at både overgangs og plateepitelkreft typer råde. Til tross for mye forskning på temaet, er det fortsatt vanskelig å forutsi tumorprogresjon, optimal terapi og klinisk utfall. Den reduserte folat bæreren (RFC /SLC19A1) er den viktigste transportsystemet for folater i mammalske celler og vev. RFC er også den viktigste måten å cellulært opptak for antifolatkreftcellegifter, men membran transport av antifolater av RFC anses som begrensende for antitumor aktivitet. Hensikten med denne studien var å sammenligne mRNA uttrykk nivået av RFC /SLC19A1 i uroteliale og ikke-uroteliale varianter av blære karsinom. Kvantifisering av RFC mRNA i slimhinnene av 41 ubehandlede blærekreftpasienter ble utført ved hjelp av RT-qPCR. RFC mRNA likevektsnivåer var ~9 ganger høyere (N = 39; P 0,0001) i blæren vevsprøver i forhold til normal blære mRNA. RFC oppregulering var sterkt korrelert med tumortypen (urothelial
vs
ikke-urothelial;. P 0,05) hvor median RFC mRNA-ekspresjon var signifikant (p 0,05) høyere i urothelial (~14 ganger) sammenlignet ikke-urothelial (~4 ganger) variant. Dette kan ta hensyn til variasjonen i respons til antifolat-regimer som brukes i behandlingen av hver type. RFC mRNA-nivåer var ikke forbundet med tumor klasse (I, II og III) eller trinn (muskel-invasiv
vs.
Ikke-invasiv muskel) antyder at RFC ikke kan anvendes for prognostiske formål i blæren karsinomer og dens økte uttrykket er en tidlig hendelse i menneskelig blæren svulster patogenesen. Videre kan RFC betraktes som en potensiell markør for å forutsi respons på antifolat kjemoterapi i uroteliale karsinom
Citation. Abdel-Haleem AM, El-Zeiry MI, Mahran LG, Abou-Aisha K, Rady MH, Rohde J, et al. (2011) Uttrykk for RFC /SLC19A1 er assosiert med Tumor Skriv inn blærekreftpasienter. PLoS ONE 6 (7): e21820. doi: 10,1371 /journal.pone.0021820
Redaktør: Hassan Ashktorab, Howard University, USA
mottatt: 19 januar 2011; Godkjent: 12 juni 2011; Publisert: 08.07.2011
Copyright: © 2011 Abdel-Haleem et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble finansiert av DAAD samt HiG som MSC prosjektmidler. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
20-60% av kreftforekomst i verden har vært forbundet med ernæringsmessige faktorer [1]. Blant de mest omfattende studert næringsstoffer som er involvert i kreft etiologi er vitamin folsyre. Folater er avgjørende for liv, og folatmangel bidrar til en rekke helseproblemer, inkludert hjerte-og karsykdommer, fosterets misdannelser, nevrologiske lidelser og kreft [1], [2].
Kreft i urinblæren er den niende mest vanligste kreftformen i verden. De fleste (77%) av blæren svulster oppstå hos menn. Det er den syvende vanligste kreftformen hos menn og 17 kvinner [3]. Spekteret av blæren svulster er bred og omfatter overgangsordning celle carcinoma (TCC), plateepitelkarsinom (SCC), adenokarsinom og småcellet karsinom. TCC er uten tvil den mest utbredte og best studert. I USA, 90% av blæren svulster er av den urothelial variant som utvikler seg fra overgangsceller. Omvendt, i Egypt, den vanligste histopatologiske typen blærekreft pleide å være SCC [4], som utgjør fra 59% til 81% av rapporterte blære kreft mellom 1960 og 1980 [4], [5]. I motsetning til den ledende etiologi av røyking og yrkesmessig eksponering i vestlige land, kronisk urinveisinfeksjon med
Schistosoma haematobium
, har vært den viktigste risikofaktoren for blærekreft i Egypt [5]. Men nyere studier [5], [6] rapporterte at SCC i Egypt ser ut til å ha gått ned fra 78% i 1980 til 27% i 2005.
Biopsi prøver av blæren tumorlesjoner lett kan oppnås ved trans -urethral reseksjon (TUR) før behandling. Til tross for mye forskning på temaet, er det fortsatt vanskelig å forutsi tumorprogresjon, optimal terapi og klinisk utfall [7]. Tumor staging (TNM-systemet) regnes for å være den beste prognostisk markør; Men unnlatelse av å forutsi nøyaktig progresjon eller tilbakefall er ofte oppleves [8]. I tillegg er behandlingssvikt et stort område der translasjonell blærekreft forskning kan ha nytte pasienter. For eksempel, MVAC regime (et antifolat-regime) viser bare begrenset antitumor aktivitet mot ikke-overgangsordning celle kreft mens responsrater på opptil ~70% ble rapportert i TCC i samme studie [9]. Hvis genetiske avvik mellom de to variantene av blære karsinomer påvirke deres progresjon og /eller respons på kjemoterapi, da er spørsmålet; som genetisk markør (e) er (er) de mest kritiske seg?
Den allestedsnærværende uttrykt redusert folat carrier (RFC) regnes som den viktigste transportveien for folater ved fysiologiske kofaktor konsentrasjoner selv når flere opptakssystemer er til stede [ ,,,0],1], [10], [11]. Tap av RFC uttrykk eller funksjon bebuder potensielt dyp fysiologiske og utviklings konsekvenser [1], [12]. RFC er også en stor transportør av Antifolat legemidler som brukes for kreft kjemoterapi som metotreksat (MTX), pemetrexed, og raltitrexed. Effektiviteten av kjemoterapi med disse midlene er nært knyttet til nivåer og aktivitet av RFC i både tumorer og normalt vev [13], [14]. MTX, for eksempel, fortsetter å være en viktig del av det kjemoterapeutiske armamentarium for en rekke forskjellige maligniteter, inkludert blærekreft [15], [16]. Pemetrexed har også nylig blitt vurdert for bruk i behandling av blærekreft [16]. Membrantransport av disse antifolater er kritisk for antitumoraktivitet ettersom dette gir tilstrekkelig (ubundet) intracellulært medikament for å opprettholde maksimal inhibering av enzymsystemer (for eksempel DHFR; Dihydrofolatreduktase) og for syntese av polyglutamat-derivater som kreves for binding med høy affinitet til intracellulære enzymer [13 ]. Den reduserte folat bæreren genekspresjon kan bli pålitelig studeres på mRNA-nivået, og basert på en rekke studier [13], [14], [17], [18], [19], [20], [21] i uttrykket gjenspeiler sannsynligvis aktiviteten av RFC i både tumorer og normalt vev. Derfor inspisere avvik i RFC uttrykk blant de forskjellige typer blærekreft kan bane vei for mulig forbedring av rasjonelt basert antifolatholdig kjemoterapi.
Denne studien ble dermed forpliktet seg til å undersøke mRNA uttrykk og potensiell klinisk relevans (dvs. assosiasjoner med tumorstadium, klasse og /eller histologisk type) av de store folat transporter, RFC, i en gruppe av menneskelige urinblæren svulster i ulike histologiske typer.
Materialer og metoder
Etisk uttalelse
En innledende antall 61 blærekreftpasienter ble inkludert i denne studien. Alle pasientenes data ble analysert anonymt og pasientenes samtykke hadde blitt oppnådd for å inkludere excised vev for den aktuelle studien via patologi avdeling ved National Cancer Institute (NCI), Kairo, Egypt. Alle forskningsprotokoller ble godkjent av institusjonelle gjennomgang styrene i NCI og forskningsetiske komité for det tyske universitetet i Kairo.
Pasienter
Seksti en tumor biopsier ble oppnådd ved TUR på NCI under perioden fra mars 2009 til januar 2010. 17 prøver ble senere ekskludert fra studien i løpet av RNA kvalitetskontroll trinn (se nedenfor). For de resterende 44 prøvene, ble tumorstadium og klasse tildelt i henhold til TNM [4] av patologi enhet ved NCI .. Pasienter inkludert i denne studien (n = 44, 31 hanner og 11 hunner og to uidentifiserte, aldersgruppe: 31-79) ble tildelt i to hovedgrupper, avhengig av tumortypen histologisk: urothelial tumorer «gruppe; TCC og TCC med plateepitel metaplasi; og ikke-urothelial svulster «gruppe; SCC og adenokarsinom. På tidspunktet for inkludering, ingen av pasientene hadde fått behandling i noen form. Kliniske kjennetegn ved blærekreftpasienter inkludert i denne studien er listet opp i tabell S1.
Total RNA ekstraksjon og revers transkripsjon
skåret tumor biopsier brukes til mRNA-analyse ble umiddelbart plassert i RNA
senere
® RNA Stabilization Reagent (Qiagen, Tyskland) som ble holdt ved -4 ° C over natten og deretter lagret ved -20 ° C. Total RNA ble ekstrahert fra frosne biopsier (~ 30 mg) ved hjelp av kit (Stratagene, Tyskland) i henhold til produsentens instruksjoner Helt RNA prep mini. Isolert RNA integritet ble elektro verifisert av etidiumbromidfarging og med A
260 /A
280 absorpsjon ratio (range 1,8-2,0) (A260 nm = 1 tilsvarer 40 mikrogram /ml RNA). En 02:01 intensitet forholdet mellom 28S og 18S rRNA ble betraktet som en målestokk for intakt RNA (Figur S1). 17 vevsprøver ble ekskludert fra studien basert på deres RNA integritet profil (Figur S1). 5 mikrogram total RNA ble revers transkribert med Sprint ™ RT komplette produkter kit (Clonetech, Tyskland) i et volum på 20 ul i henhold til produsentens instruksjoner.
RT-qPCR kvantifisering av RFC mRNA
RT-qPCR protokollen følges i denne studien var strukturert rundt Minimum Informasjon til offentliggjøring av kvantitativ real-time PCR Eksperimenter (MIQE) retningslinjer, utgitt av Bustin
et al.
[22]. RFC mRNA ble kvantifisert ved RT-qPCR på Mx3005P ™ instrument (Stratagene, USA). Transkripsjoner av β-actin ble kvantifisert som en endogen RNA-kontroll [7], [23] for å eliminere variasjoner i mengden og /eller kvaliteten av total RNA tilsatt til hver reaksjonsblanding, og hver prøve ble normalisert på grunnlag av sin β-actin mRNA innhold. Alle quantifications i denne studien er presentert som forholdet mellom målgenet og β-aktin. Primersekvenser, glødetemperaturen og PCR produkter størrelse for målgenet RFC og referanse gen β-aktin er presentert i tabell 1. Spesifisiteten av hvert primer-par ble bekreftet ved å smelte kurve analyse (figur S2) som resulterte i ett produkt bestemt smelte temperaturer.
Hver primerpar ble evaluert for sekundære strukturer og SNPs av
i silico
evalueringsverktøy på RTPrimerDB (https://medgen.ugent.be/rtprimerdb). Sterkt renset saltfrie primer for RFC og β-aktin (tabell 1) ble samlet kommersielt (Metabion GmbH, Tyskland) og optimalisert til en to-trinns (kombinert annealing /forlengelse temperatur) PCR protokoll. En pool av 3 blærekreft cDNA-prøvene ble benyttet for analyse optimalisering og forsterkningsvirkningsgrad evaluering (Tabell 1) ved hjelp av «standardkurve» metoden. En standardkurve for hvert gen ble deretter generert automatisk av Mx3005P ™ -programvare den hvor log den bestemte konsentrasjonen ble plottet mot den tilsvarende kvantifisering syklus (Cq) verdi [22]. Vilkår for alle PCR ble optimalisert med hensyn til å videresende og reversere primere konsentrasjoner og ulike annealing temperaturer (55-66 ° C). Real-time PCR Mastermix av følgende reaksjonskomponentene var forberedt til den angitte sluttkonsentrasjon: 12,5 mL Strøm SYBR® Grønn PCR Master Mix (Applied Biosystems, UK), 0,2 ul fremover primer RFC (100 nM), 0,2 mL revers primer RFC (100 nM) og 11,1 ul nuklease-fritt vann for målgenet; og 12,5 mL Strøm SYBR® Grønn PCR Master Mix, 0,75 mL forward primer β-aktin (300 nM), 0,75 mL revers primer β-aktin (300 nM) og 10 mL nukleasefritt vann for referansen genet. 24 ul av den fremstilte Mastermix ble pipettert pr brønn i en 96-brønns plate. 1 pl cDNA templat ble deretter tilsatt til hver reaksjon brønnen. Anvendelser av total cDNA innspill ble utført i duplikater. 96-brønns plate ble forseglet ved en PCR optisk klebende film (Eppendorf AG, Tyskland). Den følgende optimaliserte termiske profilen ble brukt: denaturering program (95 ° C i 10 min), forsterkning og kvantifisering program gjentatt 40 ganger (95 ° C i 15 s, 60 ° C i 1 min, med en enkelt fluorescens-måling), og som smelter kurve program (55-95 ° C med en oppvarmingshastighet på 0,1 ° C per sekund og en kontinuerlig måling av fluorescens). Fluorescens data ble samlet inn og mRNA kvantifisert med Mx3005P ™ programvareversjon 4.1. CQ verdier ble automatisk beregnet i henhold til «fit punktet metoden»; hvor Cq er definert som fraksjonert antall sykluser ved hvilken PCR kinetisk kurve når et program definert terskelmengde av fluorescens.
ganger endring i ekspresjonen av β-actin ble beregnet i henhold til metoden ifølge Schmittgen og Livak [24]. Som vist i tabell 2, variasjonen i β-aktin-ekspresjon var minimal blant urothelial og ikke-urothelial grupper.
Statistical Analysis
Dataene ble testet for normalitet ved hjelp av Shapiro -Wilk normalitet test. Metriske tester ble besluttet deretter. P-verdier mindre enn 0,05 ble ansett for å være betydelig. Mann-Whitney U-test og Kruskal-Wallis test ble brukt til å korrelere uttrykk for RFC med tumorstadium, klasse og type. Programvaren
Graph Pad Prism plakater (versjon 5) ble brukt for statistisk analyse.
Resultater
mRNA uttrykk for RFC
mRNA uttrykk for folat transporter RFC ble kvantifisert i 41 blærekreft eksemplarer, tre eksemplarer uten tegn til malignitet innhentet fra blæren slimhinnen ved siden av kreftvev, og en kommersielt tilgjengelig referanse blære RNA samlet fra 26 mannlige /kvinnelige kaukasiere; alderen 22-70 (Clonetech, Tyskland). Sistnevnte vil bli referert til som kalibrator i de neste avsnittene.
RFC mRNA uttrykk ble påvist i alle blære eksemplarer brukt i denne studien. Steady-state uttrykk nivåer av RFC mRNA var signifikant (
P
0,0001) høyere i blærekreft eksemplarer av ~9 ganger (8,661, rekkevidde 0,98 til 50, N = 39) enn i kalibrator .
klinisk
vs.
hisotpathological parametre
En multivariat analyse ble gjort for å bestemme de viktigste faktorene som RFC mRNA uttrykk ble knyttet. Korrelasjonen mellom RFC mRNA-nivåer og de testede clinicopathological parametere av blærekreft er oppsummert i tabell 3. RFC relative ekspresjonsnivået var signifikant (
P
0,05). Høyere i urothelial
vs
non -urothelial blære karsinom hvor RFC mRNA ble økt med ~14 ganger (13,27; n = 27) i urothelial tumorer i forhold til 4-ganger (4,083, n = 10) øker bare i de ikke-urothelial variantene (figur 1A). Median uttrykk nivået av RFC i TCC prøvene var 17,48; n = 23 i forhold til 5,538; n = 6 i prøver som er klassifisert som TCC med plateepitel metaplasi eller blandede overgangs og plateepitelkreft karsinomer. Men ingen statistisk signifikant forskjell ble funnet mellom RFC mRNA uttrykk i blærekreft prøvene klassifisert som ren TCC
vs.
De som har TCC med plateepitelkarsinom metaplasi (figur 1D). Dette viser at RFC mRNA-ekspresjon i ikke-urothelial tumorer er mye lavere enn i sine urothelial motstykker og plateepitel komponenten er hovedsakelig assosiert med redusert RFC mRNA-ekspresjon. Ekspresjonsnivået av RFC i blærecancer prøver som inneholder bilharzial ova ble sammenlignet med de med ingen tegn til infeksjon bilharzial der RFC mRNA var signifikant (
P
0,05) redusert i bilharzial-assosiert (BA) med blærekreft prøver (3,13; n = 7) sammenlignet med den ikke-bilharzial-tilknyttede gruppe (9,76; n = 32). (figur 1E)
Faste horisontale linjer viser medianen av hver enkelt gruppe. Alle data er vist som forholdet mellom den målgenet og beta-aktin. *
P
-verdi, ikke-parametrisk, Mann-Whitney eller Kruskal-Wallis tester. BA, Bilharizal-forbundet
Vi har undersøkt sammenhengen mellom nivåer av uttrykk for RFC mRNA og markører for tumor aggressivitet. (Nemlig; klasse og scenen). Uttrykket av RFC mRNA korrelerte ikke med svulst Karakter (figur 1B) der var det ingen statistisk signifikant forskjell (
P
= 0,3008) oppdaget mellom karakterer I, II eller III. Videre RFC uttrykk var ikke statistisk endret (
P
= 0,2666) mellom muskel-invasiv og ikke-muskel invasiv prøver (figur 1C). Spesielt, alle SCC prøver (n = 8) ble klassifisert som muskel-invasive tumorer, noe som peker på den mer aggressive natur av SCC og ikke-urothelial karsinomer. I tillegg ingen statistisk signifikant forskjell (
P
= 0,2162) ble funnet mellom pasienter med uroteliale karsinom (gjennomsnitt = 60,42)
vs.
De av den ikke-urothelial gruppe (gjennomsnitt = 52,88).
Diskusjoner
Siden pattedyrceller ikke kan syntetisere folater
de novo
, har tett regulerte cellulært opptak prosesser utviklet seg til å opprettholde tilstrekkelig nivå av intracellulære folater [25], [26]. I sammenheng med malignitet, er den viktigste folat transportsystemet, RFC, er øket ekspresjon i overensstemmelse med behovet for å øke cellulær retensjon av folater å støtte kravene til hurtig delende kreftceller for DNA-syntese og replikasjon. I denne studien, våre funn i human blære kreft biopsier var i samsvar med denne forestillingen hvor RFC mRNA-ekspresjon ble betydelig økt ved ~14 ganger i uroteliale blære karsinom (TCC og TCC med plateepitel metaplasi) og ved ~4-fold i non-uroteliale varianter (SCC adenokarsinom). Endret uttrykk for RFC er også rapportert i leukemi, spesielt B-forløper ALL [11], [26], [27], osteosarkom [17], tykktarmskreft og sentralnervesystemet lymfomer [1] på både transkripsjon og protein nivåer.
avviket i RFC mRNA uttrykk mellom urothelial og ikke-uroteliale blæren svulster, rapportert i studien, kunne tilskrives oppstrøms genetiske hendelser som finner sted i hver type, som kan påvirke transkripsjonen regulering av transporter. Både allestedsnærværende og vevs-spesifikke TFS som transactivate eller undertrykke transkripsjon i respons til krav om folat kofaktorer kontrollere netto nivåer av transkriptene RFC i vev [1], [18]. Litteratur og sti gruvedrift med
LitInspector
programvare [28] viste at RFC (SLC19A1) har potensielle interaksjoner med CREB1 (CAMP responsive element binding protein-1). CRE /AP-1-konsensussekvensen som er en av de to store områder av reguleringen av RFC basal promotorene [18]. CREB, som binder til CRE /AP-1, er blant de TF’er aktiveres av ERK (MAPK), som er komponenter av RTK-RAS signaleringsreaksjonsveien. Påløper bevis indikerer at sentrale deler av denne signalveien er ofte aktivert i humane urothelial karsinomer [29], men ikke i de ikke-urothelial typer [30], [31]. I menneskelige fibrosarkom celler, CREB-1 og c-Jun var de celle-spesifikke transkripsjonsfaktorer som er involvert i CRE bindende i RFC promoter. Lignende funn ble rapportert for CREB-1 og ATF-en i humane leverkreft celler og humane leukemiceller [18], [32]. Videre er to tredjedeler av antifolat-resistente cellelinjer viste en markert reduksjon i transkripsjonsfaktor binding til et enkelt CRE-setet som foreligger i den minimale promoter A i RFC-genet [33]. Derfor er det økende bevis som tyder på at binding av CREB-en til CRE i RFC promoter er en viktig bidragsyter til induksjon av RFC genuttrykk i kreftcellelinjer og ondartede svulster [18], [32], [33]. Derfor hypoteser vi at konstitutiv aktivering av RTK-RAS veien er trolig en faktor som står for økt RFC mRNA uttrykk i uroteliale karsinom. I ikke-uroteliale karsinom, men RAS mutasjoner er sjeldne og andre mutasjoner spiller inn (p16 p15 sletting [31], [32], Bax, Bak EGFR overekspresjon og p53 inaktivering [32]). Derfor forventer vi forskjellige genetiske hendelser som har ført til den beskjedne økningen i RFC mRNA nivå i ikke-uroteliale karsinom, og muligens forskjellige TFS involvert i RFC transkripsjon aktivering. Dette er ytterligere støttet av det faktum at øket RFC ekspresjon er svært sannsynlig å være forbundet med inaktivering av tumorsuppressorgener, der 5-metyl tetrahydrofolat (5-CH3-THF) er en kofaktor i de novo syntese av S-adenosylmetionin som deltar i metylering av CpG øyer. RFC er de viktigste oppføring rute for THF og økt ekspresjon RFC vil følgelig føre til akkumulering av metylert redusert folat [11], [15] som til slutt kan føre til inaktivering av ulike tumorsuppressorgener som; p16, p15 og /eller p53 [34], [35].
Videre basert på vår nåværende funn, innebærer RFC overekspresjon at uroteliale blære carcinoma ville være egentlig mer følsomme for antifolater mens ikke-uroteliale karsinom ville vise en dårligere respons på antifolat kjemoterapi. Dette spekulasjoner kan forklare hvorfor MVAC diett utstillinger bare begrenset antitumor aktivitet mot ikke-overgangsordning celle kreft mens responsrater opp til ~70% ble rapportert i TCC i samme studie [9].
Våre funn viser at RFC mRNA øket ekspresjon er ikke forbundet med tumor karakter eller stadium implisere at økt ekspresjon av RFC mRNA synes å skje tidlig i prosessen med flertrinns tumorprogresjon. Denne hypotesen er videre støttet av konsistent RFC mRNA uttrykk økning blant de ulike aldersgruppene i vår studie. Imidlertid har det blitt rapportert at bare ~15% av lavgradige overfladiske svulster vil fortsette å infiltrere muskulaturen og at høy grad av muskel-invasiv tumorer, enten stammer fra flat carcinoma in situ (CIS) /grov dysplasi eller oppstår
de novo product: [29]. Følgelig kan en alternativ hypotese er at øket RFC mRNA ekspresjon forekommer som en konsekvens av uavhengige hendelser blant de forskjellige typer av blære karsinomer. Interessant, alle ikke-uroteliale tumor biopsier benyttet i denne studien var muskel-invasiv peker til de ugunstige diagnostiske funksjoner i ikke-uroteliale svulster som allerede var foreslått av Erdemir
et al.
[19]. Den kliniske betydningen av plateepitel differensiering synes å være et ugunstig prognostisk funksjon på grunn av sin tilknytning til høy klasse invasive svulster.
Selv om en signifikant forskjell ble påvist mellom RFC uttrykk nivåer i bilharzial- og ikke-bilharzial-forbundet blære kreft , dette funnet kan ikke være avgjørende, siden bare 7 tilfeller (18% av total) av bilharzial-forbundet blærekreft ble inkludert i denne studien (jfr 32 ikke-bilharzial-assosiert tilfelle). Videre, jo høyere nivå av RFC mRNA uttrykk i BA-TCC (2 eksemplarer)
versus
SCC eller blandede typer (5 eksemplarer) kan også innebære at RFC økte mRNA uttrykket er faktisk uavhengig av bilharzial infeksjon.
Verdt å nevne (siden dette støtter relevans) er at egenskapene til blærekreft prøvene benyttes i denne studien var representative for blærekreftpasienter «befolkningen med hensyn til kjønn, alder og histologiske typer. Forholdet mellom female:male pasienter var ~1:3. Gjennomsnittsalderen for alle blærekreftpasienter inkludert i studien var 60, der gjennomsnittsalderen for de ikke-uroteliale grupper var lavere enn for uroteliale blære carcinoma pasienter (53
vs
60.) Indikerer aggressive arten av de ikke-urothelial varianter av blærekreft. I tillegg har 64% av pasientene hadde urothelial karsinomer, mens bare 24% presentert med de ikke-urothelial varianter. Disse demografiske data var i samsvar med skiftende mønster av blærekreft i Egypt tidligere rapportert av Felix
et al.
I 2008 [5], og dermed fremhever fremveksten og utbredelsen av overgangscelletype og tilbaketrekking av non-uroteliale typer.
Sikkert, kan RFC uttrykk anses som et tveegget våpen (figur 2). Økt RFC uttrykk ville fremme kjemosensitivitet til antifolater stund, utvider intracellulær folat basseng størrelse; som kan føre til ervervet resistens. Denne oppfatningen er videre støttet av funn at tap av folat eksportører førte til motstand mot antifolater gjennom en utvidelse av størrelse folat bassenget [21]. Spesielt i blære carcinoma, Rady
et al.
, (Upubliserte resultater) rapporterte at BCRP (eksport mono-, di- og triglutamates av folater) uttrykk ble redusert, mens MRP3, som har begrenset evne til å eksportere bare monoglutamate folater, ble funnet å være overuttrykt [upubliserte arbeider ved Rady et al. 2009]. Videre MRP3 var signifikant høyere i urothelial i forhold til den ikke-urothelial blærekarsinom variant [upubliserte arbeider ved Rady et al. 2009]. Disse variasjoner i ekspresjonsnivåer av antifolater efflux pumper og innstrømning medføre at utnyttelsen av et panel av genetiske biomarkører for hver tumortype kan være mer hensiktsmessig for å definere respons på kjemoterapi snarere enn en enkelt uavhengig genetisk markør.
A diagram som viser den foreslåtte tveegget rolle RFC i kreft kjemoterapi. Økt uttrykk er prediktiv for antifolater (MTX) transport. Samtidig vil økt uttrykk av RFC føre til folat basseng utvidelse størrelse tvinge en negativ feedback-hemming på opptaket av antifolater.
Konklusjoner og fremtidige retninger
I denne studien var forpliktet seg til å undersøke endringer i RFC uttrykk blant de forskjellige varianter av blære karsinomer. RFC mRNA uttrykk ble vist å være typeavhengig, men scenografiske og grade-uavhengig. Selv om differensiering mellom urothelial og ikke-uroteliale blære karsinom kan gjøres ved mikroskopisk undersøkelse, vil vårt endelige mål er å integrere molekylær diagnostikk i klinisk praksis. Prospektiv evaluering av et panel av folat transportører (som, RFC, BCRP og MRP3), kan forutsi respons på antifolat terapi, foreslå nye terapeutiske strategier og dermed forbedre behandlingsresultatet for enkelte pasienter med blærekreft. Forskjellene er beskrevet mellom uroteliale og ikke-uroteliale karsinom i blæren kan reflektere ulike årsaker og /eller risikofaktorer. En større studie designet for å gi korrelasjoner av omfanget av RFC metylering med clinicopathological egenskaper som alder, kjønn, histologisk grad, scene, og progresjon kan gi nyttig tilleggsinformasjon om etiologien av RFC endret nivåer av uttrykk mellom ulike typer av blærekreft. Andre kjente DNA metylering mål i blære kan også være inkludert for å se effekten av høyere uttrykk av RFC og høyere folat transport på DNA metylering.
Hjelpemiddel Informasjon
Figur S1.
RNA Quality Assessment. Agarosegelelektroforese av total RNA minipreps. Eksemplarer «felt er merket i henhold til deres kodenummer tildelt dem etter samlingen. Observerer skarpe band av 28S rRNA (4,8 kb) og 18S rRNA (1,8 kb) var indikasjon for intakt RNA (T82, T65, S22 og T38). S22 og S38 inneholde spor av genomisk DNA, men de RFC og β-aktin-primere ble utformet for å strekke seg over exon /intron knutepunkt for å minimalisere genomisk DNA-amplifikasjon. T118 viste delvis nedbrytning men 28S og 18S bandene var veldig svak; den totale RNA utbyttet av T118 var bare to mikrogram. T107 viste degradert RNA og ble utelukket fra videre analyse. RNA (piler) og DNA-størrelsesmarkører (1031-1080 bp) ble inkludert for sammenligning. Dette bildet ble fotografert med UVIsoft bildet oppkjøpet system (Tokyo, Japan)
doi:. 10,1371 /journal.pone.0021820.s001 plakater (TIF)
Figur S2.
Melting Curve Analyser. Smelte kurve analyse for å demonstrere primere «spesifisitet. Panel A: Dye fluorescens faller raskt når den DNA smelter. Smeltepunktet er definert som det vendepunkt av smeltekurve, som er lettest bestemt som maksimum i det negative første deriverte av smeltekurven. De dissosiasjon kurvene for både målet (RFC) og referanse (ACTB) gener er vist. Hvert produkt viser en enkelt skarp topp som indikerer spesifisiteten av primerparene og fravær av primer-dimerer eller ikke-spesifikke amplifiseringsprodukter. NTC enten ikke registrere en Ct-verdien eller registrert Ct-verdier i området mellom (35-38) som avviker med mer enn 5cycles fra det høyeste Ct verdien registrert av prøvene (ikke vist). De flate kurver av ROX passiv fargestoff indikerer ingen spiking (ikke vist). Panel B: agarosegelelektroforese av konvensjonell PCR-produktet som bruker Reverse transkribert cDNA av en tumorprøve (T42) og revers transkribert cDNA av kalibrator (kommersielt tilgjengelig, normal blære RNA, Clonetech). Enkelt band av de riktige størrelser for RFC og referanse genet viser spesifisiteten av produktene
doi:. 10,1371 /journal.pone.0021820.s002 plakater (TIF)
Tabell S1.
Kliniske kjennetegn ved pasienter med blærekreft.
doi: 10,1371 /journal.pone.0021820.s003 plakater (XLS)
Takk
Vi setter stor pris på støtten fra Prof. Ashraf Zaghloul og Dr. Ahmed Moustafa av National Cancer Institute, i forsyne blæren kreft pasientprøver. Vi takker Prof Raid Amin, direktør for UWF statistiske Consulting Services, for hans hjelp med statistisk analyse av resultatene. Prof Stephen Bustin og Prof. Sanaa Eissa bidratt gjennom mange fruktbare diskusjoner, og utdypet mange aspekter av RT-qPCR. Vi er også takknemlige for å Shady Saad og Deena Amr for deres hjelp med å etablere metoder og eksperimentell design av studien.
