Abstract
Bakgrunn
Den molekylære anstand HSP90 er et lovende nytt mål i kreftbehandling og selektive HSP90-hemmere er for tiden i kliniske studier. Tidligere har disse inhibitorer har blitt rapportert å indusere enten cellesyklus-stans eller celledød i kreftceller. Hvorvidt cellesyklus arrest er reversibel eller irreversibel har generelt ikke blitt vurdert. Her har vi undersøkt i detalj cellesyklus arrest og celledød responser på menneske småcellet lungekreft cellelinjer til HSP90 hemming.
metodikk /hovedfunnene
I MTT analyser, småcellet lungekreft celler viste en bifasisk reaksjon på HSP90 hemmere geldanamycin og radicicol, med lave konsentrasjoner forårsaker spredning arrest og høye konsentrasjoner forårsaker celledød. Vurdering av HSP90 intracellulær aktivitet ved hjelp tap av klient protein uttrykk viste at geldanamycin konsentrasjoner som hemmet HSP90 korrelert tett med de som forårsaker spredning arrest, men ikke celledød. Utbredelsen rest indusert ved lave konsentrasjoner av geldanamycin ble ikke reversert i en periode på over tretti dager etter legemiddel fjerning og viste trekk ved begynnende alderdom. Sjeldne bestander av variant småcellet lungekreft celler kan bli isolert som hadde flere genetiske forandringer og ikke lenger gikk irreversible spredning arrest i respons til HSP90 hemmere
Konklusjon /Betydning
Vi konkluderer med at:. ( 1) HSP90 inhibering induserer primært for tidlig senescens, snarere enn celledød, i små celle lungecancerceller; (2) småcellet lungekreft celler kan omgå dette alderdom gjennom ytterligere genetiske endringer; (3) HSP90-inhibitor-indusert celledød i småcellet lungecancerceller er grunnet hemming av en annen enn cytosoliske HSP90 mål. Disse resultatene har implikasjoner med hensyn til hvordan disse hemmere vil oppføre seg i kliniske studier og for utformingen av fremtidige hemmere i denne klassen
Citation. Restall IJ, Lorimer IAJ (2010) Induksjon av Prematur Senescence av HSP90 Hemming i småcellet lungekreft. PLoS ONE 5 (6): e11076. doi: 10,1371 /journal.pone.0011076
Redaktør: Mikhail V. Blagosklonny, Roswell Park Cancer Institute, USA
mottatt: 07.12.2009; Godkjent: 17 mai 2010; Publisert: 11 juni 2010
Copyright: © 2010 Restall et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet med tilskudd til IL fra den kanadiske Institutes of Health Research (tilskudd number62797) (https://www.cihr-irsc.gc.ca/e/193.html) og den kanadiske Cancer Society (tilskudd nummer 020 121) (http 😕 //www.cancer.ca/canada-wide.aspx sc_lang = no). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
HSP90 fungerer som anstand i normale celler, fremme riktig folding av både nye syntetiserte proteiner og proteiner som har blitt delvis denaturert på grunn av stress [1]. Det synes å være primært involvert i sene stadier av folding, sannsynligvis ved å anerkjenne eksponerte hydrofobe overflater på delvis foldet proteiner. Den grunnleggende mekanismen for HSP90-fremkalt proteinfolding omfatter konformasjonelle veksling mellom åpen og lukket konformasjoner som er regulert av ATP-hydrolyse [2]. Utbredelsen av HSP90 ATP-hydrolyse blir styrt i sin tur ved sin tilknytning til ulike cochaperones.
Selv om antall proteiner som er kjent for å kreve HSP90 for korrekt folding fortsetter å øke, er HSP90 klart selektiv for en undergruppe av cellulære proteiner. Disse omfatter en rekke proteiner med kjent onkogen aktivitet, inkludert Her2, Raf1 og Cdk4 [3]. I noen tilfeller HSP90 viser preferensiell assosiasjon med det mutante, onkogene former av proteiner; Dette er vist for både Src-kinase og EGF-reseptoren [4] – [6]. HSP90 viser også en økt tilknytning cochaperones og høyere ATPase aktivitet i kreftceller, både
in vitro Hotell og
in vivo product: [7]. Av disse grunner er det betydelig interesse for HSP90 som et mål for kreftbehandling.
Geldanamycin og radicicol er to strukturelt urelaterte naturlige produkter som binder seg til ATP-bindingssetet av HSP90, blokkerer conformational sykling som er nødvendig for sin anstand aktivitet. Disse forbindelser viser god selektivitet for HSP90, selv om de også bindes til HSP90 endoplasmatiske retikulum paralog Grp94 og HSP90 mitokondrielle paralog Trap1 ved høyere konsentrasjoner [8] – [10]. Selv om disse forbindelser etablere i prinsipp som HSP90 er en «druggable» mål fra en farmakologi perspektiv, dårlig oppløselighet og ikke-spesifikke toksisitet gjør dem uegnet for bruk i mennesker. Derivatiserte versjoner av geldanamycin har blitt produsert som har forbedret farmakologiske egenskaper, selv om de fortsatt har noen av begrensningene av modersubstansen [11]. På tross av dette, er det bevis fra noen forsøk som HSP90-hemming er oppnåelig, basert på biomarkør analyse i pasientens lymfocytter [12], [13] og tumorprøver [14]. Det er også noen bevis for kreft aktivitet [15]. Nylig nye HSP90-inhibitorer har blitt utviklet som ikke har begrensningene av tidligere forbindelser, og disse er nå inn i kliniske forsøk [11]. Med disse fremskritt i farmakologi av HSP90 hemming, vil en kritisk nytt område av etterforskningen være å identifisere undergrupper av kreftpasienter som er mest sannsynlig å dra nytte av HSP90 hemming.
Lungekreft er den største årsaken til kreft dødsfall verdensomspennende. Ca 15% av lungekreft er av en undertype kjent som småcellet lungekreft. Dette kreft presenterer vanligvis som metastatisk sykdom, og er vanligvis ikke behandles med kirurgi. Småcellet lungekreft generelt reagerer svært godt til stråling og kjemoterapi i utgangspunktet, men de fleste av pasientene tilbakefall med resistent sykdom og dø innen to år [16]. Flertallet av småcellet lungekreft har nevroendokrine egenskaper og aktivt utskiller polypeptidhormoner [17]. Disse skilles hormoner føre til en rekke paraneoplastic syndromer som er felles komplikasjoner av småcellet lungekreft.
Her har vi undersøkt responsen av småcellet lungekreft celler til HSP90 hemming. En tidligere studie har vist at HSP90-inhibitorer indusere celledød i små celle lungekreft celler via aktivering av den intrinsiske reaksjonsvei av apoptose [18]. Våre funn er i overensstemmelse med dette, men vi observert at celledød bare forekommer ved konsentrasjoner langt høyere enn det som kreves for inhibering av cytosolisk HSP90. Vi ser at behandling av småcellet lungekreft celler med HSP90-hemmere ved konsentrasjoner som er tilstrekkelige til å hemme cytosolic HSP90 induserer tidlig alderdom snarere enn celledød.
Resultater
Response av menneskelig småcellet lungekreft cellelinjer til HSP90 hemming
Den menneskelige småcellet lungekreft cellelinje H69 viste en bifasisk respons på behandling med en rekke geldanamycin konsentrasjoner (Figur 1a). I en MTT analyse, en 48 timers eksponering av celler til 0,1 uM geldanamycin redusert levedyktige celler med omtrent 40%. Ved å øke konsentrasjonen av geldanamycin til opp til 3 uM ikke føre til en ytterligere reduksjon i levedyktige celler. Med konsentrasjoner av geldanamycin 4 uM, antallet av levende celler H69 redusert til i det vesentlige null. Radicicol, en andre HSP90-inhibitor som er strukturelt relatert til geldanamycin, også ga et tofase-doseresponskurve med H69-celler, men med en mindre tydelig platåfasen (figur 1B). To andre småcellet lungecancercellelinjer (H187 og H889) også viser en bifasisk respons til geldanamycin (figur 1C og D); men U87MG glioblastoma cellelinje viste bare den første fase av denne reaksjon (
dvs.
. fase sees ved lave konsentrasjoner geldanamycin) (figur 1E).
A, MTT analyse av H69-celler behandles med geldanamycin i 48 timer; B, MTT-analyse av H69-celler behandlet med radicicol i 48 timer; C, MTT analyse av H187 småcellet lungekreft celler med geldanamycin for 12, 36 og 60 timer; D, MTT-analyse av H889-celler behandlet med geldanamycin i 48 timer; E, MTT-analysen av U87MG glioblastom celler behandlet med geldanamycin i 48 timer; F, H69-celler behandlet med geldanamycin i 48 timer og analysert for levedyktige (○) og total (•) celletellinger ved bruk av en Vi-celle XR celleviabilitet analysator. Feil linjer viser gjennomsnitt ± SE av tre gjentak.
Som den første fasen kan være potensielt skyldes enten hemming av celleproliferasjon eller selektiv avliving av en undergruppe av SCLC celler, ytterligere analyser ble utført for å skille mellom disse mulighetene. Responsen fra H69-celler til behandling med et utvalg av geldanamycin konsentrasjonene ble analysert ved celletall, ved hjelp av trypanblått-utelukkelse å skille levende celler fra døde celler (figur 1F). Det levende celletellinger viste også en bifasisk respons når undersøkt ved denne metode. Totale celletellinger var lik leve celletall i den første fase av tofase-responskurve, men skilt i den andre fase. Disse data viser at geldanamycin induserer hovedsakelig proliferasjon arrest i H69-celler ved lave konsentrasjoner, men induserer celledød ved høye konsentrasjoner. Dataene i figur 1C, som viser MTT analyser på H187 celler behandlet for ulike tidsperioder (12, 36 og 60 h) med geldanamycin, er i samsvar med denne konklusjonen, som den første fasen er bare tydelig med lengre behandlinger der det er tid for sterk celleformering til å finne sted i kontrollen. Dette viser også at celledød ved høye geldanamycin konsentrasjoner skjer relativt raskt (
dvs.
på mindre enn 12 timer).
Response av H69 celler etter seponering av HSP90 hemming
spredning arrest utløst av legemidler kan være reversible eller irreversible (
dvs.
senescence-lignende). For å skille mellom disse muligheter, ble H69-celler behandlet med ulike konsentrasjoner av geldanamycin i to dager. Stoffet ble deretter fjernet, og levedyktige celler ble overvåket. Celleproliferasjon utvinnes fra behandling med geldanamycin konsentrasjoner på 50 nM eller mindre. Imidlertid, etter behandling med 100 nM geldanamycin, en populasjon av levedyktige celler forble som ikke øke over en tidsperiode på mer enn tretti dager etter fjerning av medikament (figur 2A). Lignende resultater ble oppnådd med H187 og H889 småcellet lungecancercellelinjer (figur 2B og fig S1A) og i H69-celler behandlet med den klinisk relevant HSP90-inhibitor som 17-AAG (figur 2C). H69-celler kreves et minimum av 24 timer med eksponering for geldanamycin å indusere proliferasjon irreversible rest (figur 2D) og induksjon av proliferasjon irreversibel rest var upåvirket av caspase-hemming (figur 2E). For sammenligning ble samme forsøk ble utført på U87MG human glioblastoma cellelinje (figur 2F). Disse cellene gjenopprette vekst etter behandling med 100 nM geldanamycin og også gjenopprette fra en behandling med en ti ganger høyere konsentrasjon av geldanamycin. Den vedvarende spredning rest indusert av geldanamycin er derfor ikke en universell reaksjon av kreftceller, men snarere er kreft celle- typespesifikk.
Cellene ble behandlet i 48 timer med den angitte konsentrasjon av inhibitor som deretter ble fjernet. Levedyktige celler ble deretter bestemt ved de indikerte tidspunkter etter inhibitor fjerning. A, H69-celler behandlet med geldanamycin; B, H187 celler behandlet med geldanamycin; C, H69 celler behandlet med 17-AAG. D, H69-celler behandlet med 100 nM geldanamycin til 4, 12 eller 24 timer. E, H69-celler ble behandlet i 48 timer med 100 nM geldanamycin i fravær eller nærvær av 100 pM Z-VAD-FMK, en generell kaspaseinhibitor. Z-VAD-FMK behandling ble startet 1 time før tilsetning av geldanamycin. F, U87MG celler behandlet med geldanamycin.
For å bekrefte vedvarende vekst arrestasjonen av en annen metode, inkorporering av BrdU i H69 celler som hadde vært utsatt for 100 nM geldanamycin ble også vurdert. I samsvar med levedyktige celler, denne analysen viste at H69 cellene ikke klarte å gjenopprette sin proliferative kapasitet etter geldanamycin fjerning (figur 3A).
A. H69-celler ble behandlet i 48 timer med 100 nM geldanamycin. Geldanamycin ble deretter fjernet. Seks eller åtte dager etter legemiddel fjerning, ble 25.000 behandlede celler (GA) per brønn sådd ut i nittiseks-brønners plater sammen med det samme antall ubehandlede H69-celler for sammenligning (ingen GA). Celler ble tillatt å opptak BrdU i 16 timer og BrdU-inkorporering ble deretter analysert som beskrevet i Materialer og Metoder. Resultater ble normalisert til verdiene for ubehandlede celler. Dataene som vises er gjennomsnittet ± SD av seks replikater. B. Cellene ble behandlet i 48 timer med geldanamycin. Totale cellelysater ble deretter samlet og analysert ved Western blotting ved anvendelse av antistoffer mot de angitte proteiner. Det nederste panel viser en blot farget for totalt protein med amido-svart før antistoff inkubasjon. Like mengder av DMSO ble tilsatt til cellene for hver behandling, bortsett fra i den ytterste venstre felt, hvor DMSO ble utelatt.
Endringer i HSP90 klient proteiner og varmesjokkproteiner i respons til HSP90 inhibering
effekten av ulike konsentrasjoner av geldanamycin på kjente HSP90 klienter ble også vurdert i H69 celler (Figur 3B, høyre fire baner av blot). Betydelig nedbryting av HSP90 proteinene klient Cdk4 og Raf1 ble sett ved geldanamycin konsentrasjoner så lave som 50 nM. En annen vel beskrevne reaksjon av celler til HSP90 inhibisjon er induksjon av andre varmesjokkproteiner som oppstår via aktivering av Hsf1 [19]. Som med klient protein responser, geldanamycin konsentrasjoner så lave som 50 nM forårsaket økninger i Hsp70, Hsp27 og Hsp90α /β. Disse geldanamycin konsentrasjoner parallelt de som forårsaker spredning arrest, men er omtrent 100 ganger mindre enn de konsentrasjoner som forårsaker betydelig celledød.
U87MG og H69 celler viste svært like sensitiviteter til geldanamycin med hensyn til klienten protein minker og varmesjokk protein øker (figur 3b). Dette indikerer at forskjellen i oppførsel mellom H69 og U87MG-celler etter fjerning av geldanamycin ikke er en følge av forskjeller i legemiddelmetabolisme (
f.eks
multimedikamenttransportøraktivitet eller diaforase aktivitet, som begge påvirker geldanamycin aktivitet [20], [21]). Heller det ut til at de forskjellige reaksjoner i disse celler etter tilbaketrekking av geldanamycin skyldes forskjeller som er på nedstrømssiden av HSP90-inhibering. Western blot analyse bekreftet at H69 celler manglet påvisbar p53 (figur 3B), i samråd med Smith
et al
., Som viste at det er en stopp mutasjon i
P53
ekson 5 i denne cellen linjen [22]. p16INK4a var til stede i H69 celler og dens nivåene var upåvirket av behandling med geldanamycin i 48 timer (Figur 3B).
Senescence markører i vekst arrestert småcellet lungekreft celler
irreversible spredning arrest indusert av HSP90-inhibering i små celle lungecancerceller antydet at disse cellene var blitt senescent. For å vurdere dette nærmere, ble flere markører for senescence vurdert. Figur 4A viser morfologi av suspensjonskulturer av ubehandlede H69 celler åtte dager etter geldanamycin fjerning. Behandlede cellene vise noen utvidelse og økt cytoplasmisk detalj, karakteristiske trekk ved senescent celler. Et annet fellestrekk ved senescent celler er tilstedeværelsen av senescence-assosiert heterochromatin foci (SAHF) [23]. I samsvar med begynnende alderdom induksjon, hemming av HSP90 med geldanamycin førte til dannelsen av SAHF i H69-celler som demonstrert ved DAPI-farging (figur 4B). SAHF ble opprettholdt etter fjernelse av geldanamycin, som forventet for en begynnende alderdom markør og ble anriket i histon H3 trimetylert på lysin 9, i samsvar med tidligere studier (fig S1B) [24]. Aktivering av en DNA-skade reaksjon er et viktig trekk ved både replikative og for tidlig senescens som bidrar til vekststans fenotypen til senescent celler [25]. Et sentralt trekk ved DNA skade svaret er den generasjonen av fosforylert histon H2AX (γH2AX) på områder som grenser til DNA-skader. Begge geldanamycin og radicicol behandlinger økte nivåer av γH2AX i H69 celler (Figur S1C). γH2AX nivåene forble forhøyet i inntil seks dager etter geldanamycin fjerning, den lengste tidspunkt vurdert (Figur 4C). Dette er konsistent med rapporter om at senescent cellene opprettholde aktivert DNA-skade respons for en lengre periode etter induksjonen av senescens [25], [26].
A. H69-celler ble behandlet med DMSO alene eller 100 nM geldanamycin i 48 timer. Geldanamycin ble deretter fjernet. Åtte dager senere ble cellene lov til å bosette seg på poly-L-lysin-belagt Dekk, festes med paraformaldehyde og fotografert under fase kontrast ved hjelp av en 63X objektiv. B. SAHF Dannelse etter behandling av celler med HSP90-inhibitorer. H69-celler ble behandlet med DMSO eller 100 nM geldanamycin i 48 timer. Celler ble deretter fiksert, farget med DAPI og undersøkt ved fluorescens mikroskopi. C. H69-celler ble behandlet med DMSO (kontroll) eller 100 nM geldanamycin. DMSO og geldnamycin ble deretter fjernet på dag 0. Totalt cellelysater ble samlet på de angitte dager etter geldanamycin fjerning og analysert for γH2AX og H2AX nivåer ved Western blotting. Grafen viser densitometry for Western blot analyser av tre biologiske replikater. Data ble normalisert til bilens behandlede kontrollceller og er vist som gjennomsnitt ± SE.
Isolering av variant H69 celler som omgår geldanamycin-induced senescence
Mens H69 celler opprettholdt en spredning arrestert staten for mer enn tretti dager etter fjerning av geldanamycin, etter omtrent førti dager en populasjon av celler gjorde begynner å spre seg i ett eksperiment. Vi har utpekt denne populasjonen som H69 /41d celler. H69 /41d celler har en distinkt morfologi: H69 mens cellene er ikke-adhererende celler som danner fillete aggregater, variant cellene, samtidig som ikke-klebende, danner tette sfærer som minner om det som ses med stamcellepopulasjoner (figur 5A). Ved retesting, disse cellene fremdeles gikk spredning arrest i respons til 100 nM geldanamycin, men var i stand til å gjenopprette proliferativ kapasitet ved fjerning av narkotika, i likhet med hva vi har observert i glioblastom celler (figur 5B). H69 /41d celler var også i stand til å gjenopprette proliferativ kapasitet etter behandling med HSP90 inhibitor radicicol (figur 5C). I forhold til det overordnede H69 cellelinje, H69 /41d-celler viste lignende responser til HSP90 inhibering med hensyn til spredning inhibering i nærvær av medikament, selv om celledød tendens til å forekomme ved noe lavere konsentrasjoner enn sett med H69-celler (figur 5D). Degradering av klient proteiner og induksjon av andre varmesjokkproteiner ble også lik i de to cellelinjer (figur 6A). Som ovenfor, regler dette ut forskjeller i legemiddelbehandling mellom de to cellepopulasjoner, og indikerer at forskjellene skyldes hendelser nedstrøms av HSP90 hemming som spesifikt påvirker hvorvidt celler gjennomgå reversibel eller irreversibel spredning arrest. SAHF formasjonen ble også svekket i H69 /41d celler (Figur 6b). I H69 celler, ble SAHF oppdaget maksimalt hos omtrent 35% av celler (figur 6C). I motsetning til dette, geldanamycin behandling bare forårsaket en beskjeden økning i SAHF i H69 /41d-celler og SAHF ble detektert i 4,5% av cellene maksimalt (figur 6C).
A. Fotografier av H69 og H69 /41d cellene under fase mikroskopi, ved lave (øverst paneler) og høy (bunn paneler) forstørrelse; B. H69 og H69 /41d-celler ble behandlet med 100 nM geldanamycin i 48 timer. Geldanamycin ble deretter fjernet, og antallet av levende celler ble vurdert ved de angitte tider etter medikament fjerning. C. H69 og H69 /41d-celler ble behandlet med 5 uM radicicol i 48 timer. Radicicol ble deretter fjernet, og antallet av levende celler ble vurdert ved de angitte tider etter medikament fjerning. D. MTT analyse av H69 /41d celler behandlet for 48 timer med geldanamycin.
H69 og H69 /41d celler ble behandlet i 48 timer med geldanamycin eller DMSO som kjøretøy kontroll. A. Totale cellelysater ble samlet etter 48 timers behandling, og analysert ved Western blotting som i Figur 3. B. DMSO-behandlede celler ble farget for SAHF 2 dager etter fjerning av DMSO. Geldanamycin-behandlede celler ble farget for SAHF 2, 4 og 6 dager etter medikament fjerning. Representative fluorescens mikroskopi bilder av H69 og H69 /41d cellekjerner, seks dager etter fjerning av geldanamycin, vises. C. SAHF i H69 (lys grå) og H69 /41d celler (mørk grå) ble talt på de angitte ganger etter narkotika fjerning. Data er uttrykt som prosent av kjerner som er SAHF positive. Linjer viser gjennomsnittlig prosent ± SE. D. Totalt celle ekstrakter av ubehandlet H69 og H69 /41d celler ble analysert for ekspresjon av p21 protein ved Western blotting.
For å vurdere direkte genetisk forholdet mellom H69 celler med H69 /41d celler, DNA var isolert fra begge cellelinjene og analysert ved hjelp av Affymetrix Genome-Wide Menneskelig SNP Array 6,0 chips, som inneholder prober for 900.000 enkeltnukleotidpolymorfi og et tilsvarende antall sonder for å vurdere kopiantall variasjon. Fig S2 viser Karyotyper av de to cellelinjene rekonstruert fra disse data (hver blir sammenlignet med en referanse Affymetrix karyotype). H69 celler viser omfattende kromosomavvik som forventet for kreftceller. Disse tap, gevinster og regioner av forsterkning /kopiantallet variasjon er svært lik mellom H69 og H69 /41d celler, viser utvetydig at de er clonally relaterte. Noen forskjeller var tydelig mellom de to cellelinjer. Disse inkluderer en 4,8 MBP sletting på én kopi av kromosom 2 som inneholder omtrent nitten gener og en 9,6 MBP sletting på en kopi av kromosom 11 som inneholder ca 83 gener. Det er også en gevinst på den lange arm av kromosom tre og et tap av en delvis lange arm av kromosom 15. Men den SNP /kopi nummer analyse ikke peke på en enkelt definert genetisk locus som kan forklare hvorfor H69 /41d celler i stand til å unngå HSP90 inhibitor-induced senescence. Som en annen metode for å bestemme den mekanismen som disse cellene unngå HSP90-inhibitor-indusert senescens, ble cellene undersøkt for et antall proteiner som tidligere har vist seg å ha viktige roller i begynnende alderdom. P21 (CDKN1A, p21Waf1 /Cip1) er et slikt protein som er av spesiell interesse da det har vist seg å indusere senescens i kreftceller som mangler p53 [27]. p21 er uttrykt i H69-celler, men ikke påvises i H69 /41d-celler (figur 6D). Gitt den kjente rolle ved induksjon og opprettholdelse av senescens [26], tap av p21-ekspresjon gir en plausibel forklaring på svikt i H69 /41d-celler til å gjennomgå senescens i respons til HSP90-inhibitorer.
diskusjon
i tidligere studier har oftest beskrevet respons av kreftceller til HSP90 hemming vært cellesyklus arrest. Denne cellesyklus arrest har generelt vært antatt å være reversibel i naturen, selv om de fleste studiene ikke ta dette direkte. Vekststans kan skje ved enten G1 /S eller G2 /M overgang [28], [29] og er sannsynlig å være en konsekvens av HSP90 avhengighet av proteiner som CDK4, cdc2 og polo-lignende kinase [30] – [ ,,,0],32]. I en undergruppe av kreftcelletyper, har HSP90-inhibitorer blitt vist å indusere apoptose. Disse inkluderer småcellet lungekreft celler og multippelt myelom celler [18], [33].
Bortsett fra forbigående cellesyklus arrest og celledød, et tredje mobilnettet skjebne for kreftceller er begynnende alderdom. For kreftceller, er det noen ganger referert til som «tidlig» eller «akselerert» cellulær senescens å skille det fra den replikative senescens at normale celler gjennomgår når det når sin grense Hayflick [34], [35]. Senescens i kreft har blitt studert i to sammenhenger: den første av disse er den begynnende alderdom sett i respons til onkogen aktivering, hvor det kan spille en rolle i å beskytte organismer fra å utvikle kreft; den andre av disse er som en respons på kreftbehandling [36]. Kjemoterapi agenter som skader DNA ser ut til å indusere senescence i mye større grad enn agenter som er rettet mot mikrotubuli [37]. Dette er mer sannsynlig til å skje med eksponering for lavere doser av stoffet, med høyere doser forårsaker apoptose. Kjemoterapi-indusert senescence er observert både i cellekultur og i dyremodeller [38].
Nøkkelen, definerende trekk ved senescent celler er at de forblir metabolsk aktiv, men gjennomgår en vedvarende tilbaketrekning fra cellesyklusen som er reverseres ved hjelp av standard mitogene stimuli. Etter forbigående eksponering for lave konsentrasjoner av geldanamycin, småcellet lungekreft celler forble i live og metabolsk aktiv (som indikert av trypanblått eksklusjon og MTT-analyser). Men disse cellene gjennomgikk en spredning rest som ble opprettholdt i mer enn tretti dager, på tross av den vanlige tilsetningen av friskt medium inneholdende føtalt kalveserum, en rik kilde av mitogener. Arrestasjonen spredning var tydelig både fra levende celletall og fra BrdU inkorporering analyser.
I tillegg til permanent arrest spredning, har flere markører for senescence blitt utviklet, selv om ingen av disse er i dag sett på som en definitiv markør for den senescent staten [39]. Et karakteristisk sett av morfologiske endringer har blitt beskrevet for senescent celler som omfatter celle-utvidelse og en øket granularitet av cytoplasma [40]. Disse funksjonene var tydelig i H69 småcellet lungekreft celler der vedvarende spredning arrest hadde blitt indusert av HSP90 hemmere. (De ikke viser utflatningen beskrevet for adherente celler, som de små celle lungecancerceller anvendt i denne studien vokse i suspensjon.) SAHF er en annen markør som vanligvis observeres i senescent celler, og som er tenkt å ha en rolle i å opprettholde senescent fenotype. SAHF var tilstede i småcellet lungekreft celler der vedvarende spredning arrest hadde blitt indusert av HSP90 hemmere. Ekspresjon av SAHF ble opprettholdt i opp til seks dager etter fjerning av HSP90-inhibitor (de lengste tidspunkt undersøkes) og tidsforløpet for deres utseende ble i likhet med tidligere studier på induksjon av for tidlig senescens av forskjellige midler [41], [42] . Aktivering av DNA-skade responsen er også ofte observert i begynnende alderdom, hvor den har en rolle i både initiering og opprettholdelse av den senescent fenotype [25], [26]. HSP90-hemmere (både geldanamycin og radicicol) aktivert en DNA-skader svar som ble opprettholdt etter hemmer fjerning. Dette funn er også i overensstemmelse med en begynnende alderdom fenotype og tilveiebringer en mekanisme ved hvilken disse inhibitorene aktivere begynnende alderdom.
DNA-skade, enten telomeric eller ikke-telomeric, er den mest karakteriserte induser av senescens. I tillegg til å være en markør for begynnende alderdom, aktivering av DNA-skade reaksjon av HSP90-inhibitorer tilveiebringer også en mekanisme ved hvilken de induserer senescens i små celle lungecancerceller. Tidligere studier har også pekt på en sammenheng mellom HSP90 og DNA-skader. Både telomerase og Fanconi anemi DNA skade respons vei er avhengig av HSP90 for deres aktivitet [43], [44]
Senescence-forbundet β- galaktosidase (SAβgal) har også vært mye brukt som en begynnende alderdom markør [35]. SAβgal aktivitet blir detektert som en følge av utvidelsen av det lysosomale rom i senescent celler, men er ikke nødvendig for begynnende alderdom induksjon eller opprettholdelse [45]. Småcellet lungekreft celler behandlet med HSP90 hemmere var ikke positivt for SAβgal. Adriamycin heller ikke indusere SAβgal i småcellet lungekreft celler når den brukes i konsentrasjoner som forårsaket denne markøren i andre kreftcelletyper. Dette tyder på at SAβgal ikke kan være en nyttig markør for begynnende alderdom i småcellet lungekreft. En mulig forklaring er at disse cellene har snaut cytoplasma og er spesialiserte sekretoriske celler som kan ha en relativt liten lysosomale.
Til sammen ovennevnte data viser at HSP90 hemmere induserer en vedvarende spredning arrest som har funksjoner i samsvar med tidlig alderdom. Dette for tidlig senescens oppsto ved konsentrasjoner på geldanamycin som korrelerte nøye med de konsentrasjoner som er nødvendige for å indusere nedbrytningen av veletablerte HSP90 klient proteiner og for å indusere ekspresjon av andre varmesjokkproteiner (en mye brukt markør av HSP90-hemming). For tidlig alderdom ble også indusert av 17-AAG (tanespimycin, 17-allylamino-17-demethoxygeldanamycin), en geldanamycin derivat som har blitt testet i kliniske studier [46]. 17-AAG indusert senescens ved en konsentrasjon som er lik konsentrasjonen oppnådd i plasma hos pasienter som ble behandlet ved den maksimale tolererte dose av denne forbindelse [12], som tyder på at denne responsen er klinisk relevant. Senescens induksjon av HSP90-inhibitorer krever hverken p53 eller Rb, da begge disse tumor-suppressorer er kjent for å være mutert i H69 cellelinje som brukes i denne undersøkelsen.
I noen forsøk populasjoner av celler som gjorde begynner å vokse etter langsiktig kultur for senescent H69 celler. En av disse cellepopulasjoner, betegnet H69 /41d, ble karakterisert i detalj. SNP og kopiantall analyse av disse celler, viser at mens de er tydelig avledet fra H69-celler de har et distinkt sett av genetiske endringer. Disse celler viser lignende respons på HSP90-inhibering som moder H69-celler med hensyn til inhibering proliferasjon i nærvær av medikament og induksjon av celledød ved høye geldanamycin konsentrasjoner. Men de gjennomgår en reversibel, snarere enn irreversible spredning arrest i respons til HSP90 inhibering. H69 /41d celler viser også identiske svar på den overordnede cellelinje med hensyn til nedbrytning av HSP90 klient proteiner og induksjon av andre heat shock proteiner. Derfor er denne form for «motstand» til HSP90-inhibering er klart forskjellig fra det som er beskrevet i tidligere studier, hvor motstanden var på grunn av endringer i legemiddelmetaboliserende enzymer og er reflektert i et krav om høyere doser for å se cellulære effekter [47]. Isoleringen av disse cellene viser at, i prinsippet, kan små celle lungecancerceller med flere genetiske endringer unngå HSP90-indusert for tidlig senescens. p21 (CDKN1A) er tidligere blitt vist å være en viktig regulator av senescens, en egenskap som ser ut til å være uavhengig av dets hemmende aktivitet mot cyklin-avhengige kinaser [48]. p21 er regulert av både p53 og p53-uavhengige mekanismer og kan indusere sensescence i celler som mangler p53 (som tilfellet er for H69-celler) [27].
