Abstract
Tidligere studier har vist at DNA kan overføres fra døende konstruerte celler til nabocellene gjennom fagocytose av apoptotiske legemer, noe som fører til cellulær transformasjon. Her gir vi bevis for en opptak av apoptotiske-avledet livmorhalskreftceller ved menneskelige mesenchymale celler. Interessant, HeLa (HPV 18+) eller Ca Ski (HPV16 +) celler, husing integrert høyrisiko HPV DNA, men ikke C-33 A-celler (HPV), var i stand til å transformere mottakercellene. Humane primære fibroblaster oppslukt de apoptotiske legemer effektivt innen 30 minutter etter co-dyrking. Denne mekanismen er aktiv og involverer aktin cytoskjelettet.
In situ hybridisering
av transformerte fibroblaster avslørte tilstedeværelsen av HPV DNA i kjernen av en undergruppe av phagocytosing celler. Disse cellene uttrykte HPV16 /18 E6 genet, som bidrar til ødeleggelse av p53 /p21 vei, og cellene utstilt tumorigent fenotype, inkludert en økt spredning rente, polyploidi og forankring uavhengighet vekst. En slik horisontal overføring av virale onkogener til omkringliggende celler som mangler reseptorer for HPV kan rette utholdenhet av viruset, den viktigste risikofaktor for livmorhalskreftutvikling. Denne prosessen kan bidra til HPV-assosiert sykdomsprogresjon
in vivo
Citation. Gaiffe E, Prétet J-L, Launay S, Jacquin E, Saunier M, Hetzel G, et al. (2012) apoptotisk HPV Positive kreftceller Exhibit Trans Egenskaper. PLoS ONE 7 (5): e36766. doi: 10,1371 /journal.pone.0036766
Redaktør: Surinder K. Batra, University of Nebraska Medical Center, USA
mottatt: 19 juli 2011; Godkjent: 06.04.2012; Publisert: 04.05.2012
Copyright: © 2012 Gaiffe et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Stipend og arbeider ble støttet av offentlige midler fra «Region de Franche-Comté», «Institut National du Cancer» og «Ligue Contre le Cancer, Comité du Doubs». de bevilgende myndighet hadde noen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
konkurrerende interesser:.. forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Epidemiologiske og eksperimentelle studier har fremhevet at høy-risiko humane papillomavirus (HPV), særlig HPV 16 og 18, spiller en vesentlig rolle i induksjon av karsinomer i livmorhalsen [1], [2]. De mekanistiske aspekter av HPV-indusert karsinogenese er som oftest i forbindelse med sletting av E2 ORF som en konsekvens av viral DNA-integrasjon i vertsgenomet [3]. Dette fører til en deregulert ekspresjon av virale E6 og E7 gener, som representerer de viktigste transformerende gener. I hjertet av denne transformasjonen er bindingen av E6 til p53 og E6AP, noe som favoriserer p53-degradering [4] og ferd med retinoblastom-proteinet E7 komplekset pRb [5], noe som resulterer i dereguleringen av cellesykluskontroll, DNA-reparasjon og apoptose .
i løpet av svulst utvikling, en stor andel av cellene er tapt gjennom apoptose [6]. Slik celledød utløses av en rekke ekstracellulære signaler, inkludert vekst /overlevelsesfaktor uttømming, hypoksi og et tap av celle-matriks-vekselvirkninger, så vel som intracellulære signaler slik som DNA-skade [7]. Til slutt blir apoptotiske celler klarert av spesialiserte fagocyttiske celler som inaktivere og forringer deres cellulære komponenter [8]. Imidlertid kan apoptotiske celler også bli internalisert av ikke-spesialiserte mottakercellene. Således, fibroblaster er i stand til å sluke apoptotiske nøytrofiler [9], og lever endotelceller kan binde og fagocytosestimulerende lever apoptotiske legemer [10]. Gjennom denne endocytiske prosessen kan apoptotiske celler virke som en DNA-vektor, og den horisontalt overførte DNA kan gi en selektiv fordel til mottakercellen.
Horisontal genoverføring (HGT) har blitt godt dokumentert i prokaryoter og bidrar til evolusjon, økologi og antibiotikaresistens [anmeldt i [11], [12]]. Mens den horisontale overføring av genetisk informasjon mellom to eukaryoter har blitt rapportert i planter [13], [14] og virvelløse dyr [15], er det få studier fokusert på HGT mellom pattedyrceller. Utveksling av genetisk informasjon formidles av apoptotiske legemer har vist seg å forekomme mellom prostata kreftceller [16]. Den apoptotiske legemer av transformerte lymfoide celler som integrerte kopier av Epstein-Barr-virus kan også overføre virale DNA-sekvenser [17]. Tilsvarende er HIV-1-genene provirale overført til celler som mangler reseptorer for viral oppføring [18]. DNA har også blitt rapportert å bli overført fra apoptotiske H-ras
V12- og c-myc-transfekterte celler til p53 – /- mus embryonale fibroblaster, noe som fører til deres transformasjon [19]. På den annen side, phagocytosing celler som uttrykker p53 eller p21 ikke er omdannet, noe som tyder på en beskyttende mekanisme som styres av p53 sti [20]. Nylig, Ehnfors J.
et al.
Vist at fibroblaster og endotelceller er i stand til å anskaffe og å replikere H-ras
V12 og c-myc-DNA når apoptotiske tumorceller inneholder simian virus 40 stort T ( SV40LT) antigen [21]. Disse observasjonene gitt bevis for at transformasjonseffektiviteten er assosiert med ekspresjon av SV40LT inhibere p53 [22]. Fordi de fleste av livmorhals karsinomer uttrykke E6 viral oncoproteinet, som fremmer p53 degradering, som gjør SV40LT, vi hypotese at horisontal overføring av HPV-onkogener kan være en alternativ mekanisme for kreftutvikling.
Her presenterer vi bevis for at apoptotiske celler avledet fra livmorhals-avledet kreft celler som integrerte kopier av HPV er i stand til å forvandle humane primære fibroblaster (HPF). Vi viser videre at mottakeren tumorceller kan være preget av en høy grad av spredning og hyperploidy. I tillegg er den virale genetiske materiale inhibering av p53 /p21 sti uttrykt i transformerte celler. Så vidt vi vet, er dette den første rapporten fra transformasjon av humane primære celler gjennom opptaket av apoptotiske legemer fra HPV-infiserte livmorhalskreft celler.
Resultater
apoptotiske livmorhalskreft cellene er internalisert av fibroblaster
apoptose av livmorhalskreft donorceller ble indusert av UVB-stråling og staurosporin eksponering som tidligere beskrevet [23], [24] og ble dokumentert av en analyse av fosfatidylserin eksponering (annexin V flekker), DNA innhold ( propidiumjodidfarging) og kjerne fragmentering (DAPI-farging) (Methods S1 og figur S1A og S1B). Behandlingen resulterte i fravær av levende celler i stand til proliferasjon i løpet av de apoptotiske cellesuspensjoner (Methods S1 og figur S1C og SID). Tidligere studier har vist at apoptotiske legemer avledet fra EBV-bære B-lymfocytter kan overføre DNA ved hjelp av horisontale overføring, og at EBV-integrerte DNA kan fortrinnsvis overføres i forhold til cellulær DNA [17]. I denne studien, spurte vi om HPFS kunne sluke apoptotiske celler avledet fra livmorhalskreft cellelinjer HeLa (HPV18), Ca Ski (HPV16) og C-33 A (HPV), uansett virologisk status.
tilstedeværelsen av fluorescerende apoptotiske celler i mottakercellene ble bekreftet ved konfokal mikroskopi. Apoptotisk HeLa-celler som inneholder DNA som ble viklet inn i aktin cytoskjelettet av HPFS innen 48 timer (figur 1A). Apoptotisk Ca Ski og C-33 A-celler ble også tatt opp effektivt av mottakeren (figur 1B). Inkubasjon av HPFS alene eller sammen med supernatanten av apoptotiske celler resulterte ikke i cfda, SE (5- (og 6 -) – carboxyfluoresceine diacetat succinimidylester) farging, noe som tyder på en sammenheng mellom grønn fluorescens og tilstedeværelse av apoptotiske celler (figur 1B ). Ved å spore de fluorescerende fargestoffer på tidlige tidspunkter (fra 1 time til 3 timer), observerte vi actin rekruttering når apoptotiske celler ble bundet til HPFS (figur 1Ci, hvit pil). Fibroblast membranen utvides rundt begge sider av den apoptotiske cellen gjennom aktin polymerisasjon (figur 1Cii, hvite piler). F-aktin deretter omgitt av apoptotiske celler til å danne en fagocytisk kopp og lukket i en ring (figur 1Ciii). Disse mikroskopiske observasjoner indikerer fagocytose, selv om vi ikke har spesielt preget denne mekanismen [25], [26]. Ved hjelp av spesifikke markører for intermediate filamenter for hver celletype, fikk vi bekreftet at de apoptotiske celler var epitelceller (cytokeratin positiv) som ble internalisert av fibroblaster (vimentin positiv) (figur 1D). Bruk av kvantitativ tilnærming av flowcytometri, vurdert vi andelen HPFS som omsluttet de fargede apoptotiske carcinoma celler. Uavhengig av hvilken type av apoptotiske celler anvendes, internalisering effektivitet var lik (12,5% med apoptotisk HeLa, 13% med apoptotisk Ca Ski, 14,5% med apoptotisk C-33 A) (figur 1E). Imidlertid, ble det registrert at 12 til 15% av fibroblaster var i stand til å ta opp de apoptotiske celler, mens antallet av apoptotiske celler sådd var ti ganger større enn den for HPFS. Dette tyder på at fibroblaster har et begrenset potensial i effektivitet og /eller mengden av apoptotisk celle intern. Når mottakercellene ble ko-inkubert med apoptotiske celler ved 4 ° C i 48 timer, prosentandelen av internalise falt betydelig til 2%, noe som tyder på at internaliseringsprosess følger en energi-avhengig reaksjonsvei (figur S2). Disse resultatene indikerer at humane primære fibroblaster kan sluke apoptotiske celler, uavhengig av deres virologisk status, gjennom fagocytose.
(A) Co-kultur av HPFS og apoptotiske HeLa-celler. (B) HPFS co-dyrket med apoptotiske Ca Ski celler (øverst til venstre), apoptotiske C-33 A-celler (øverst til høyre), alene (nederst til venstre) og supernatanten av apoptotiske HeLa-celler (nederst til høyre). (C) HPFS ble dyrket med apoptotiske HeLa-celler for ulike lengder tid: 1 time (CI), 2 h (CII) og 3 h (cIII). Bildene viser aktin rekruttering og membran utvidelse dannelse (piler). (D) HPFS Ca Ski celler og HPFS pluss apoptotiske Ca Ski eller HeLa celler ble farget med anti-vimentin (TRITC) og anti-cytokeratin (Cy2) antistoffer. Mikroskop observasjoner ble utført med en konfokal mikroskop (skala bar: 1 mikrometer). Alle resultater er representative for fire uavhengige eksperimenter. (E) HPFS ble inkubert med HeLa apoptotisk, Ca Ski eller C-33 A-celler i 48 timer og apoptotisk celle internalisering ble kvantifisert ved hjelp av strømningscytometri.
Kun HPV-positive apoptotiske celler effektivt omdanner mottakercellene
Ehnfors
et al.
vist at DNA fra rat fibrosarkom apoptotiske celler transfektert med H-
ras
V12, c-
myc Hotell og SV40LT overføres til og forvandler primære fibroblaster [21]. Fordi HPV-onkogener, som SV40LT, er i stand til effektivt å transformere infiserte celler og blokkering av p53 vei, blant andre effekter, testet vi om fibroblaster dyrket med apoptotiske celler var i stand til å vokse med anker uavhengighet ved å måle deres evne til å danne kolonier i et myk-agar analysen, som observert med HeLa, Ca Ski og C-33 A kreftceller (figur 2A, øvre linje). I motsetning til dette humane primære fibroblaster var ute av stand til å vokse uten en fast matriks (figur 2A, øvre linje). Selv om de tre typene apoptotiske legemer ble internalisert av fibroblaster, bare de apoptotiske celler som HPV (HeLa og Ca Ski celler) transformert HPFS (figur 2A, midt linje). Kontrollene med apoptotiske celler alene resulterte ikke i kolonidannelse (figur 2A, nedre linje). Disse funnene viser at inkubasjon av apoptotiske celler med HPV-integrerte DNA effektivt indusert forankringsuavhengig vekst av HPFS, et kjennetegn på transformasjon og en
in vitro
korrelerer av tumorigenitet
in vivo product: [27 ]. Transformasjonen statusen HPFS ble videre testet ved grensen-utvannings analyser. Faktisk, i motsetning til primære fibroblaster, fibroblaster transformert av apoptotisk HeLa (FH) og Ca Ski (FC) celler som hadde evnen til å danne multilags kolonier når de ble dyrket ved lav tetthet (figur 2B). På dette stadiet, FH og FC begynte å oppvise en transformert fenotype, med noen av cellene om vises avrundet, i motsetning til kontroll HPFS som viste en spindel form (figur 2C). Videre de transformerte fibroblaster besto hovedsakelig av pakket eller aggregerte små celler som HeLa og Ca Ski celler, mens de primære fibroblaster dannet en flat monolayer.
(A) HPFS og HeLa, Ca Ski og C-33 A livmorhalskreftceller (øvre linje); HPFS etter 48 timer med eksponering for apoptotiske celler (apo HPF, apo HeLa, apo Ca Ski, apo C-33 A) (midterste linje) ble dyrket i myk agar i 21 dager. Apoptotiske celler alene ble også dyrket som en kontroll (nedre linje). Bildene ble tatt med en 20 × forstørrelse objektivet. (B og C) HPFS HeLa-celler, Ca Ski celler og transformerte fibroblaster ved apoptotisk HeLa (FH) og apoptotiske Ca Ski (FC) celler (utvalg på soft-agar), ble dyrket ved en grense-fortynning i 21 dager. (B) Koloniene farget med krystall fiolett ble tellet, og det plating effektivitet (PE, prosentandelen av celler i stand til å danne kolonier, SD, standardavvik) ble beregnet. (C) Colony forstørrelser ble fotografert med en 40 × forstørrelse objektivet.
Figur 3A viser at forvandlet fibroblaster, FC og FH, er ikke positivt for cytokeratin farging, i motsetning epitel HeLa og Ca Ski celler, tilbakekalling muligheten for at den observerte transformerte cellene er sjeldne overlevende kreftceller og en klonal utvikling av Ca Ski celler. Som vist i det øvre panel av figur 3B (D18S61 markør, et eksempel på 20 markører for DNA-typing brukes) til venstre, transformerte fibroblaster har et mønster av DNA som er forskjellig fra det opprinnelige tumorceller. Andre resultater fra DNA-typing eksperimenter viste at FC cellene var forskjellige fra Ca Ski celler, men inneholder noen alleler fra Ca Ski DNA (TP53 og D8S264 markører), som reflekterer overføring av små DNA-fragmenter. FC DNA inneholder også deler av kromosomer (D17S250 markører), som reflekterer overføring av store DNA-fragmenter som beskrevet av Holmgren [17], [19]. Selv om disse resultatene viser kromosom omorganisering (tap og gevinst på alleler) av FC celler, kan vi ikke utelukke muligheten for kryssforurensning, til tross for at dette er svært lite sannsynlig.
(A) HPFS Ca Ski, HeLa, FC og FH celler ble analysert ved immunocytofluorescence for cytokeratine uttrykk (skala bar: 1 mikrometer). (B) DNA fra Ca Ski og FC celler ble forsterket av fluorescerende PCR bruker 20 mikrosatellitter. Fire representative mikro presiseringer vises. Ulike typer allelet er observert ved hjelp av fire markører:. D18S61 TP53, D8S264 og D17S250
Deretter fant vi ut effekten av HPF transformasjon på spredning hastighet ved hjelp av en vekstkurve og resultatene fra MTT ( 3- [4,5-dimetyltiazol-2-yl] -2,5-difenyl-tetrazolium bromid) proliferasjonsanalyse vist i fig. 4A og 4B, henholdsvis. FH hadde en midlere populasjon doblingstid på 15 timer, og den FC hadde en gjennomsnittlig tid på 16 timer, mens den HPF doblingstiden var større med en faktor på 19 (298 h) (figur 4A). Mitokondriell aktivitet målt ved hjelp av MTT-proliferasjonsanalyse var overensstemmende med resultatene vekstkurven (figur 4b). Disse veksttakt modifikasjoner støtte tumorigent potensiale av de nylig transformerte fibroblaster. Vi har derfor testet om økt vekst og transformasjon av mottakercellene var assosiert med genetiske modifikasjoner som fører til hyperploidy. Cytometry analyser viste at DNA-innholdet økte med passasjene i transformerte fibroblaster (figur 4C). I våre forsøk, en HPF bety fluorescensintensitet (MFI) på 154 tilsvarte diploide celler (figur 4D). MFI øket til 205 og 250 etter 5 (P5) og 15 (P15) passasjer i FH-celler, respektivt. Vi observerte lignende resultater for FC celler (219 på P5 og 264 på P15). MFI på passasjer 15 av FH og FC representert hypertriploidy. Aneuploidy, som vist i vår modell, er ofte forårsaket av en bestemt type genetisk ustabilitet, og er en av de mest vanlige egenskapene til kreft [28].
(A og B) HPFS og HPFS forvandlet av apoptotiske HeLa (FH) eller apoptotiske Ca Ski (FC) celler ble dyrket i de angitte lengder av gangen. Den celleformering ble undersøkt hver dag ved å telle det totale antall celler (A) og ved MTT-analyser (B). Grafene presentere middelverdien (+/- SD) av tre uavhengige forsøk. (C) HPFS FH og FC på passasjene 5 (P5) og 15 (P15) ble farget (10
6-celler) med propidiumjodid løsning, og analysert ved hjelp av strømningscytometri. (D) MFI av G0 /G1 peak (gjennomsnitt av tre uavhengige eksperimenter +/- SD) viser ploiditeten av HPF, FH og FC på P5 og FH og FC ved P15.
apoptotiske HPV-assosiert kreft celler effektivt overføre virus onkogener til fibroblaster
Fordi bare apoptotiske HeLa og Ca Ski donorceller var i stand til å omdanne fibroblaster, hypoteser vi at HPV onkogener kunne overføres til mottakercellene. Vår konfokal mikroskopi-analyse antydet at genetisk materiale ble overført fra den apoptotiske celler til fibroblast kjernene etter 6 timer med ko-kultur (figur 5A, hvite piler). Aktin cytoskjelettet reorganisering syntes å levere den apoptotiske cellen mot kjernen for DNA-overføring, som vist ved en høy forstørrelse ved overlagring overførte lys med phalloidin eller DAPI fargebilder. Etter disse observasjonene, undersøkte vi HPV DNA overføring i fibroblast mottakere ved hjelp av
in situ
hybridisering (ISH) med en sonde hybridiserte spesifikt til høyrisiko HPV DNA. HeLa og Ca Ski-celler ble anvendt som positive kontroller. Bekrefter vår hypotese, ble hybridiseringssignaler observert som lilla prikker i apoptotiske celler og kjerner av de transformerte fibroblaster (FH og FC), mens noe signal ble detektert i HPFS (figur 5B). Disse data validere hypotesen om horisontal overføring av virus onkogener. En annen metode som består av å forsterke E6 DNA til HPV 16 og 18 bekreftet tilstedeværelsen av virus-DNA i de transformerte fibroblaster (figur 5C). Vi videre analysert uttrykket av E6 HPV16 og E6 HPV18 av revers transkriptase fulgt av sanntids kvantitativ PCR. Figur 6A illustrerer at E6 transkripsjoner ble oppdaget i de transform FH og FC celler med men lavere nivåer enn i foreldre HeLa og CaSki celler. Disse dataene tyder på at overføring av virale oncogener er effektiv og funksjonell. Til mer grundig granske hvilken rolle de overførte E6 onkogener som hemmere av p53 uttrykk, vi immunoblottet for p53 og en av sine mål, p21. Følgelig er p53 og p21 nivåene av de transformerte HPFS vesentlig redusert, i likhet med reduksjonen av donor kreftceller (figur 6B). Samlet er disse resultatene understreker en avgjørende rolle for viral onkogen overføring i transformasjonen av primære celler, en prosess som omgår p53 veien.
(A) Bildene illustrerer DNA overføring fra apoptotiske celler til fibroblast mottakere (piler). Mikroskopiske observasjoner ble utført med en konfokal mikroskop (skala bar: 1 mikrometer). (B) Høy risiko HPV DNA ble oppdaget av
in situ
hybridisering i foreldre og apoptotiske HeLa og Ca Ski celler, FH og FC, men ikke i HPFS. Celler ble kontra med eosin (skala bar: 1 mikrometer). (C) Agarosegel-elektroforese av amplifisert humant albumin og E6 HPV18 og HPV16 E6 DNA (MW: molekylvekt). Bildene er representative for tre uavhengige eksperimenter.
(A) E6 HPV18 og E6 HPV16 RNA kvantifisering fra HPFS foreldre celler og fibroblaster forvandlet av apoptotiske HeLa celler eller apoptotiske Ca Ski celler (kalt FH og FC henholdsvis) ble utført ved sanntids-kvantitativ PCR etter revers transkripsjon. Grafene representerer gjennomsnittet av tre uavhengige eksperimenter (+/- SD). (B) Immunoblotting analyser av p53 og p21 uttrykk i kreftcellelinjer, HPFS og FH og FC forvandlet fibroblaster, ved hjelp av mus monoklonale antistoffer mot p53 og p21. Blotter ble også undersøkt med en β-actin antistoff.
Diskusjoner
Resultatene fra denne studien gir direkte bevis for onkogene potensial for HPV positive apoptotiske celler. Overføringen av virus-DNA som stammer fra HPV-positive livmorhalskreftceller gjennom HGT fremmet vekst og transformasjon av HPFS og kan representere en alternativ mekanisme for HPV-assosiert cellulær transformasjon. Bergsmedh
et al.
Tidligere vist horisontal onkogen overføring mellom eukaryote celler [19]. I deres modell, donorcellene var primære gnager fibroblaster endret for å overuttrykker c-
myc Hotell og H-
ras
V12 og et hygromycin-resistente genet som tillot en svært selektiv utvelgelse av transformerte mottaker celler etter HGT.
i vår studie, intern priser av apoptotiske kreftceller var lik, uavhengig av HPV-status. Men det funn at bare HeLa og Ca Ski kreftceller bæring naturlig integrert HPV-onkogener, men ikke HPV-negative C-33 A-celler er i stand til å transformere phagocytosing fibroblaster gir støtte for hypotesen om at virale DNA overføres av apoptotiske celler kan gjenbrukes og uttrykt av mottakercellene.
in vitro
mottakercellen transformasjon av horisontalt overført DNA, tilrettelagt av DNA-fragmentering, viste seg å være avhengig av p53 [29]. Faktisk p53- eller p21-manglende celler, men ikke vill-type p53 fibroblaster, ble tumor-lignende etter sitt opptak av c-
myc
Fare
ras
V12 onkogener , noe som indikerer at Chk2 /p53 /p21-signalveien beskytter cellene mot forplantning av potensielt skadelige DNA [19], [20], [30]. Videre SV40LT, noe som letter p53 degradering, kan overvinne denne genetiske overvåking både
in vitro Hotell og
in vivo product: [21]. Som SV40LT blir E6 oncoproteiner HPV type 16 og 18 er fysisk forbundet med vill-type p53 og begunstige dens proteosomal degradering [gjennomgått i [31]]. En analyse av de transformerte fibroblaster viste at de inneholdt E6 E6 HPV16 eller HPV18 DNA. I tillegg, ISH viste at HPV-DNA fra de apoptotiske kreftceller ble overført inn i kjernen av mottaker fibroblaster. Når DNA ble overført, ble ekspresjonen av HPV E6 gener som detekteres ved RNA-nivået opp til 15 uker etter starten av ko-kultur-eksperimenter. E6-uttrykker mottakercellene viste reduserte nivåer av p53 samt sitt mål, p21, som kan delvis forklare endringer i vekstkontroll kretser.
Vi skal bekrefte ved genotyping som forvandlet fibroblaster var unik og ble utledet fra primære fibroblaster og foreldre kreft cellelinjer. Ved å studere flere mikro, fant vi at de faktisk næret noen alleler er identiske med de som er identifisert i apoptotiske livmorhalskreftceller. Men på grunn av tap av primære fibroblaster til senescence, var vi ikke i stand til å bekrefte at de ble avledet fra primære fibroblaster. Vi kan derfor ikke helt utelukke muligheten for krysskontaminering med en urelatert cellelinje, selv om denne muligheten vises usannsynlig. Imidlertid viralt endrede fibroblaster som var i stand til å danne kolonier viste særegne morfologiske egenskaper, en høy formeringshastigheten og Aneuploidy. Overgangen fra diploidy til Aneuploidy, observert et kjennetegn i praktisk talt alt kreft [28], har vært nevnt i begynnelsen av høyrisiko HPV-assosiert kreft på livmorhalsen [32] og har blitt tilskrevet synergistisk effekt av E6 og E7 onkoproteiner [ ,,,0],anmeldt i [31]]. Men høyrisiko HPV udødeligcellene er ikke-tumorigen, og aktivering av cellulære onkogener c-
myc
, Fare
ras Hotell og c-
fos
er nødvendig for fullstendig å overvinne den anti-onkogen funksjon av p53 og å resultere i livmorhalskreft utvikling [33], [34], [35]. Videre studier av ekspresjonen av disse eventuelt aktiverte cellulære oncogener vil hjelpe til å forstå mekanismen for fibroblast transformasjon. Likevel kan HPV onkogen transmisjonen har en rolle mer viktig enn vurderes, siden ekspresjon av HPV16 E6 onkogenet i HPV-negative C-33 A-celler overfører en aggressiv fenotype, som vist ved stråling motstand i transplanterte tumorer [36].
flykte fra immunovervåkingsmekanismer kan representere den viktigste risikofaktor for HPV DNA utholdenhet og lesjon progresjon, mens virusoverføring fra apoptotiske legemer til omkringliggende celler som mangler reseptorer for HPV
in vivo
kunne lette vedvarende HPV i livmorhalsen. Dessuten kan en slik overføring forklare spredning av HPV til mesenchymale celler, som observert ved ISH i cervikale karsinomer [37], [38], og muligheten for en stromal reservoar for HPV. Videre er det i humane faste tumorer, er en undergruppe av kreftceller, kalt kreft stamceller, som sannsynligvis initieres som følge av HGT forårsake svært aggressive kreftformer med en høy tilbøyelighet mot metastatisk spredning [39]. Dette kan forklare den positive sammenhengen mellom frekvensen av intratumoral apoptose og flere livmorhalskreft parametere som tumorstørrelse, lesjon klasse, metastatisk fenotype og pasient overlevelse [7], [40], [41], [42].
i tillegg kan den økte forekomst av apoptotiske celler etter kjemoterapi og /eller strålebehandling være delvis ansvarlig for gjentakelse av HPV lesjoner ved å indusere transformasjonen av nye celler i det samme eller forskjellige anatomiske steder måneder eller år etter remisjon [43 ], [44]. Undersøkelser av denne muligheten er garantert, i tillegg til arbeidet med å finne nye terapeutiske strategier rettet mot E6 /E7 onkogener å begrense horisontal overføring og til å kontrollere tumor utvikling.
Materialer og metoder
Cell kultur og apoptoseinduksjon
HPFS ble isolert fra voksent menneske hud etter mageplastikk som tidligere beskrevet [45] og ble dyrket i komplett DMEM (Lonza) inneholder 10% FBS (Lonza), penicillin /streptomycin og L-glutamin. HPFS hentet fra kirurgiske rester er ikke underlagt godkjenning fra en etisk komité og pasientens samtykke i samsvar med loven L.1245-2 av «Code de la santé publique» brukt i Frankrike. Videre laboratoriet hud prosjektering av professor Philippe Humbert er dermatologi departement, som gir humane fibroblaster, har manuskript dokumenter som sier pasientens non-motstand mot bruk av hans kirurgiske rester til medisinsk forskning i samsvar med loven L.1211-2. Humane cervikale karsinom-cellelinjer (ATCC), HeLa (HPV18, vill-type p53) og C-33 A (HPV negativ, mutert p53) ble dyrket i fullstendig EMEM (Lonza), og Ca Ski-celler (HPV16, vill-type p53 ) ble dyrket i komplett RPMI (Lonza). De ble overvåket månedlig og funnet å være fri for mycoplasms. Tolv timer før induksjon av apoptose, ble carcinoma celler sådd ut ved 2 x 10
4 celler /cm
2. De ble deretter behandlet med 20 mJ /cm
2 UVB-stråling etterfulgt av 300 nM staurosporin (STS) (Sigma Aldrich) i 48 timer. Den apoptotiske celler ble høstet etter sentrifugering av supernatanten ved 300 g i 10 min. Apoptose påvisning ble utført som beskrevet i tilleggsinformasjon (Methods S1). Den apoptotiske celler ble inkubert med HPFS i et forhold på 10:01. Dette forholdet ble valgt fordi en høyere ratio fører fibroblast død og en lavere ratio reduserer frekvensen av intern.
apoptotisk celle internanalyse
De apoptotiske celler ble farget med 1 mikrogram /ml CFDA, SE (Invitrogen Ltd.) fortynnet i DMEM med 2% FBS i 13 minutter ved 37 ° C. Etter vasking, ble de inkubert i 48 timer med mottakercellene. For cytometri analyse, ble fibroblaster inkubert med de apoptotiske celler høstet ved trypsinering og analysert ved bruk av en Cell Lab Quanta ™ SC-strømningscytometer (Coulter Beckman). Apoptotiske celler ble merket med cfda, SE og HPFS ble skilles fra apoptotiske celler ved deres diameter som evaluert ved flow-cytometri. Hendelser med liten diameter ( 13 mikrometer) og positivt for CFDA SE, ble ansett apoptotiske celler ;, hendelser med stor diameter ( 13 mikrometer) og negative for CFDA, SE, var HPFS og hendelser med stor diameter og positive for CFDA, SE, var HPFS med oppslukt apoptotiske celler.
for konfokalmikroskopi, fibroblaster dyrket på Dekk ble fiksert med 3,7% paraformaldehyde i 20 min ved 4 ° C og permeabilized bruker 0,1% triton X100 i 10 min ved rommet temperatur (RT). Cellene ble farget ved bruk av TRITC (tetramethylrhodamine-isotiocyanat) -konjugert phalloidin (Sigma Aldrich) i 30 minutter ved 4 ° C og med 300 nM 4 «, 6-diamidino-2-fenylindol, dihydroklorid (DAPI; Invitrogen) i 5 minutter ved RT. 3D-bilde (z projeksjon) ble rekonstruert fra 32 horisontale 2D skiver innhentet av konfokal mikroskopi. Et annet sett av celler ble inkubert med to primære antistoffer: et monoklonalt muse anti-humant cytokeratin antistoff (klon AE1 /AE3, Dakocytomation) ble brukt ved 1:50 og et monoklonalt kanin anti-humant vimentin-antistoff (klon SP20; GeneTex) anvendt ved en :100 fortynning. Tilsvarende sekundære antistoffer (Jackson Immunoresearch) koplet til cyanin 2 (CY ™ 2-konjugert AffiniPure Geit-anti-mus IgG) eller rhodamin (rhodamin (TRITC) -konjugert AffiniPure Esel-anti-kanin-IgG) ble brukt ved 1:50 fortynning. De Dekk ble til slutt undersøkt ved hjelp av et Olympus FluoView 1000 fluorescens mikroskop (Olympus).
Colony formasjon assay, cellevekst og Aneuploidy analyse
soft agar analyser ble utført i 24-brønners plater i semi -Solid media (DMEM, 10% FBS, 0,35% agar; Invitrogen) med 8 × 10 3
og 3 × 10
5 celler /ml på en mediebase lag (RPMI, 10% FBS, 0,5% agar ). Cellene ble dyrket i 21 dager, og kolonier ble observert ved anvendelse av en Axiovert 25 invertert mikroskop (Zeiss) [27]. Koloniene ble deretter høstet ved å skrape overflaten av soft-agar og to cellelinjer av fibroblaster transformert av apoptotisk HeLa (FH) og Ca Ski (FC) celler ble utledet og brukt for videre eksperimenter.
Primær fibroblast transformasjon ble også testet ved grense-fortynning kulturer i 6-brønners plater ved 5 x 10
2 celler /brønn i 21 dager. Koloniene ble deretter farget ved hjelp av en lilla krystall løsning (0,1% lilla krystall (w /v), etanol 5%) og fotografert med et Nikon Coolpix 4500 digitalkamera (Nikon) [46].
Spredning av de transformerte cellene ble overvåket ved å telle det totale antall celler i hver enkelt brønn daglig i 10 dager med en celle Lab Quanta ™ SC strømningscytometer. Utbredelsen ble også overvåket under anvendelse av MTT-testen med den Cell Proliferation Kit I (MTT) (Roche) i 5 påfølgende dager.
