Abstract
Intravesikal Bacillus Calmette-Guérin (BCG) har vist seg å indusere en spesifikk immunologisk reaksjon (
dvs.
, aktivering av IL-2 og effektor T-celler), mens preklinisk studier med ALT-803 (mutert IL-15 analog kombinert med IL-15Rα-Fc fusion) har vist lovende resultater ved å forlenge agentens halveringstid og stimulerende CD8 + T-celler. Basert på disse resultatene, hypotese vi at intravesikal administrasjon av ALT-803 sammen med BCG vil generere en immunologisk reaksjon som fører til betydelig blæretumorbyrde reduksjon. Ved hjelp av en veletablert kreftfremkallende rotte ikke-muskel invasiv blærekreft (NMIBC) modell, studerte vi effekten av intravesikal ALT-803 med og uten BCG. Rotte vev ble evaluert for å dokumentere behandlingsrespons. Intravesikal ALT-803 var trygt og godt tolerert alene og i kombinasjon med BCG. Som en enkelt behandling agent, ALT-803 redusert tumorbelastning med 35% sammenlignet med kontrollgruppen, mens BCG alene bare redusert tumorbelastning med 15%. Imidlertid er kombinasjonen av ALT-803 pluss BCG redusert tumorbyrde med 46% sammenlignet med kontrollen. Immunovervåking antydet at antitumorrespons ble knyttet til produksjon og sekresjon av IL-1α, IL-1β og RANTES, som i sin tur, indusert proliferasjon og aktivering av NK-celler. Til slutt, ble tumorresponser i den kombinatoriske behandling assosiert med 76% reduksjon i angiogenese, noe som er betydelig høyere enn når vurderes med enten middel alene. Den forbedrede terapeutiske indeks sett med denne dublett danner grunnlaget for utviklingen av dette regimet for fremtidige kliniske studier
Citation. Gomes-Giacoia E, Miyake M, Goodison S, Sriharan A, Zhang G, du L, et al. (2014) Intravesikal ALT-803 og BCG behandling Reduserer tumorbyrde i en Carcinogen Induced blærekreft Rat Model; en rolle for cytokin produksjon og NK celle ekspansjon. PLoS ONE 9 (6): e96705. doi: 10,1371 /journal.pone.0096705
Redaktør: Robert Hurst, Oklahoma University Health Sciences Center, USA
mottatt: 14 januar 2014; Godkjent: 10 april 2014; Publisert: 04.06.2014
Copyright: © 2014 Gomes-Giacoia et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble finansiert av James og Esther kong Biomedical teamet Science Prosjekt 1KT-01 (CJ Rosser). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:. Følgende forfattere EGG, MM, SG, AS, GZ, ASP, KxC og CJR har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer. LY, JOE, PRR og HCW er ansatte i Altor BioScience Corp. Dette ikke endrer forfatternes tilslutning til PLoS ONE politikk på deling av data og materialer.
Innledning
Blærekreft (BCA) er den femte vanligste kreftformen i USA, for å bli diagnostisert i ca 74 690 pasienter som resulterer i ca 15 580 dødsfall i 2014 [1]. Sytti til åtti prosent av pasienter med BCA Liggende med ikke-blærekreft (NMIBC), som er kreft begrenset til blæreslimhinnen [2], [3]. NMIBC er behandlet av transurethral reseksjon av svulstene etterfulgt av administrering av adjuvant intravesikal kjemoterapi eller intravesikal Bacillus Calmette-Guérin (BCG), noe som kan redusere tilbakefall og forlenger progresjonsfri intervall [2] – [4]. Til tross for dette, ca 50-60% av NMIBC pasienter som gjennomgår reseksjon og intravesikal terapi vil oppleve en svulst tilbakefall [5]. Videre av dem som opplever et tilbakefall, vil ca 30% fremgang og gi etter for sykdommen sin over en 15-års periode, mens en annen 50% vil gjennomgå radikal cystektomi i et forsøk på å kontrollere sin sykdom [6]. Som sådan, et sentralt tema i feltet fortsatt behov for bedre terapeutiske alternativer for å redusere tilbakefall priser, bedre overlevelse og unngå behovet for radikal kirurgi.
Den eksakte virkningsmekanismen der intravesikal BCG utøver sin anti -tumorigenic effekter er ikke kjent. Det er imidlertid klart at BCG aktivitet er avhengig av induksjon av betennelsesreaksjoner som involverer aktivering av flere typer av immunceller. Til å begynne med, intravesikal BCG binder seg til urothelial foring og blir deretter internalisert og behandlet av normale og maligne celler som utløser en kompleks proinflammatorisk respons som er karakterisert ved frigivelse av IL-1, IL-6, IL-8, TNF-α og GM-CSF [ ,,,0],7], [8]. Deretter ble en rekke forskjellige immunceller, deriblant T-celler, naturlige killer (NK) celler, nøytrofile celler og makrofager migrere til blæren hvor de blir aktivert og produsere flere proinflammatoriske cytokiner og kjemokiner [9], [10]. Dette er preget av utseendet på forskjellige leukocytter og cytokiner i urinen til BCG-behandlede pasienter. Mens den spesifikke rollen som forskjellige celletyper og cytokiner spiller i urothelial carcinoma behandling er ikke helt klare, urin Th1 cytokiner (
f.eks
, IFNy, IL-2 og IL-12) har blitt assosiert med BCG respons , mens høye nivåer av Th2-cytokiner (
f.eks
, IL-10 og IL-6) korrelerer med BCG svikt [9] – [16]. Totalt sett er evnen til intravesikal BCG til å samhandle med urothelium og stimulere brede, holdbare Th1- typen immunresponser trolig avgjørende for sin effekt. Som et resultat, har det blitt foreslått at tilsetningen av immunstimulerende midler, så som cytokiner, for å BCG terapi kunne forsterke disse immunresponser og gi større og /eller mer holdbare antitumoreffekter. Men til dags dato, fase 3 kliniske undersøkelser av intravesikal BCG i kombinasjon med IL-2 eller IFN-α2b har vært begrenset med bare ett forsøk rapportert, som ikke demonstrere fordel fremfor BCG monoterapi [17]. Dermed vil optimale strategier for å maksimere immunterapeutisk effekt av intravesikal behandling av NMIBC trolig kreve nye løsninger.
IL-15 er en kritisk faktor i utvikling, proliferasjon og aktivering av effektor natural killer-celler og CD8
+ T-celler [18], [19] og har blitt oppført som den mest lovende middel blant tolv immunterapi legemidler med et stort potensial for bruk i behandling av kreft hos mennesker [20]. Vi har nylig isolert en ny IL-15-mutant med et 4-ganger økning i biologisk aktivitet [21]. Farmakokinetikk (PK), biodistribusjon og biologisk aktivitet av denne IL-15 superagonist (IL-15N72D) er blitt ytterligere forbedret gjennom interaksjon med det oppløselige domene av IL-15-reseptor α protein (IL-15RαSu) for å gi IL-15N72D /IL-15RαSu-Fc fusjons kompleks (referert til som ALT-803). Dette komplekset har minst 25-ganger
in vivo
biologiske aktiviteten til nativt IL-15 [22], [23]. Vi har nylig vist at systemisk ALT-803 behandling induserer holdbare og beskyttende immuncellestyrte antitumor responser i flere musemodeller for hematologisk kreftsykdom [22], [23]. ALT-803 skiller seg ut som en potent immunostimulant som er i stand til samtidig å aktivere den medfødte og ervervede armer av immunsystemet til å lokke fram både rask og langvarig beskyttende tiltak mot smittsomme eller neoplastiske utfordringer til verts [24].
Motivert av de overbevisende prekliniske data relatert til IL-15, testet vi den terapeutiske effekten av intravesikal ALT-803 alene og i kombinasjon med BCG i et veletablert gnager kreftfremkallende indusert NMIBC modell. Nærmere bestemt har vi observert at a) intravesikal ALT-803 var trygg og godt tolerert alene og i kombinasjon med BCG, b) ALT-803 pluss BCG redusert tumorbyrde med 46% sammenlignet med kontroll, som var høyere enn med enten middel alene, c ) immunovervåking antydet at antitumorrespons sett med kombinasjonen av ALT-803 pluss BCG ble knyttet til produksjon og sekresjon av IL-1α, IL-1β og RANTES, som i sin tur, indusert proliferasjon og aktivering av NK-celler og d ) tumorresponser sett med kombinasjonen av ALT-803 og BCG var assosiert med en signifikant reduksjon i angiogenese. De oppmuntrende resultatene som presenteres i denne rapporten vil støtte vår omtanke for videre utvikling av denne romanen terapeutiske dublett ved behandling av pasienter med NMIBC.
Materialer og metoder
Dyr, reagenser, og tumor modell
Nitti Sprague Dawley rotter, seks til åtte uker gammel, ble hentet fra Harlan Laboratories (Indianapolis, IN). Dyr omsorg var i samsvar med anbefalingene fra
Guide for omsorg og bruk av forsøksdyr
(National Research Council) og godkjent av vår lokale IACUC ved University of Central Florida. N-butyl-N- (4-hydroksybutyl) nitrosamin (BBN) ble anskaffet fra TCI America (Portland, OR), alikvotert og oppløst i 1% Tween. ALT-803 (IL-15N72D:IL-15RaSu /Fc) ble dannet som tidligere beskrevet [21] og fortynnet med steril fosfatbufret saltløsning (PBS). PBS tjente som negativ kontroll. Lyofilisert BCG ble kjøpt fra Sanofi Pasteur Limited (Toronto, CA) og rekonstitueres som instruksjoner med steril PBS og tjente som positiv kontroll. Etter at dyr å akklimatisere seg til anlegget vårt for en uke, alle dyr unntatt fem fikk 0,05% BBN i drikkevannet kontinuerlig i åtte uker indusere dannelsen av NMIBC, som er et veletablert gnager kreftfremkallende indusert BCA modell [25] – [ ,,,0],30] med markerte molekylære forandringer som ligner på human BCA [31]. Etter 8 uker med BBN eksponering, dyr gjenopptatt vann uten tilsetning av BBN.
Intravesikal behandling
Etter BBN eksponering (uke 9), ble rottene randomisert til en av fire behandlingsgrupper (kontroll- PBS; ALT-803 ved 1 ug /dose; BCG ved 1,35 mg /dose [26], [27], eller ALT-803 ved 1 ug /dose pluss BCG 1,35 mg /dose). Hver gruppe inneholder 20 dyr. Innledende forsøk med ALT-803 bemerket a) terapeutisk respons med en intravesikal dose på 1 mikrogram og b) forbedret terapeutisk respons ved samtidig administrasjon av ALT-803 pluss BCG forhold til sekvensiell administrasjon av disse to agentene (data ikke vist). Alle blære instillations ble gjort i 200 ul steril PBS. Rotter ble bedøvet med isofluran og deretter en 22-gauge Teflon angiocatheter (transuretral kateter) ble plassert inn i blæren gjennom urinrøret, og urin ble helt utladet fra blæren [32]. Deretter ble PBS, BCG, ALT-803, eller kombinasjon av ALT-803 pluss BCG terapi levert av transurethral drypping gjennom transurethral kateteret og lov til å bo i blæren i 1 time ved okklusjon av urinrøret med en veske streng sutur. Etter 1 time ble vesken strengen suturen fjernet og rottene ble stimulert til å utvise blæreinnholdet [32]. Den intravesikal behandling ble administrert ukentlig for en total på seks uker for å etterligne intravesikal BCG behandling hos mennesker [33]. To uker etter fullførelse av intravesikal behandlingen ble dyrene avlivet og vev (
f.eks.
, Helt blod, serum, urin, blære og milt) ble høstet og bearbeidet for senere analyse. Figur 1 illustrerer studiebehandlingen skjemaet.
Behandling med PBS, BCG, ALT-803, ALT-803 eller i tillegg til BCG påbegynt en uke etter fullførelse av åtte uker eksponering til 0,05% N-butyl-N- ( 4- hydroksybutyl) nitrosamin i drikkevann. Rotter ble randomisert i fire grupper og behandlet ukentlig i seks sammenhengende uker i henhold til planen. Rottene ble avlivet og obdusert to uker senere. CTRL, kontroll.
Ultralyd imaging studier
Gjennom studien ble intravesikal tumorbelastning overvåkes
in situ
av transabdominal ultralydavbildning med Vevo 2100 imaging system med en MS550D 22-55 MHz håndholdt micro rekke svinger (Visualsonics, Toronto, ON, Canada). I korthet, ble rottene bedøvet med isofluran og deretter 200 ul steril PBS ble dryppet inn i blæren, som beskrevet ovenfor for å tilveiebringe et ensartet bilde av alle blærene visualiserte. Intraluminal svulster ble observert og digitale bilder tatt. Blæreveggtykkelse (i millimeter), et surrogat for tumorbyrden, ble målt med Vevo 2100 målefunksjon.
Histopatologi av tumorsnitt
resected blærer ble først veid deretter 12 blærer fra hver gruppe ble fylt med 200 ul 10% nøytral bufret formalin. Blæren halser ble ligert og hele prøvene plasseres i 10% nøytral bufret formalin. Blærer i formalin ble innstøpt i parafin, seksjonert (5 mm) og plassert på Superfrost pluss Micro lysbilder (Fisher Scientific, Pittsburgh, PA). De resterende åtte blærer i hver gruppe ble fylt med 200 ul O.C.T. embedding forbindelse (Andwin Scientific, Schaumburg, IL) og blæren nakke ble bundet. Blærene ble senket i Tissue-Tek O.C.T. Forbindelse (Ted Pella, Inc., Redding, CA) i cryomolds og frosset i flytende nitrogen og lagret ved -80 ° C. Blærer frosset i O.C.T. ble seksjonert (5 um), varmet ved romtemperatur i 5 minutter, løst i iskald metanol i 10 minutter, og vasket med PBS forut for immunhistokjemisk farging. Deparaffinized og frosne seksjoner fra hver rotte ble utsatt for hematoxylin og eosin flekken for histologisk evaluering. I tillegg deparaffinized objektglass ble behandlet med 1% hydrogenperoksyd i 100% metanol for å blokkere endogen peroksidase-aktivitet, etterfulgt av sitronsyre antigen henting. Lysbilder ble inkubert over natten med antistoffer mot CD3
+ (BD Biosciences, G4.18, monoklonalt antistoff, fortynning 1/250), CD8a
+ (BD Biosciences, OX-8, mus monoklonalt antistoff, fortynning 1 /10), CD161
+ (AbDSerotec; 10/78; mus-monoklonalt antistoff, fortynning 1/100) (påvisning av NK-celler), CD163
+ (AbDSerotec, ED2, mus-monoklonalt antistoff, fortynning 1/50) ( detektering av makrofager), Ki-67 (Dakota North America Inc .; MIB-5; mus-monoklonalt antistoff, fortynning 1/50), eller spaltes caspase 3 (Cell Signaling Technology, 5A1E; kanin monoklonalt antistoff, fortynning 1/1 500). Frysesnitt ble inkubert over natten med antistoffer mot CD4
+ (BD Biosciences, OX-35; mus-monoklonalt antistoff, fortynning 1/250) eller CD31 (Santa Cruz Biotechnology, H3; mus-monoklonalt antistoff, fortynning 1/250). Deretter ble deparaffinized og frosne snitt inkubert med biotinylerte anti-mus eller anti-kanin IgG (H + L) antistoff ved 10 pg /ml (Vector Laboratories INC., Burlingame, CA). Deretter seksjonene ble farget med Ultra-Sensitive ABC Mouse IgG farging kit (EMD Millipore, Billerica, MA) eller Biotin /streptavidin farging kit (Fisher Scientific, Pittsburgh, PA). Alle fargede seksjonene ble avbildes med et Nikon Eclipse E400 lysmikroskop (Nikon Inc., Melville, NY) med QIClick digital CCD kamera (QImaging, Surrey, BC, Canada) og Nikon NIE-Elements Grunnforskning bildebehandlingsprogrammer.
Detaljert histopatologiske analyse av neoplastiske responsen til intravesikal behandling ble utført i hver blære av to erfarne, uavhengige observatører (MM og AS). I korthet, CD3
+, CD4
+, CD8a
+ T-celler, NK-celler og makrofager ble talt opp i et minimum av fire tilfeldig valgte felt per høy effekt felt (HPF) i hver prøve. Resultatene ble scoret av beregning av antall infiltrerende farging celler.
Videre ble tumor angiogenese undersøkt på lysbilder farget med anti-CD-31 monoklonalt antistoff og microvessel tetthet (MVD, microvessel /mm
2) var vurdert som tidligere beskrevet av Weidner
et al.
[34]. Enkelt endotelceller eller klynger av endotelceller som var positive for CD-31 ble vurdert som et fartøy. Fire områder med høyest microvessel konsentrasjon fra hver prøve ble identifisert ved 4 × forstørrelse og bildene ble tatt for kvantifisering av MVD på 200 ×. De to uavhengige observatører telles antall mikrokar i hvert histologisk felt. MVD av prøven ble beregnet som et gjennomsnitt av fartøyer i minst fire histologiske felt. I tillegg farging lysbilder med det monoklonale antistoff rettet mot Ki-67 vurderes proliferasjon. Ki-67 immunfarging ble tellet i et minimum av fire tilfeldig utvalgte felt fra hver behandlingsgruppe ved 200 x forstørrelse. Celler med tvilsom nukleær farging ble diskontert. Observatørene scoret resultatene ved å beregne prosentandelen av tumorceller som viser den karakteristiske nukleær farging (proliferativ indeks). Til slutt, flekker lysbilder med det monoklonale antistoff rettet mot spaltede caspase-3 vurderes apoptose. Spaltes caspase-3-immunfarging ble tellet i en minimal på 3000 celler fra hver behandlingsgruppe ved 200 x forstørrelse. De to observatører scoret resultatene ved beregning av prosenten av kreftceller som viser karakteristiske cellefarging (apoptotisk indeks).
Flowcytometrisk analyse av PMBC og milt for T-celler, NK-celler og makrofager
Rotte perifert blod mononukleære celler oppsamlet fra helblodprøver i EDTA-rør ble farget direkte ved inkubering med fluorescensmerkede antistoffer CD3
+ (eBioscience), CD4
+ (BD Biosciences), CD8a
+ (eBioscience) , NKG2D-positive (eBioscience) (påvisning av NK-celler), F480-PE (eBioscience) (detektering av makrofager), eller isotype kontroll-antistoff (eBiosciences, San Diego, CA) i 30 minutter ved romtemperatur, etterfulgt av røde blodcellelysering ved hjelp BD FACS Lysing Solution (BD Biosciences, San Jose, CA) ved romtemperatur i 3-5 minutter. Cellene ble deretter vasket to ganger med PBS inneholdende 1% føtalt bovint serum. Fargede celler ble analysert ved hjelp av en FACScan flowcytometer (BD Biosciences) og data ble samlet for 10.000 hendelser /prøve. Analyse av innsamlede data ble utført ved hjelp Cyflogic programvare (CyFlo LTD, Turku, Finland). I tillegg ble enkeltcellesuspensjoner av rottenes miltene generert ved forsiktig homogenisering vev i en petriskål og deretter passerer gjennom et Cellector Tissue Sieve (Bellco Glass, Vineland, NJ). Røde blodceller ble fjernet fra rottemiltceller med BD FACS-lysende løsning etter inkubering i 3-5 minutter ved romtemperatur, etterfulgt av sentrifugering ved 1200 rpm i 5 minutter. Den pelleterte Splenocyttene ble vasket to ganger med PBS inneholdende 1% føtalt bovint serum, etterfulgt av direkte immunofluorescens-farging som beskrevet ovenfor.
urin og serum-inflammatorisk cytokin-ELISA-analysen
latt urin fra hver rotte ble oppsamlet i et rør på is inneholdende en konsentrert urin stabilisator-løsning (2 M Tris-HCl [pH 7,6], 5% BSA, 0,1% natriumazid, og et komplett mini proteaseinhibitor tablett (Roche Diagnostics, Indianapolis, IN)). Urin ble sentrifugert, og supernatanten ble lagret ved -80 ° C. Tilsvarende serum ble oppsamlet i rør inneholdende EDTA, sentrifugert ved 10.000 x g i 15 minutter, og lagret ved -20 ° C. Urin og serumprøver ble utsatt for profilering av 12 inflammatoriske cytokiner ved hjelp av en ELISA-analyse (RAT Cytokine multi-analytt ELISArray, SABiosciences, San Diego, CA). Kort sagt ble urin- og serumprøver inkubert i 96-brønners mikroplater belagt med anti-rotte primære antistoffer mot 12 inflammatoriske cytokiner (IL-1a, IL-1, IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, IL -12, IL-13, IFN-γ, TNF-α, GM-CSF, og RANTES) og deretter fremkalt med sekundære antistoffer konjugert med pepperrot-peroksydase. Etter å legge til substrat og stopp løsning, ble en FLUOstar Optima Reader (BMG LABTECH, Ortenberg, Tyskland) som brukes til å måle absorbans ved 450 nm.
statistikker
Eksperimentelle data ble uttrykt som gjennomsnitt ± SEM , med mindre annet er angitt. Statistisk analyse ble utført ved hjelp av ikke-parametrisk Kraskal-Wallis test, etterfulgt av post-hoc Dunnet test for blære vekt, blæreveggtykkelse, farging av blæren, urin cytokiner og serum cytokiner. Parametrisk ANOVA test etterfulgt av post-hoc Bonferroni test ble utført for data relatert til lymfocytter i milten og lymfocytter i perifert blod. En
p
0,05 ble betraktet som signifikant. Alle statistiske analyser og figurer ble utført med GraphPad Prism programvare 5,0 (GraphPad Software, Inc., La Jolla, CA).
Resultater
Antitumor aktivitet av BCG, ALT-803 og Alt- 803 pluss BCG i NMIBC bærende rotter
i en gnager kreftfremkallende indusert NMIBC modell, ble rutinemessig overvåking av svulster utført av seriebilleddiagnostikk med Vevo 1200 systemet. Svulster kunne påvises så tidlig som tre uker etter eksponering til 0,05% N-butyl-N- (4-hydroksybutyl) nitrosamine i drikkevann. Som demonstrert ved ultralydavbildning og bekreftet histologisk undersøkelse, ble 100% av dyrene funnet å utvikle svulster. Ingen dyr hadde håndgripelig, avanserte svulster. For å bestemme om ultralydavbildning kan brukes til å overvåke og vurdere tumorbyrden, ble fotografert blærer og blæreveggtykkelse (et surrogat for tumorbyrde rapportert i millimeter) ble bestemt. Deretter blærer ble resected, veid og histopathologically undersøkt. Vi merket en positiv korrelasjon (Spearman R = 0,55,
p
0,0001) mellom blæreveggtykkelse og blære vekter /blære svulsten, og dermed vi rapporterer for første gang at den ikke-invasiv
in situ
overvåking av gnager blære svulst kan brukes til a) bekrefte svulst ta og b) rapportere terapeutisk tumorbyrde reduksjon.
Rotter som bærer blæren svulster ble behandlet intravesikalt 6 sammenhengende uker med PBS, BCG, ALT -803 eller ALT-803 pluss BCG. Annet enn snaut hematuri bemerket (kanskje fra kateterisering og /eller BCG), ble intravesikal terapi godt tolerert uten nevne toksisitet bemerket.
I tråd med utviklingen av
in situ
svulster, blære vekter økt med 49% hos dyrene som fikk BBN når sammenlignet med normale (ingen BBN) kontrolldyrene (data ikke vist). Men etter seks uker med intravesikal behandling med BCG, ALT-803 eller Alt-803 pluss BCG betydelig redusert tumorbyrde i blærer av BBN-behandlede rotter (fig. 2). Blære vekt (gjennomsnitt +/- SEM) ble rapportert å være: PBS 0,2 +/- 0.012 gram, BCG- 0,17 +/- 0,012 gram, ALT-803- 0,15 +/- 0,0091 gram og ALT-803 pluss BCG- 0.14+ /-0.0054 gram. I tillegg til tidligere til å være offer ved uke 16, ble 200 ul steril PBS innpodet i hver blære for å sikre ensartethet i størrelse og en serie av tverrgående og sagittal ultralydbilder ble oppnådd. Blæreveggtykkelse (gjennomsnitt +/- SEM) ble rapportert å være: PBS 1 +/- 0,11 mm, BCG- 0,7 +/- 0,05 mm, ALT-803- 0,65 +/- 0,077 mm og ALT-803 pluss BCG- 0,54 +/- 0,083 mm. Dermed fra disse bildene, vi bemerket med BCG behandling en 30% reduksjon i gjennomsnittlig blæreveggtykkelse, noe som tilsvarte en 15% reduksjon i blæren vektendring i forhold til PBS behandling. ALT-803 behandling alene var kjent for å ha en 25% reduksjon i gjennomsnittlig blæreveggtykkelse og et tilsvarende 35% reduksjon i blæren vektendring sammenlignet med PBS behandling. Interessant nok var den største reduksjonen i blæreveggtykkelsen og blære vekt sees når ALT-803 ble kombinert med BCG som fører til en 30% reduksjon i blæreveggtykkelse og et tilsvarende 46% reduksjon i blæren vektendring sammenlignet med PBS-behandling (fig. 2a -2 C). Alle resultater ble senere bekreftet ved detaljert histologisk undersøkelse (figur 2d.), Hvor H 0,05, **,
p
0,01, ***,
p
. 0,001
Intravesikal ALT-803 pluss BCG fremmer en unik lymfatisk infiltrasjon
blærene av behandlede rotter ble også farget for immunceller (CD3
+, CD4
+, CD8a
+ T-celler , NK-celler og makrofager) infiltrater (fig. 3 og Tabell S1). Antallet CD3
+ T-celler ble betydelig økt i ALT-803 ble sammenlignet med PBS og BCG alene. Kombinasjon av ALT-803 pluss BCG ikke forbedre antall infiltrerende CD3
+ T-celler sammenlignet med ALT-803 alene, men sammenlignet med BCG alene og antallet infiltrerende CD3
+ T-celler var signifikant høyere i kombinasjonsgruppen. CD4
+ T- celler ble ikke påvirket i noen gruppe sammenlignet med PBS (
data ikke vist
). CD8a
+ T-celler ble signifikant økt i BCG alene, ALT-803 alene, og ALT-803 pluss BCG sammenlignet med PBS. Kombinasjonen av ALT-803 og BCG ikke har en større effekt enn BCG alene eller ALT-803 alene. Deretter antallet NK-celler var ikke økt i BCG alene eller ALT-803 alene sammenlignet med PBS, men antallet NK-celler økt ved ALT-803 ble tilsatt til BCG. Videre er kombinasjonen av ALT-803 pluss BCG resulterte i økte infiltrerende NK-celler sammenlignet med BCG alene eller ALT-803 alene. Ingen vesentlig endringer i makrofagin ble observert i noen av behandlingsgruppene.
tumor infiltrasjon av celler positive for CD3
+, CD8a
+, CD161 (NK celle), eller CD163 (makrofag) (200 ×) ble notert. Ingen endringer ble registrert i CD4
+ T-celler (
data ikke vist
). ALT-803 alene økt tumor CD8a
+ uttrykker celler, mens ALT-803 pluss BCG økt tumor uttrykk for NK-celler (se tabell S1).
Sett
, venstre panel positiv kontroll fra rotte milt og høyre panel negativ kontroll fra rotte milt uten primære antistoff.
PBMC i fullblod fra rotter behandlet på denne protokollen ble samlet umiddelbart etter ble dyrene avlivet og underkastet flowcytometrisk analyse med hensyn til nærvær av CD3
+, CD4
+, CD8a
+ T-celler, NKG2D-positive celler og makrofager. Ingen vesentlige endringer ble kjent for CD3
+ og CD4
+ T-celler, mens CD8a
+ T-celler ble notert til å være signifikant forhøyet bare i BCG alene gruppen. Alle grupper (BCG alene, ALT-803 alene, og ALT-803 pluss BCG) viste en signifikant økning i NKG2D-positive celler sammenlignet med kontrollen. Til slutt, antallet sirkulerende makrofager ble signifikant redusert i ALT-803 alene, og ALT-803 pluss BCG, men ikke i BCG alene (Fig. 4a). Lignende resultater ble oppnådd fra analysen av rottemiltvevet. Spesielt ble ingen nevneverdig endringer bemerket med CD3
+, CD4
+ og CD8a
+ T-celler blant behandlingsgruppene. Imidlertid er antallet av NKG2D-positive celler ble signifikant økt i miltene fra rottene i alle grupper (BCG, ALT-803 og ALT-803 pluss BCG) sammenlignet med kontroll. Kombinasjon av ALT-803 pluss BCG ikke hensyn til en økning i antallet av NKG2D-positive celler sammenlignet med BCG alene eller ALT-803 alene. Videre er antallet av makrofager i milten var signifikant redusert i ALT-803 alene når det ble sammenlignet med PBS og BCG alene. Antallet makrofager tilbake til utgangspunktet når ALT-803 ble innført i BCG (Fig. 4b). Disse data gir overbevisende bevis på at kombinasjonen av ALT-803 pluss BCG er assosiert med stimulering av NKG2D-positive celler, som var egnet til effektor-celle som medierer tumorregresjon i løpet av intravesikal kombinasjon immunterapi.
A) Perifert blod mononukleære -celler (PBMC) ble isolert og analysert ved flow cytometri for ekspresjon av CD3
+, CD4
+, CD8a
+ T-celler, NKG2D- positive (NK-celler) og F480 ekspresjons-celler (makrofager). ALT-803 alene, så vel som, Alt- 803 pluss BCG resulterte i en økning i NKG2D-positive celler og en nedgang i makrofager sammenlignet med PBS. B) Splenocytter ble isolert og analysert ved flowcytometri for uttrykk av CD3
+, CD4
+, CD8
+, NKG2D-positive og F480 uttrykk celler. I likhet med resultatene PMBC, ALT-803 alene, så vel som, ALT-803 pluss BCG resulterte i en økning i NKG2D- positive celler og en nedgang i makrofager sammenlignet med PBS. *,
p
0,05, **,
p
0,01, ***,
p
. 0,001
Intravesikal administrasjon av ALT-803 pluss BCG tilrettelagt unik cytokin profilen
Sera fra rotter behandlet på denne protokollen ble samlet inn og umiddelbart lagret ved -80 ° C. For cytokinet analysen ble seraprøver tint og deretter underkastet analyse med rotte-inflammatoriske cytokiner multi-analytt ELISArray analysen. Sammen med proliferasjon og aktivering av NK-celler nevnt ovenfor, ble det intravesikal tilførsel av ALT-803 i kombinasjon med BCG forbundet med økt serumnivå av de inflammatoriske og immunrespons cytokiner, IL-1 a og IL-1 p med 52% og 52%, henholdsvis, sammenlignet med PBS-kontrollgruppen. Videre ble det økning i IL-1α og IL-1β opprettholdes når ALT-803 pluss BCG ble sammenlignet med BCG alene og ALT-803 alene (Fig. 5a). Deretter urin fra rotter behandlet på denne protokollen ble samlet og lagret ved -80 ° C umiddelbart etter at dyrene ble avlivet. Når det er klart for analyse, urinprøver ble tint og utsatt for rotte inflammatoriske cytokiner multi-analytt ELISArray analysen. Nok en gang ble de cytokiner, IL-1α, IL-1β og RANTES økte med 437%, 437% og 196%, henholdsvis, i urinen av ALT-803 pluss BCG-behandlede rotter sammenlignet med PBS-kontrollgruppen.
