Abstract
Bakgrunn
PTEN fosfatase virker på phosphatidylinositol 3,4,5-trifosfater som følge av fosfatidylinositol 3-kinase (PI3K) aktivering. har vist PTEN uttrykk til å bli redusert i tykk- og endetarmskreft. Lite er imidlertid kjent med hensyn til den spesifikke cellulære rollen til PTEN i humane intestinale epitelceller. Målet med denne studien var å undersøke hvilken rolle PTEN i menneskelige kolorektal kreftceller.
Metodikk /hovedfunnene
Caco-2/15, HCT116 og CT26 celler ble infisert med rekombinante lentiviruses uttrykker en shRNA spesielt designet for å banke ned PTEN. Virkningen av PTEN downregulation ble analysert på celle polarisering og differensiering, inter krysset integritet (uttrykk for celle-celle adhesjon proteiner, barrierefunksjon), migrasjon (sår assay), invasjon (Matrigel-belagte transwells) og på svulsten og metastasedannelse hos mus . Elektronmikroskopi-analyse viste at lentiviral infeksjon av PTEN shRNA betydelig hemmet Caco-2/15 celle polarisering, funksjonell differensiering og børstesømmen utvikling. En sterk reduksjon i claudin 1, 3, 4 og 8 ble også observert, så vel som en nedgang i transepitelial motstand. Tap av PTEN uttrykk økt spredning, migrasjon og invasjon kapasiteter på kolorektal kreft celler
in vitro
. PTEN downregulation også økt tumorstørrelse etter subkutan injeksjon av kolorektal kreft celler i nakne mus. Til slutt, tap av PTEN uttrykk i HCT116 og CT26, men ikke i Caco-2/15, førte til en økning i sin metastatiske potensial følgende hale-vene injeksjoner i mus.
Konklusjon /Betydning
til sammen disse resultatene tyder på at PTEN styrer celle polaritet, etablering av celle-celle veikryss, paracellulære permeabilitet, migrasjon og tumorigent /metastatisk potensial av menneskelige kolorektal kreft celler
Citation. Langlois MJ, Bergeron S, Bernatchez G , Boudreau F, Saucier C, Perreault N et al. (2010) Den PTEN fosfatase Controls Intestinal epitelceller polaritet og barrierefunksjon: Rolle i tykktarmskreft progresjon. PLoS ONE 5 (12): e15742. doi: 10,1371 /journal.pone.0015742
Redaktør: Hang Thi Thu Nguyen, Emory University, USA
mottatt: 31 august 2010; Godkjent: 22 november 2010; Publisert: 23.12.2010
Copyright: © 2010 Langlois et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Denne forskningen ble støttet av den kanadiske Institutes of Health Research (CIHR: www.cihr-irsc.gc.ca) (CTP-82942) og MT-14 405 (til NR). N.R. er en mottaker av en kanadisk Research Chair i signalering og Digestive patofysiologi. JC, C.S. og F.B. er forskere fra Fonds de la Recherche en Santé du Québec. S.B. er en mottaker av en post-doc fra den kanadiske Association of Gastroenterology /CIHR /CCFC. N.R., J.C., C.S., N.P., og F.B. er medlemmer av FRSQ-finansierte «Centre de Recherche Clinique Étienne LeBel». Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
tykktarms~~POS=TRUNC kreft~~POS=HEADCOMP (CRC) er den nest største årsaken til kreft-relaterte dødsfall i vestlige land. Et kjennetegn på tykktarmskreft er tap av mobilnettet organisasjonen. Den histologiske grad av kolorektale karsinomer er en viktig prognostisk variabel og avhenger av graden av kjertel differensiering og cellulær polaritet. Høyverdig, dårlig differensierte colorectal svulster er vanligvis mer aggressive enn sine lavgradig, godt differensierte kolleger [1].
I epitelceller, celle-celle adhesjon og apikal-basal polaritet er opprettholdt gjennom dannelsen av flere inter adhesjonssystemer som tett veikryss (TJs). TJ regulerer paracellulære diffusjon og funksjonelt segregerer plasmamembranen i to rom, noe som er et krav om full polarisering av epitelceller [2]. Neoplastiske celler ofte vise strukturelle og funksjonelle mangler i både trange og tilhenger veikryss [3] – [5]. Som gjennomgått av Martin og Jiang [4], er et uttrykk for mange trange veikryss proteiner feilregulert i kolorektal kreft. Den adherens krysset protein E-cadherin er også redusert i invasive kolorektal kreft [6]. I tillegg, [7], endrer ekspresjonen mønster av hDlg og hScribble, kjent for å kontrollere etableringen av apikal-basal polaritet i epitelceller markert i løpet av colorektal tumorprogresjon med nedregulering av begge proteiner å være assosiert med mangel på epitelceller polaritet og uoversiktlig vevsarkitektur [8].
Phosphoinositides har også dukket opp de siste årene som generelle determinanter for både polaritet og identitet flere membraner. Nyere data indikerer at ptdins (4,5) P2 er en viktig determinant for den apikale overflate i epitelceller [9]. Faktisk, i ikke-polarisert MDCK celler, både ptdins (4,5) P2 og ptdins (3,4,5) P3 colocalize på celle-celle og celle-ekstracellulær matrix kontakter. Men i løpet av de tidlige stadier av polarisering, ptdins (4,5) P2 blir hovedsakelig konsentrert på apikale membran av cellene mens ptdins (3,4,5) P3 forblir lokalisert til basolateral membran og ekskludert fra den apikale membranen. Den lipid fosfatase PTEN lokaliserer til den apikale domenet og er avgjørende for segregering av ptdins (4,5) P2 til den apikale overflaten på grunn av sin dephosphorylating handling på D3-fosfat gruppe ptdins (3,4,5) P3 [10 ]. Videre PTEN virker som en negativ regulator av fosfatidylinositol 3-kinase (PI3K) /Akt signalveien og har vist seg å påvirke mange prosesser deregulerte i tumorgenese, som proliferasjon, celleoverlevelse, migrering og invasjon [11], [12] .
PTEN er kodet av
fosfatase og tensin homolog slettet på kromosom 10 plakater (
PTEN
) tumor suppressor genet, som er den nest hyppigst muterte genet i humane kreftformer følgende
TP53 product: [12]. Videre er tapet av PTEN immunofarging i kolorektalkreft vev er assosiert med langt fremskreden sykdom, levermetastase og dårlig pasientoverlevelse [13] – [16], som tyder på dens potensielle beskyttende rolle mot progresjon av human kolorektal kreftutvikling. Siden PTEN styrer polaritet i normale epitelceller, kan man spekulere i at tapet av dette proteinet kan være tilstrekkelig til å utløse epitelial-mesenchymale overgang (EMT), en kritisk tidlig hendelse i invasjonen og metastasering av mange typer kreft, inkludert CRC. I tidligere studier har effekten av PTEN tap primært blitt målt i kreftcellelinjer som rommer en rekke andre transformere og onkogene mutasjoner og som har mistet sin epitelial fenotype [17] – [19]. En slik tilnærming har gjort det vanskelig å bestemme hvilken fenotyper er direkte gitt av tap av PTEN og for å definere stadier av tumordannelse som er spesielt endres i celler med PTEN tap. For ytterligere å karakterisere sammenhengen mellom PTEN, tap av polaritet og tykktarmskreft progresjon, vi brukte Caco-2/15 cellelinje avledet fra et forholdsvis godt differensiert human kolorektal adenokarsinom. Denne klon av moder Caco-2-cellelinjen har blitt grundig karakterisert for dets evne til å gjennomføre en fullstendig morfologisk og funksjonell tarm epitelial differensiering prosess som finner sted spontant når konfluens er blitt nådd, og som er avsluttet etter 15-20 dager post-konfluens . Mer spesifikt, disse colonic cellene danner apikale trange og tilhenger junctional komplekser og danne en polarisert mono etter flere dager med post-samløpet, viser transepitelial elektrisk motstand (Teer) ligner på
in vivo
observasjoner [20] – [22 ]. Følgende «de-differensierte» CRC-cellelinjer ble også analysert: HCT116 den, en mikro-ustabil human CRC cellelinje og CT26, en mus metastatisk colon carcinoma cellelinje. Resultatene viser at PTEN kan virke som en barriere for utvikling av kreft ved å kontrollere cellulære polaritet, etablering av celle-celle kryss, paracellulære permeabilitet, migrasjon og metastatisk potensial av humane kolorektale cancerceller.
Materialer og Metoder
Material og antistoffer
De antistoffer for påvisning av PTEN (A2B1), HNF1α (C-19) og HNF4α (C-19) ble kjøpt fra Santa Cruz Bioteknologi (Santa Cruz, California). Antistoffer dannet mot E-cadherin og villin var fra BD Biosciences (Mississauga, ON, Canada). De antistoffer for påvisning av fosfo-AKT (Ser473) og AKT var fra Cell Signaling Technology (Danvers, MA). Den β-aktin-antistoff var fra Chemicon (Temecula, CA). Den occludin, Claudins og ZO-1-antistoffer var alle fra Zymed Laboratories (Invitrogen, Burlington, ON, Canada). Monoklonalt antistoff HSI-14 mot sukrase-isomaltase ble vennlig levert av Dr Andrea Quaroni (Cornell University, Ithaca, New York). CDX2 immunoblotting ble utført med et kanin polyklonalt antistoff mot CDX2 tidligere karakteriserte [23]. Alle andre materialer ble hentet fra Sigma-Aldrich (Oakville, ON) med mindre annet er angitt
Cell kultur
Tre tykktarmskreft cellelinjer ble brukt i denne studien.
1-The tykktarms adenokarsinom cellelinje Caco-2/15 ble hentet fra A. Quaroni (Cornell University, Ithaca, New York). Denne cellelinje gir en unik og godt karakterisert modell for studiet av tarmen epitelial differensiering, siden disse cellene gjennomgå funksjonelle og morfologiske differensiering til en enterocyte fenotype med mikrovilli, kuppel formasjon, og ekspresjon av sukrase-isomaltase flere dager etter å ha nådd konfluens [20] – [22]. Disse cellene uttrykker avkortet
APC Hotell og mutert
p53
men utviser villtype
K-Ras
,
β-catenin Hotell og mismatch reparasjon (MMR) proteiner; de er derfor mikro stabile (MSS) [24], [25]. Disse cellene ble dyrket i Dulbeccos modifiserte Eagles medium (DMEM, Invitrogen ™) inneholdende 10% føtalt bovint serum (FBS). 2- HCT116-celler ble erholdt fra ATCC (CCL-247). Disse celler vokser i flere lag og er i stand til polarisering eller intestinal epithelial differensiering [20]. Disse cellene er hMLH1-mangelfull, uttrykker villtype
p53
, vill-type
APC Hotell og bære aktivere
K-Ras
,
pi3kca
, og
β-catenin
mutasjoner [26]. Disse cellene er metastatisk [27], [28] som tillater oss å analysere virkningen av PTEN tap av uttrykk i avanserte stadier av tykktarmskreft. Disse cellene ble dyrket i McCoys medium (Wisent, St-Bruno, Québec, Canada) inneholder 10% FBS. 3- CT26 celler (vennlig levert av Pr Nicole Beauchemin, Université McGill, Canada) ble hentet fra en udifferensiert murine adenokarsinom som ble indusert ved rektal injeksjon av
N
-nitroso-
N
-methylurethane i Balb /c-mus. Disse cellene bære aktivere
K-Ras
mutasjoner [29], villtype
p53 Hotell og uttrykker ikke E-cadherin eller ZO-1 [30]. CT26 celler ble holdt i RPMI medium (Invitrogen ™) som inneholder 10% FBS og penicillin-streptomycin.
Plasmid konstruksjoner og lentiviruses produksjon
lentiviral shRNA uttrykk vektor (pLenti6-U6) ble konstruert som tidligere beskrevet [31]. ShRNA oligonukleotider mot human PTEN ble utformet i henhold til retningslinjer (Ambion teknisk bulletin # 506) ved hjelp av siRNA-sekvenser gctaagtgaagatgacaatca (# 1), gcacaagaggccctagatttc (# 2), gccagctaaaggtgaagatat (# 3) med ttcaagaga som sløyfen sekvens. De oligonukleotid-glødet produkter ble subklonet inn pLenti6-U6 mellom
Bam
HI og
Xho
I områder. Et irrelevant pLenti-shGFP (gccacaacgtctatatcatgg) eller et mutert pLenti-shPTEN (shMUT) ble anvendt som negativ kontroll. Den muterte pLenti-shPTEN ble generert ved å endre 3 nukleotider i sekvensen av de mest effektive shRNA mot PTEN (# 2) som resulterer i den siRNA sekvens gcacaagataacctagatttc. Den shRNA mot murine form av PTEN (TRCN0000028992) og en tilsvarende kontroll shRNA (shTGFP) mot TurboGFP ™ (SHC004) ble oppnådd fra Sigma-Aldrich. Lentiviruses fremstilt i 293T-celler ble benyttet for celle infeksjon i henhold til Invitrogen anbefalinger (ViraPower Lentiviral Expression System). Ingen induksjon av
OAS1
genekspresjon ble oppdaget av Q-PCR-analyse i forsøk med lentiviruses infeksjon (data ikke vist).
OAS1 plakater (2050-oligoadenylat syntetase) er en klassisk interferon target gen og har blitt anbefalt som en viktig test for interferon induksjons før tilskrive en bestemt respons til genet målrettet [32].
Protein utvinning og Western blot-analyse
Protein ekstraksjoner og Western blot-analyse ble utført som tidligere beskrevet [22].
Transmisjonselektronmikros elektron~~POS=TRUNC mikros~~POS=TRUNC
prøver ble behandlet som tidligere beskrevet [22] og observert på en Hitachi H-7500 transmisjonselektronmikroskop.
Scanning elektronmikroskopi
Caco-2/15-celler ble sådd ut på små lameller av 12 mm i diameter og fast som tidligere beskrevet for transmisjonselektronmikroskopi [22] opp til dehydratiseringstrinnet i etanol. Prøvene ble så kritisk punkt tørket med CO
2 og dekket med gull-palladium med en frese belegger. Belagte celler ble deretter observert med et JEOL scanning elektronmikroskop (modell: JSM-840).
Bestemmelse av transepitelial elektrisk motstand
Caco-2/15-celler ble sådd ut på Transwell® permeable membraner ( Corning, Acton, MA). Teer ble målt 3 og 9 dager etter at cellene hadde nådd samløpet med en epitelial Voltommeter (World Precision Instrument, modell EVOM-G).
RNA analyse
Total RNA isolering, RT-PCR og Q-PCR ble utført som tidligere beskrevet [31]. Target uttrykk ble kvantifisert relativt til PDGB uttrykk. Primere for hvert gen ble utformet i ekson-exon veikryss ved hjelp av Primer3 programvare [33]. Primer sekvenser og Q-PCR betingelser er tilgjengelig på forespørsel.
Migrasjon analyser
Analysene ble utført i henhold til den skarpe barberblad teknikk som tidligere rapportert [34].
analyser av rac og Cdc42 aktiviteter
GTP-bundet nivåer av rac og Cdc42 ble analysert med en G-LISA aktiveringstest biokjemi kit (Cytoskjelett, Denver, CO) i henhold til produsentens instruksjoner.
Invasion analyser
Invasion analysene ble utført ved hjelp av BD BioCoat ™ Matrigel ™ Invasion Chambers med 8-mikrometer polycarbonated filtre (BD Biosciences). Celler ble sådd ut i medium uten serum i nærvær av 2 mM hydroksyurea, et farmakologisk inhibitor av cellulær ribonukleosid reduktase å stanse cellesyklus i G1 /S-fasen [35]. Media inneholdende 20% FBS ble anvendt som kjemotiltrekkende. Etter en inkubasjonstid på 48 timer ved 37 ° C, ble ikke-invasive celler fjernet i henhold til produsentens prosedyre og invaderende celler ble fiksert med metanol 100%. Cellene ble deretter farget med krystallfiolett 1%.
Dyremodeller
Kvinne hårløse mus CD1
nu /nu Hotell og Fox Chase SCID Beige mus ble kjøpt fra Charles River (Wilmington , MA). Alle forsøksprotokoller ble godkjent av etikkomiteen for forsøk med dyr av Université de Sherbrooke.
Tumor vekst
: Totalt 2 × 10
6 celler suspendert i 100 ul DMEM ble injisert i rygg subcutaneous vev av fem uker gamle hunnmus CD1
nu /nu
. Musene ble avlivet etter 42 dager etter injeksjon for Caco-2/15 og 30 dager etter injeksjon for HCT116. Svulster ble skåret ut og veiet.
Eksperimentelle nålevenen analyser:
halevenen til fem uker gammel kvinnelig CD1
nu /nu
mus eller Fox Chase SCID Beige mus ble injisert med 10
6 Caco-2 /15, HCT116 eller CT26 celler suspendert i 100 ul DMEM. Dyrene ble ofret på ethvert tegn til åndenød eller vekttap, eller etter 14 dager etter injeksjon for CT26, 75 og 35 dager etter injeksjon for HCT116 injiseres i henholdsvis CD1
nu /nu Hotell og Fox Chase SCID Beige mus og 60 dager etter injeksjon for Caco-2/15 celler injisert i Fox Chase SCID Beige mus. Lungene ble opprettholdt i Bouins fiksativ i 24 timer. Individuelle lapper ble deretter separert og det totale antallet overflate synlig metastaser ble bestemt.
Menneskelige svulster
Prøver av tykktarm kreft og sammenkoblede normale tykktarm vev (minst 10 cm fra tumor) har blitt oppnådd fra pasienter som skal gjennomgå kirurgisk reseksjon. Pasientene fikk ikke neoadjuvant kjemoterapi eller strålebehandling. Vev ble oppnådd etter pasientens skriftlig informert samtykke, i henhold til protokollen er godkjent av Institutional Menneskelig Subject Review Board av Centre Hospitalier Universitaire de Sherbrooke. Kliniske og patologisk opplysninger ble hentet fra pasientjournaler. Adenom prøver var endoskopisk inoperabel og definert som avansert grunn av sin størrelse større enn 1 cm eller ved tilstedeværelse av høygradig dysplasi eller villøse komponent. Pasientens kreft ble histologisk klassifisert og gradert etter overordnede TNM staging kriterier (basert på Tumor-, lymfe Node- og Metastatic- status). Alle vev ble frosset i flytende nitrogen i løpet av 15 min fra reseksjon som anbefalt av Canadian Tumor Repository Network (www.ctrnet.ca). For proteinekstraksjon, var forbundet vev lysert i Triton prøvebuffer (100 mM NaCl, 5 mM EDTA [pH 8,0], 50 mM Tris-HCl [pH 7,5], 1% Triton X-100, 5% glycerol, 1 mM PMSF, 0,2 mM ortovanadat, 40 mM β-glycerofosfat, 50 mM NaF, og 2% protease inhibitor cocktail [P 8340, Sigma-Aldrich]) og immunoblottet som tidligere beskrevet [22].
data-presentasjon
Typiske resultater vises er representative for 3 uavhengige eksperimenter. Statistikken ble beregnet ved hjelp av Student to halet t-test. Forskjeller ble betraktet som signifikant ved * p≤0.05 eller *** p≤0.005. Densitometriske analysene ble utført ved hjelp av Image J programvare.
Resultater
PTEN styrer colonic epitelcelledifferensiering polarisering og differensiering
For å undersøke effekten av PTEN tap av uttrykket på differensiering og polarisering av kolorektal kreft celler, rekombinante lentiviruses koder korte hårnål RNA (shRNAs) ble først utviklet for å stabilt undertrykke PTEN mRNA nivåer i Caco-2/15 celler. Flere lentiviral konstruksjoner ble testet for deres evne til å slå ned PTEN. Den mest effektive shRNA ble betegnet shPTEN (data ikke vist). Caco-2/15 celler ble heretter infisert med shPTEN lentiviruses eller med irrelevante shGFP lentiviruses eller lentiviruses uttrykker en shPTEN med 3 mismatch nukleotider (shMUT) som negative kontroller. Den pLenti6-U6 lentiviral vektor, som coexpresses en blasticidin S motstand genet, tillot utvalg av rene populasjoner av transduced celler innen 7 dager. Som vist i figur 1 A, ble PTEN proteinnivåer nesten helt slått ned i Caco-2/15 celler som uttrykker shPTEN ( 90%); denne reduksjonen ble opprettholdt under post-konfluens. Av notatet, PTEN nedregulering ble også assosiert med en økning i AKT fosforylering, hoved nedstrøms effektor av PI3K, bekrefter at PI3K veien ble aktivert i shPTEN uttrykker-celler.
Caco-2/15 celler infisert med enten rekombinante lentiviruses koder for en shRNA som spesifikt slår ned PTEN (shPTEN) eller negativ kontroll shRNAs (shGFP eller shMUT). A og C. Etter utvalg av infiserte celler, Caco-2 /ble 15 lysert ved -2, 0, 3, 6, 9 og 12 dager post-Confluence. Proteinene ble deretter analysert ved hjelp av Western blot. B. Venstre paneler: Nylig konfluente Caco-2/15 celler som uttrykker shGFP eller shPTEN ble observert av optisk mikroskopi. Skala barer = 100 mikrometer. Midt paneler: Nylig konfluente Caco-2/15 celler uttrykker shGFP eller shPTEN ble fiksert og observert av transmisjonselektronmikroskopi. Skala barer = 2 mikrometer. Høyre panel: Nylig konfluent shGFP eller shPTEN uttrykker-celler ble observert ved scanning elektronmikroskopi. Skala barer = 1 mikrometer.
For å analysere om PTEN har en innvirkning på Caco-2/15 celle polarisering, celle morfologi ble først undersøkt ved ulike dager samløpet. Som observert av optisk mikroskopi, ble celle superficy signifikant økt med 5,3 ganger (p 0,005 analysert av Metamorph programvare) i nylig konfluent Caco-2/15 celler som uttrykker shPTEN sammenlignet med kontrollceller (figur 1B, venstre panel). I tillegg transmisjonselektronmikroskopi-analyse viste at nylig sammenflytende kontrollceller allerede hadde begynt å polar mens PTEN-manglende celler som fortsatt opprettholdt et flattrykt utseende (figur 1B, midtre panel). 3 dager efter konfluens celler med redusert PTEN uttrykk bare begynte å polar mens kontrollcellene har allerede fått sin sylindriske form (data ikke vist). Nedregulering av PTEN resulterte også i et redusert antall mikrovilli på celle apikale membran som observert ved elektronmikroskopering (figur 1B, høyre panel). Av notatet, ble uttrykk nivåer av funksjonelle differensiering markører sukrase-isomaltase og villin også markert redusert i PTEN-utarmet celler (figur 1C).
neste verifisert om PTEN stanse endrer uttrykk for hepatocytter atom faktorer 1a ( HNF1α) og 4 (HNF4α) samt caudal relaterte homeobox transkripsjonsfaktor 2 (Cdx2) som er kjent for å kontrollere intestinale epitelcelledifferensiering [36]. Som vist på figur 1C, mens ekspresjonsnivåer av HNF4α ble beskjedent redusert i sammenflytende PTEN-manglende Caco-2/15 celler, ekspresjon av HNF1α og Cdx2 ble markert redusert (figur 1C). Tatt sammen indikerer disse resultater at PTEN er viktig for epitelcelle polarisasjon, så vel som funksjonelle og morfologiske differensiering av intestinale epitelceller. Av notatet, disse effektene ikke ut til å være en indirekte konsekvens av endring i celleproliferasjon siden Caco-2/15 celler som uttrykker shPTEN utstilt samme spredning rente enn kontrollceller og slutte å spre seg så snart de nådde samløpet (data ikke vist) .
PTEN nedregule svekker tight junction integritet i tykktarm epitelceller
Siden inter veikryss er regulatorer av celle polaritet [2], [5], neste verifiserte vi om uttrykket av shPTEN hadde en effekt på celle veikryss. Under transmisjonselektronmikroskopi, adherens veikryss dukket uendret (figur 2A, piler) i PTEN-mangel Caco-2/15 celler mens tett veikryss dukket opp mindre organisert i 3 dager etter Confluence (Figur 2A, vinkler etc.). Som et spørsmål om faktum, ble ustrukturert masse proteiner systematisk observert uten å stramme til membranen på den vanlige plasseringen av tett veikryss. Følgelig barrierefunksjonen av tett veikryss ble også svekket som sett ved reduksjon i teer målt i shPTEN-uttrykkende celler sammenlignet med kontrollceller ved 3 og 9 dager etter confluence (figur 2B). For å få ytterligere innsikt i måten der PTEN styrer krysset integritet, uttrykk nivåer av flere viktige synaptiske proteiner som occludin, ZO-1 og Claudins [2] ble analysert. Proteinekspresjon av Claudins 1, 3, 4 og 8 ble signifikant redusert i både Subkonfluente og post-konfluente shPTEN celler (figur 2C). Av notatet uttrykk for adherens krysset protein E-cadherin ble også svekket i post-konfluente shPTEN celler (figur 2C).
A. Caco-2/15 celler som uttrykker shMUT eller shPTEN ble løst etter 3 dager etter samløpet og observert av transmisjonselektronmikroskopi. Skala barer = 500 nm. Pilene viser adherens veikryss mens parentes angir tett veikryss. B. Caco-2 ble dyrket /15-celler på porøse membraner hvoretter transepitelial motstand ble målt i triplikat 3 og 9 dager etter at cellene nådde konfluens. *** Signifikant forskjellig på p≤0.005 (t-test). C. Caco-2/15 celler som uttrykker shGFP eller shPTEN ble lysert ved -2, 0, 3, 6, 9 og 12 dager post-konfluens, fulgt av Western blot-analyse av synaptiske proteiner.
Loss av PTEN uttrykk i Caco-2/15 celler stimulerer migrasjon /invasjon, fremmer tumorvekst, men er ikke tilstrekkelig til å gi metastatisk potensial
in vivo
Tap av inter veikryss er godt kjent for å være assosiert med økt celle migrasjon og invasjon kapasiteter [4]. Videre PTEN er blitt vist å kontrollere slike prosesser i andre celletyper [11]. Ved hjelp av sår-lukke analyser, ble migrering av nylig sammenflytende kontrollceller sammenlignet med den til shPTEN-uttrykkende populasjoner. Som vist i figur 3A, evne til shPTEN-uttrykkende Caco-2/15-celler til å migrere ble markert økt sammenlignet med kontroll-celler, som bestemt ved å måle den relative område som dekkes av migrerende celler. Vi observerte også at nedregulering av PTEN markert stimulert Caco-2/15 celle løsgjøring etter trypsinering (data ikke vist). Disse data indikerer at PTEN-gentranskript stanse i CRC-celler forbedrer deres evne til å spre og migrere. Siden PTEN har vist seg å påvirke migreringen gjennom aktivering av de små GTPases Rac1 og Cdc42 [37], ved analyserte vi om deres respektive ekspresjon og aktivitet ble påvirket av tap av PTEN uttrykk. Som vist i figur 3B, både Rac og Cdc42 vises høyere GTP-bundet nivåer i Subkonfluente og konfluent shPTEN-uttrykkende celler sammenlignet med kontrollceller.
A. Venstre paneler: Cell morfologi ble analysert ved fasekontrastmikroskop ved subconfluence. Høyre panel: Nylig konfluente celler som stabilt uttrykker shMUT eller shPTEN ble såret og behandlet med 2 mM hydroksyurea. Etter 48 timer ble bevegelse av den koherente arket på tvers av den lineære sår margin (hvit linje) evaluert ved fasekontrastmikroskopi. Grafen til høyre viser den relative området som dekkes av trekkende celler som vurderes på 5 forskjellige sår forsøk per tilstand ved hjelp av Image J programvare. Skala barer = 100 mikrometer. B. Aktivert nivåer av GTP-bundet Rac eller Cdc42 ble analysert med G-LISA aktiverings analyse biokjemi kits på Subkonfluente (SC) og nylig sammenflytende (C) Caco-2/15 celler. C. invasjon av celler ble undersøkt ved hjelp av Matrigel-belagte Transwells. Etter 48 timer ble invaderende celler fiksert, farget med krystallfiolett 1% og telles. D. Subkonfluente shMUT og shPTEN-uttrykke Caco-2/15 celler ble lysert og total RNA isolert for genekspresjon analysert av Q-PCR. Det relative nivå av hvert RNA ble beregnet ved bruk av standardkurven fremgangsmåte og normalisert til den tilsvarende PDGB RNA-nivå. E. 2 x 10
6 prolifererende Caco-2/15 celler som uttrykker shMUT eller shPTEN ble injisert subkutant i nakne mus 5 per tilstand. Tumorvekt ble evaluert 42 dager etter injeksjon. * P≤0.05, *** p≤0.005, statistiske forskjeller bestemmes ved hjelp av t-test.
Effekten av PTEN mangel på invasjonen ble også bestemt å bruke BD BioCoat Matrigel invasjonen kamre. Som vist i figur 3C, Caco-2/15-celler som uttrykker de shPTEN klart oppviste økte invasive kapasiteter i forhold til shMUT-uttrykkende celler. Invasjon ikke bare involverer nedbrytning av celle-celle kryss og øket bevegelighet av tumorceller, men også brenn proteolyse av den ekstracellulære matriks. Som vist i figur 3D, analyser Q-PCR avslørte at ekspresjonsnivåene av matriks-metalloproteinaser 2 og 9 (MMP2 og MMP9), osteopontin (OPN) og uPA (urokinase-type plasminogen aktivator) var signifikant oppregulert i shPTEN-uttrykkende Caco- 2/15 celler.
tumorigenicity av Caco-2/15 cellepopulasjoner ble neste vurdert ved subkutan injeksjon i flanken av nakne mus. Som vist i figur 3E, nedregulering av ekspresjon PTEN i Caco-2/15 celler sterkt øket deres evne til å indusere tumorer in vivo.
Til slutt, undersøkte vi hvorvidt PTEN reduksjon i Caco-2/15-celler er tilstrekkelig til å indusere tumormetastase
in vivo
, ved bruk av eksperimentelle metastaser halevenen assay. Fox Chase SCID beige mus injisert med kontrollen eller PTEN-manglende Caco-2/15 celler i halevenen mislyktes i å utvikle metastaser og med 60 dager etter injeksjon (data ikke vist), noe som indikerer at PTEN nedregulering er ikke tilstrekkelig til å gi et metastatisk potensiale til godt differensierte CRC celler.
Tap av PTEN uttrykk stimulerer migrasjon /invasjon, forbedrer tumorvekst og induserer metastatisk potensial på HCT116 cellene
in vivo
virkningen av PTEN lyddemping ble også vurdert i mikro-ustabil dedifferensieres cellelinje HCT116. I disse cellene, PTEN stanse også resultert i forbedret fosfo-Akt (figur 4A), forbedret kapasitet på begge migrasjon på såret (figur 4B) og invasjon (figur 4C), i tillegg til å være forbundet med en betydelig økning i Rac aktivitet (1.5 fold, p 0,005) og OPN uttrykk (1,9 ganger, p 0,005) (data ikke vist). Av notatet, ble uttrykk nivåer av MMP-2, MMP-9 og uPA i kontroll HCT116-celler som allerede er sterkt forhøyet og PTEN lyddemping ikke ytterligere forbedre mRNA-nivåer av disse molekylene (data ikke vist). Den tumorigenicity av HCT116 cellepopulasjoner ble også vurdert ved subkutan injeksjon i flanken av nakne mus. Som vist i figur 4D, nedregulering av ekspresjon PTEN i HCT116-celler økte deres evne til å indusere tumorer
in vivo
.
A. HCT116-celler ble infisert enten med rekombinante lentiviruser som koder for shMUT eller shPTEN. Etter valg av infiserte celler, ble prolifererende celler lysert og protein uttrykk ble analysert ved Western blot. B. Venstre paneler: Cell morfologi ble analysert ved fasekontrastmikroskop ved subconfluence. Høyre panel: Nylig konfluente celler ble såret og behandlet med 2 mM hydroksyurea. Etter 48 timer ble bevegelse av den koherente arket på tvers av den lineære sår margin (hvit linje) evaluert ved fasekontrastmikroskopi. Grafen til høyre viser den relative området som dekkes av trekkende celler som vurderes på 5 forskjellige sår forsøk per tilstand ved hjelp av Image J programvare. Skala barer = 100 mikrometer. C. invasjon av celler ble undersøkt ved hjelp av Matrigel-belagte Transwells. Etter 48 timer ble invaderende celler fiksert, farget med krystallfiolett 1% og telles. D. 2 × 10
6 prolifererende HCT116-celler som uttrykker shMUT eller shPTEN ble injisert subkutant i 5 hårløse mus per tilstand. Tumorvekt ble evaluert 30 dager etter injeksjon. * Signifikant forskjellig ved p≤0.05.
Til slutt, undersøkte vi hvorvidt PTEN reduksjon i HCT116-celler er tilstrekkelig til å indusere tumormetastase
in vivo
, gjennom bruk av halevenen assay.
