Abstract
BBF2H7 er en endoplasmatiske retikulum (ER) -resident transgrunn leucine zipper (bzip) transkripsjonsfaktor som er spaltes ved det transmembrane domenet av regulert intramembrane proteolyse som reaksjon på ER stress. Den spaltede cytoplasmatiske N-terminale ende inneholdende transkripsjonsaktivering og bzip domener translocates inn i kjernen for å fremme ekspresjonen av målgener. I kondrocytter, er det spaltes luminal C-terminus ekstracellulært utskilt og letter spredning av nabocellene ved aktivering av pinnsvin signalering. I denne studien fant vi at
Bbf2h7
uttrykk nivåer betydelig økt med 1,070 til 2,567 ganger i flere krefttyper, inkludert glioblastom sammenlignet med de i respektive normalt vev ved hjelp av ONCOMINE Cancer Profilering Database. I noen Hedgehog ligand-avhengige kreftcellelinjer inkludert glioblastom U251MG celler, ble BBF2H7 C-terminus utskilt fra celler i kulturmedier og fremmet cancer celleproliferasjon gjennom aktivering av pinnsvin signalering. Knockdown av
Bbf2h7
uttrykk trykkes spredning av U251MG celler ved downregulating Hedgehog signalering. Den nedsatt celleformering og pinnsvin signale ble gjenvunnet ved tilsetning av BBF2H7 C-terminus til kulturmediet av
Bbf2h7
-knockdown U251MG celler. Disse dataene tyder på at det utskilte luminal BBF2H7 C-terminus er involvert i pinnsvin ligand-avhengig cancer celleproliferasjon gjennom aktivering av pinnsvin signalering. Dermed kan BBF2H7 C-terminalen være en roman mål for utvikling av kreft narkotika
Citation. Iwamoto H, Matsuhisa K, Saito A, Kanemoto S, Asada R, Hino K, et al. (2015) Promotion of Cancer Cell Proliferation av Spaltet og utskilt Luminal domener av ER Stress Svinger BBF2H7. PLoS ONE 10 (5): e0125982. doi: 10,1371 /journal.pone.0125982
Academic Redaktør: Maria Cristina Vinci, Centro Cardiologico Monzino, ITALIA
mottatt: 15 desember 2014; Godkjent: 27 mars 2015; Publisert: 8. mai 2015
Copyright: © 2015 Iwamoto et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet: All relevant data er innenfor papir
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet delvis med tilskudd fra Takeda Science Foundation, The Yasuda Medical Foundation, The Nakajima Foundation, The Tokyo biokjemiske Research Foundation, Kobayashi International Scholarship Foundation, Nagase Science Technology Foundation , Mitsubishi Foundation, SEI Gruppe CSR Foundation og The Japan Society for Promotion of Science KAKENHI (25/677, 25251014, 25650069, 25861324, 24300135, 26460099). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
endoplasmatiske retikulum (eR) er den sentrale cellulære organeller ansvarlig for syntesen, bretting og posttranslasjonelle modifikasjoner av proteiner bestemt for sekretoriske vei. Forskjellige patofysiologiske tilstander, slik som ER kalsiummangel, oksidativt stress, hypoglykemi, ekspresjon av mutante proteiner og hypoksi, forstyrre den korrekte folding av proteiner, og misfolded eller ubrettede proteiner akkumuleres i ER lumen. Slike tilstander, som samlet betegnes ER stress, har potensial til å indusere celleskader. ER svarer til disse forstyrrelser ved å aktivere en integrert signaltransduksjonsbane kalt den ufoldede protein respons (UPR) [1,2]. Aktivering av UPR fører til forbigående translasjonsforskning demping for å redusere kravene til akuttmottaket, til transcriptional induksjon av gener som koder for ER-resident anstand lette proteinfolding, og ER-assosiert degradering (erad) for å degradere de brettede proteiner som har fremkommet i ER. I pattedyrceller, er det tre veletablerte ER stress transdusere: dobbelt-trådet RNA-avhengig proteinkinase-lignende endoplasmatiske retikulum kinase (PERK), inositol-krever enzym-1 (IRE1), og aktivering av transkripsjonsfaktor 6 (ATF6) [ ,,,0],3-5]. PERK direkte fosforylerer den α-subenheten av eukaryotisk initiering faktor (eIF2α), som fører til en dramatisk reduksjon i cellulære proteinsyntesen [6]. Omvendt, og paradoksalt nok, fosforylering av eIF2α oppregulerer også uttrykk for ATF4 [1]. ATF4 transaktiverer ekspresjonen av de pro-apoptotiske protein, C /EBP-homologe protein (CHOP), pro-overlevelses proteiner, slik som ER anstand, og anti-oksidative stressproteiner [7]. IRE1 behandler unspliced former for
X-box-bindende protein-1 product: (
Xbp1
) mRNA å generere spleisede former av mRNA [4,8]. XBP1 proteiner fra de spleisede former for
Xbp1
mRNA indusere uttrykk for ER-resident anstand og erad-relaterte molekyler. ATF6 spaltes på sitt transmembrane av språk-1 og -2 proteaser (S1P og henholdsvis S2P,) som svar på ER stress [5,8]. Den spaltede ATF6 N-terminus translocates inn i kjernen og induserer ekspresjon av ER-resident anstand for å lette proteinfolding.
I tillegg til de tre kanoniske ER stress-transdusere, er det nye typer av ER stress transdusere som deler domener av høy sekvenslikhet med ATF6. Disse transkripsjonsfaktorer har transkripsjonsaktivering og grunnleggende leucine glidelås (bzip) domener i sin N-terminale og inkluderer BBF2H7 /CREB3L2 [9], OASIS /CREB3L1 [10,11], Luman /LZIP /CREB3 [12], CREBH /CREB3L3 [ ,,,0],13] og CREB4 /AIbZIP /Tisp40 /CREB3L4 [14]. En av de OASIS familiemedlemmer, BBF2H7, fortrinnsvis uttrykt i chondrocytes [15,16]. BBF2H7 spaltes ved det transmembrane domenet av regulert intramembrane proteolyse (RIP) som svar på ER stress. Den spaltede cytoplasmatiske N-terminale inneholder transkripsjonsaktivering og bzip domener translocates inn i kjernen for å fremme uttrykket av målgener inkludert
Sec23a product: [15]. I motsetning til dette er det spaltede C-terminus ekstracellulært utskilt og direkte binder til både Indian pinnsvin (Ihh) og dens reseptor, Lappet-1 (Ptch1), etterfulgt av aktivering av pinnsvin (Hh) signalering [16]. Den veien mediert av BBF2H7 C-terminus spiller en rolle i spredning av kondrocytter i utviklings brusk. Funksjonene til både N- og C-terminale ende er avgjørende for utvikling av mus brusk.
Hh signalering er nødvendig for celledifferensiering og organdannelse i løpet av embryogenesen [17]. I den voksne, forblir Hh signale aktiv i enkelte organer hvor det er innblandet i regulering av stamcelle vedlikehold og formering. Hos pattedyr er Hh signalveien initiert av tre Hh ligander (Sonic pinnsvinet [Shh], Desert pinnsvin [DHH] og IHH) [18]. HH ligander bindes til den transmembrane Hh-reseptoren, Ptch1. I fravær av Hh ligander hemmer Ptch1 funksjonen av transmembranprotein, glattes (Smo), som aktiverer gliom-assosiert onkogen 1 (Gli1) [19,20]. Når Hh ligander bindes til Ptch1 er Smo frigjøres fra hemming og fremmer aktivering av Gli1 transkripsjonsfaktor. Aktivert Gli1 initierer transkripsjon av Hh målgener som
Gli1
,
gaffelhodeboks L1 product: (
Foxl1
),
Ptch1
,
Cyclin D1 Hotell og
Cyclin E1 product: [21].
Hh signalering er også involvert i kreft opprykk. Pasienter med Gorlin syndrom (eller basalcelle nevus syndrom) har arvet inaktiverende mutasjoner i Ptch1, som fører til konstitutivt aktiv Hh signalering i fravær av Hh-ligander [22]. Disse pasientene har en høy forekomst av basalcellekreft (BCC), en hud svulst av keratinocytter, i tillegg til Medulloblastomas og rhabdomyosarcomas. Nesten alle tilfeller av sporadiske BCC er forårsaket av aktivering av Hh signalveien gjennom Ptch1 tap av heterozygositet og /eller inaktivere eller aktive mutasjoner i Smo, som minsker sin hemming av Ptch1. Videre har flere Hh ligand-avhengige krefttyper som involverer overekspresjon av Hh ligander har blitt identifisert i de siste årene, inkludert lunge, bukspyttkjertel, bryst og prostata cancer [23,24]. I alle tilfeller er disse kreftformer svare på Hh ligander på en autokrin måte. Hh ligander utskilt fra kreftceller virker på utskillende celler (eller nabokreftceller) for å stimulere cellevekst og /eller overlevelse, som fører til tumorvekst. Derfor kan spesifikke inhibitorer av Hh signale tjene som anticancermidler. Men det er fortsatt uklart hvordan Hh ligander, deres reseptor Ptch1 og nedstrøms signalisering er regulert i kreftceller.
Som nevnt ovenfor, aktiverer BBF2H7 C-terminus Hh signalisering ved direkte binding til både Hh ligand og Ptch1, som fremmer cellevekst. Interessant,
Bbf2h7
genet ble først identifisert som partner av
smeltet i sarkom product: (
FUS
) i en kimære genet finnes i lavgradig fibromyxoid sarkom (LGFMS) [25]. Nye rapporter har vist at Hh og Hh målgener er oppregulert i LGFMS pasienter [25,26]. Derfor hypotese vi at BBF2H7 kan ha en viktig rolle i spredning av Hh ligand-avhengige kreftceller. Her fant vi at den spaltes BBF2H7 C-terminalen skilles fra visse typer kreftceller og fremmer cellevekst gjennom aktivering av Hh signalering.
Materialer og Metoder
ONCOMINE microarray datasett for
Bbf2h7
uttrykk
Microarray datasett for glioblastom (The Cancer Genome Atlas-glioblastoma multiforme og Brain Nedre Grade Glioma DNA Kopier Nummer data, 2013), invasive ductal brystkreft (The Cancer Genome Atlas-invasiv brystkreft Gene Expression data, 2011), cervical squamous carcinoma [27], prostata adenokarsinom [28], colon adenokarsinom [29], adenokarsinom i ventrikkel (The Cancer Genome Atlas-mage adenocarcinoma DNA Kopier Nummer data, 2013), og bukspyttkjertelen adenokarsinom (Kreft Genome Atlas-bukspyttkjertelen adenokarsinom DNA Kopier Nummer data, 2013) ble vist ved hjelp av ONCOMINE Cancer Profiling Database (versjon 4.4.4.4, www.oncomine.org) for å undersøke
Bbf2h7
uttrykk i ulike kreftformer.
Cellekultur kultur~~POS=HEADCOMP
HEK293T (avledet fra humane embryonale nyre; American Type Culture Collection [ATCC]),
Bbf2h7
– /- mus embryonale fibroblast (MEF, avledet fra
Bbf2h7
– /- mus ved hjelp av tidligere publiserte protokoller [15 ]), MCF7 (avledet fra human brystcancer; ATCC) og HeLa (avledet fra human kreft i livmorhalsen; ATCC) celler ble dyrket i Dulbeccos modifiserte Eagles medium (Life Technologies) inneholdende 10% føtalt bovint serum (FBS). LnCap (avledet fra human prostata kreft; ATCC) -celler ble dyrket i Roswell Park Memorial Institute medium 1640 (Life Technologies) inneholdende 10% FBS. U251MG (avledet fra human glioblastom; JCRB Cell Bank) og LS174T (avledet fra human koloncancer; ATCC) celler ble dyrket i Eagles minimale essensielle medium (DS Pharma) inneholdende 10% FBS. For å lindre ER stress, ble kreftceller behandlet med 4-fenylbutyrat (4-PBA, WAKO), en kjemisk anstand. Å indusere ER stress, ble kreftceller behandlet med 1 mikrometer thapsigargin. (TG, WAKO), en hemmer av ER Ca
2 + -ATPase
RNA isolering, revers transkripsjon-PCR (RT-PCR) og kvantitativ real-time PCR
Total RNA ble isolert ved fenol-guanidin-metode under anvendelse av ISOGEN (Nippon Gene) i henhold til produsentens protokoll. Porsjoner av en mikrogram renset RNA ble revers transkribert til første-cDNA i en 20 mL reaksjon volumet med 200 U Moloney murine leukemia virus revers transkriptase (Life Technologies) [30]. PCR ble utført ved anvendelse av spesifikke primersett i et totalvolum på 20 ul som består av en pl cDNA, 0,5 uM av hver primer, 0,2 mM dNTPs, en U DNA-polymerase (Agilent), og PCR-buffer (Agilent). Primersekvensene var som følger:
Gli1
fremover, 5′- GAAGCCGTATGTATGTAAGCTCC-3 «;
Gli1
revers, 5′-CTTGGGCTCCACTGTAGAAATG-3 «;
Foxl1
fremover, 5’ACAGGCATAGAGGTGACTTTTGG-3 «;
Foxl1
revers, 5′-TTCACAGAGGCTGAGAGTTTGG-3 «;
Xbp1
fremover, 5’ATGGATGCCCTGGTTGCTGAAG-3 «;
Xbp1
revers, 5’GGGTCCAAGTTGTCCAGAATGC-3 «;
β-aktin
fremover, 5’TCCTCCCTGGAGAAGAGCTAC-3 «;
β-aktin
revers, 5’TCCTGCTTGCTGATCCACAT-3 «. PCR-syklus parametere var 20 s ved 94 ° C, 20 s ved 58 ° C, og 25 s ved 72 ° C for 18-33 sykluser (
Gli1
, 33;
Foxl1
, 31 ;
Xbp1
, 25;
β-actin
, 18) etterfulgt av 72 ° C i 5 minutter. Aliquoter (5 pl) av hver reaksjonsblanding ble underkastet elektroforese på 4,8% polyakrylamidgeler. Tettheten av hvert bånd ble kvantifisert ved hjelp av Photoshop Elements 6.0 (Adobe Systems).
For å analysere mRNA uttrykk nivåer, kvantitativ real-time PCR ble utført ved hjelp av lys Cycler 480 System II (Roche) og Lysesykler SYBR Grønn jeg Master (Roche). PCR reaksjoner ble utført ved hjelp av KAPA SYBR FAST qPCR Kit Optimalisert for Light Cycler 480 (KAPA). Alle resultater ble normalisert til uttrykket av endogen
β-aktin
mRNA og ble uttrykt som relativ økning eller reduksjon i uttrykket sammenlignet med kontrollene.
Western blotting
Proteiner var trekkes ut fra cellene ved bruk av cellelyseringsbuffer (1% Triton X-100, 100 mM EDTA, 50 mM NaCl, 10 mM HEPES, 500 mM sukrose, og en protease inhibitor cocktail [MBL International]). Proteinkonsentrasjonene av cellelysatene ble bestemt ved anvendelse av en Pierce BCA Protein Assay kit (Thermo). Like mengder protein ble underkastet elektroforese på 12% SDS-polyakrylamidgeler, og deretter overført til polyvinylidendifluorid-membraner (Bio-Rad). For immunoblotting ble følgende antistoffene og fortynninger anvendt: polyklonalt kanin-anti-BBF2H7 C-terminale ende (Abcam, 1: 1000), polyklonalt muse-anti-BBF2H7 N-terminale ende (den genererte antistoff [15]; 1: 1000), monoklonalt mus anti-β-aktin (Sigma, 1: 3000), polyklonalt kanin-anti-interleukin 6 (IL-6) (Abcam, 1: 250), alkalisk fosfatase-konjugert anti-kanin-IgG (Sigma, 1: 3000), og alkalisk fosfatase-konjugert anti-mus IgG (Enzo, 1: 3000). Merkede proteiner ble oppdaget ved hjelp av nitro-blå tetrazoliumklorid (WAKO) og 5-brom-4-klor-3′-indolylphosphatase p-toluidine salt (Roche).
Immunpresipitasjon
For å oppdage BBF2H7 C-terminus i kulturmediet, ble dyrkningssupernatanter inkubert med anti-BBF2H7 N-terminale ende, anti-BBF2H7 C-enden, eller anti-IL-6 antistoffer over natten. Prøvene ble deretter utfelt med protein G-agarosekuler (Life Technologies), etterfulgt av western-blotting. IL-6 ble brukt som en lasting kontroll.
Immunohistochemistry
Kreftprøver ble tatt under operasjonen av Hiroshima universitetssykehus, frosset i flytende nitrogen og lagret ved -80 ° C. Snittene ble fiksert i kald aceton ved -20 ° C og deretter i et 4% paraformaldehyd fosfatbufferoppløsning. For farging av BBF2H7 C-terminalen, brukte vi en anti-BBF2H7 C-terminalen antistoff som det primære antistoff og Dako Envision Kit (Agilent) for påvisning i henhold til produsentens anbefalinger. Alle prosedyrer var i samsvar med god presse komiteen for Human Genome Forskning av Hiroshima University.
plasmider og transfeksjon
Menneske BBF2H7 full-lengde, N- og C-terminale cDNA ble oppnådd ved butte ligering av PCR-produkter som tilsvarer aminosyrer 1-520, 1-377 og 431-520 (GenBank Accession Number, NP_919047.2) med en BiP (bindings immunoglobulin-protein) signalpeptid-sekvens (aminosyrer 1-16, GenBank Accession Number , NP_005338.1) ved N-terminus. Den BBF2H7 i full lengde, ble N- og C-terminale cDNA klonet inn i en pcDNA3.1 (+) vektoren. HEK293T celler og
Bbf2h7
– /-. MEFs ble transfektert med hvert plasmid ved hjelp Lipofectamine 2000 (Life Technologies) i henhold til produsentens protokoll
bioassay av celleproliferasjon
U251MG-celler (1 x 10
5) ble sådd ut på 6 cm skåler, dyrket ved 37 ° C i 24 timer, og deretter transfektert med kryptert eller
Bbf2h7
liten interfererende RNA (siRNA) under anvendelse av Lipofectamine 2000 i henhold til produsentens protokoll. For
Bbf2h7
knockdown, de følgende sekvenser ble anvendt: 5′-GGAAGAAGGUAGAGGUUCU-3 «(siBBF2H7-1) og 5′-CCAGAAACCUGCUGAUCUA-3» (siBBF2H7-2). U251MG cellene ble inkubert ved 37 ° C i 24 timer etter transfeksjon, og deretter dyrkningsmediet ble skiftet ut. Celle tall ble talt på de angitte dager etter transfeksjon. sirnas ble kjøpt fra Bioneer (Daejeon, Sør-Korea).
I tillegg, etter transfeksjon med eggerøre eller
Bbf2h7
sirnas,
Bbf2h7
-knockdown U251MG celler ble utsatt for kondisjonert medium oppsamlet fra HEK293T celler transfektert med tom vektor (Mock) eller BBF2H7 C-terminus (C-Sup.), eller til C-Sup. hvori BBF2H7 C-terminale ende ble trukket ned ved immunoutfelling under anvendelse av et anti-BBF2H7 C-terminus antistoff (C-Sup. + Ab.). Celle tall ble talt på de angitte dager etter transfeksjon. For celleproliferasjon analysen, har vi også brukt en celle telling kit (WST-8-analysen, DOJINDO) i henhold til produsentens protokoll.
For å bekrefte aktivering av Hh signalering av BBF2H7 C-terminalen, U251MG celler ble behandlet med rekombinant Shh (R 0,05 ble betraktet som signifikant.
Resultater
Uttrykket av BBF2H7 i svulster og sekresjon av sin spaltede C-terminalen fra kreftceller
Bbf2h7
genet ble først identifisert som partner av
FUS
i en kimære genet finnes i LGFMS [25]. Derfor er det mulig at BBF2H7 kan være involvert i kreftcelleformering. Vi undersøkte uttrykk nivåer av
Bbf2h7
i ulike typer svulster ved hjelp av ONCOMINE Cancer Profiling Database (figur 1A). De datasett inkludert 37, 61, 5, 28, 94, 94 og 8 prøver normalt vev, og 582, 389, 40, 59, 52, 173 og 32 prøver av glioblastom, invasive ductal brystkreft ondartet vev, cervical plateepitel karsinom, prostata adenokarsinom, colon adenokarsinom, adenokarsinom i ventrikkel og bukspyttkjertelen adenokarsinom, henholdsvis. Som vist i figur 1 A,
Bbf2h7
ekspresjonsnivåer viste en signifikant økning av 1,070 til 2,567 ganger i flere tumortyper, sammenlignet med de i deres respektive normale vev. I kontrast, var det ingen signifikant oppregulering av
Bbf2h7
uttrykk i mage eller bukspyttkjertelen adenokarsinomer, noe som indikerer at genuttrykk av
Bbf2h7
ble spesielt forbedret i visse krefttyper.
(A) Økt uttrykk for
Bbf2h7
i kreft hos mennesker. Microarray datasett svulster ble åpnet i ONCOMINE Cancer Profiling Database (versjon 4.4.4.4, www.oncomine.org). Boksplott som viser økt uttrykk av
Bbf2h7
under tumorigenesis av ulike kreftformer ble konstruert fra ONCOMINE. Y-aksen representerer log
2 median-sentrert intensitet (normaliserte uttrykk). Linjen inne i boksen representerer medianverdien uttrykk for hver gruppe, og de øvre og nedre kanter av boksen indikerer 75
th og 25
th persentiler av distribusjonen, respektivt. Linjene (værhår) fra hver boks utvide til 90
th og 10
th persentiler av distribusjonen. De sorte prikker utenfor endene av linjene representerer de største og minste datapunkter. Boksplott som viser fordelingen av
Bbf2h7
uttrykk innenfor hver prøve og en Student
t
-test gir en
P
verdi for sammenligning av
Bbf2h7
uttrykk mellom normale og maligne vevsprøver ble oppnådd direkte gjennom ONCOMINE. Normale kolon vevsprøver inkludert stigende kolon, synkende tykktarm og endetarm. (B) Forut peptid funksjoner i menneske BBF2H7. Transkripsjon aktivering, er grunnleggende leucine zipper (bzip) og trans domener, samt en site-1 protease (S1P) nettsted indikerte. (C) Under ER stressbetingelser, er BBF2H7 transporteres fra ER til Golgi-apparatet og spaltet ved S1P nettstedet [9]. Den spaltede BBF2H7 N-terminale ende virker som en transkripsjonsfaktor via binding til cyklisk AMP responselement (CRE) av målgener [15]. I motsetning til dette er det spaltede BBF2H7 C-terminus ekstracellulært utskilt [16]. (D) Western blotting av endogen helaftens BBF2H7 og N- eller C-terminalen av BBF2H7 hjelp cellelysater (venstre panel) eller kultur media (høyre panel) av flere humane kreftcellelinjer. BBF2H7 N-terminus, BBF2H7 C-terminale ende eller IL-6 i dyrkningsmedier ble immunopresipitert ved bruk av anti-BBF2H7 N-terminale ende (toppfeltet), anti-BBF2H7 C-terminale ende (midtre panel), eller anti-IL-6 antistoffer ( nedre panel), respektivt. β-aktin eller IL-6 ble brukt som laste kontroller. (E) RT-PCR analyse av
Xbp1
mRNA uttrykk i flere humane kreftcellelinjer.
Xbp1-Koreas Hotell og
Xbp1-u
indikere skjøtes og unspliced former for
Xbp1
hhv. Merk at
Xbp1-s
ble påvist i alle kreftcellelinjer, noe som indikerer at disse cellene er under ER stress. (F) RT-PCR-analyse av
Xbp1
mRNA-ekspresjon i U251MG celler behandlet med 2 mM 4-PBA, en kjemisk chaperon, i 3 timer. (G) Kvantifisering av
Xbp1-Koreas
uttrykk i F. Feilfelt representerer gjennomsnitt ± SD av fem uavhengige eksperimenter. **
P
0,01. (H) Western blotting av BBF2H7 i U251MG celler behandlet med 1 pM thapsigargin (TG), en inhibitor av ER Ca
2 + -ATPase, i 6 timer. (I) Immunohistochemistry av hjerne seksjoner fra glioblastom pasienter ved hjelp av anti-BBF2H7 C-terminal-spesifikt antistoff. Sterke signaler ble påvist både i cytosol av kreftceller (merket med en pilspiss) og i deres omkringliggende ekstracellulære rom (indikert med piler). Venstre panel viser en lav forstørrelse, og panel høyre viser en høyere forstørrelse av venstre panel. Skala barer indikerer 50 mikrometer (venstre panel) og (høyre panel) 10 mikrometer.
BBF2H7 spaltes ved transmembrane i respons til ER stress (fig 1B og 1C) [9]. Den N-terminale fremmer uttrykk for målgener inkludert
Sec23a product: [15]. I motsetning til dette er den C-terminale ende utskilt fra cellene og letter spredning av nabocellene ved aktivering av Hh-signalering i kondrocytter [16]. Deretter undersøkte vi ekspresjon av full-lengde BBF2H7 og dens spaltet N- og C-terminale ende i lysater av disse kreftcellelinjer: glioblastom U251MG, brystcancer MCF7, livmorhalskreft HeLa, prostatacancer LNCaP og tykktarmskreft LS174T. Vi har oppdaget at den 80 kD fullengde BBF2H7 og dens spaltet N-terminale ende (50 kDa) og C-terminale ende (20 kDa) i lysater av nesten alle kreftcellelinjer med unntak av LS174T celler (figur 1D). BBF2H7 C-terminus, men ikke i full-lengde BBF2H7 eller dets N-terminale ende, ble også påvist i kulturmediet av disse cellelinjer, noe som indikerer at den spaltes C-terminus ble utskilt fra disse cellene i dyrkningsmediet. Spaltingen av BBF2H7 avhenger ER stress [9]. Derfor sjekket vi om kreft cellelinjer ble gjennomgår ER stress. Som vist Fig 1E-1G, de spleisede former for
Xbp1 product: [8], en markør for ER stress, ble observert i alle kreftcellelinjer. Behandling av U251MG celler med 4-PBA [31], en kjemisk anstand, redusert de spleisede former for
Xbp1
i basale nivåer og lindres ER stress, noe som indikerer at kreftcellene vi sjekket var under ER stress forhold. Videre bekreftet vi at BBF2H7 ble spaltet i respons til ER stress i kreftceller (Fig 1 H). Disse data viste at BBF2H7 ble spaltet og dets C-terminale ende ble ekstracellulært utskilt som respons på ER stress i henhold til homeostase i disse kreftcellelinjer, med unntak av LS174T celler. Ved siden av, for å bekrefte at BBF2H7 protein blir uttrykt i tumor, utførte vi immunhistokjemi ved hjelp av hjerne seksjoner fra pasienter med glioblastom og et anti-BBF2H7 C-terminal-spesifikt antistoff (Fig 1I). Sterke signaler ble detektert både i cytosol av kreftceller og i deres omkringliggende ekstracellulære rom. Disse resultatene indikerte at BBF2H7 ble sterkt uttrykt i glioblastom og at den spaltes C-enden ble ekstracellulært utskilt fra kreftceller.
Cancer celleproliferasjon i en Shh avhengig måte
Det er kjent at BBF2H7 C-terminus binder til både Hh ligand og dets reseptor, Ptch1, og fremmer Hh signalering [16]. For å undersøke hvorvidt de kreftcellelinjer med forhøyet ekspresjon BBF2H7 viser forbedret cellevekst og aktivering av Hh signalveien i en ligand-avhengig måte, vi har behandlet disse kreftcellelinjer med rekombinant Shh (Fig 2A-2C). Behandling med rekombinant Shh resulterte i betydelig oppregulering av Hh målgener som
Gli1 Hotell og
Foxl1
i BBF2H7-uttrykke kreftcellelinjer og forbedret cellevekst. Men LS174T celler som ikke uttrykker BBF2H7, viste ingen respons på behandling med rekombinant Shh. Disse resultater antyder at de fire kreftcellelinjer som utskiller BBF2H7 C-terminale ende har forbedret cellevekst i et Shh avhengig måte.
(A) RT-PCR-analyse av Hh målgener i flere cancercellelinjer behandlet med 500 ng /ml rekombinant Shh i 48 timer. (B) Kvantitativ real-time PCR-analyser av Hh målgener uttrykk i A. Feilfelt representerer gjennomsnitt ± SD av fem uavhengige eksperimenter. *
P
0,05, **
P
0,01. (C) Et cancercellelinjer ble dyrket i 5 dager etter behandling med 500 ng /ml rekombinant shh og analysert ved hjelp av WST-8-analyser ved dag 5. Feilstolper representerer gjennomsnittet ± SD av fem uavhengige eksperimenter. *
P
0,05.
BBF2H7 C-terminus øker Hh signalering i kreftceller
Som vist i figur 1A og 1D, BBF2H7 ble forhøyet i noen tumorer og kreftcellelinjer. Vi undersøkte roller BBF2H7 N-terminale og C-terminalen i celleproliferasjon ved trans ekspresjonsvektorene til kreftceller. BBF2H7 N-terminale ende påvirkes knapt celleproliferasjon, som indikerer at den N-terminale ende ikke har potensial til å fremme proliferasjonen av kreftceller. I motsetning til dette, BBF2H7 full-lengde og C-terminus svakt forbedret celleproliferasjon sammenlignet med kontrollgruppen, men forskjellene var ikke signifikante (data ikke vist). Fremstillingen av BBF2H7 full-lengde og C-terminus av ekspresjonsvektorene kan ikke være høyt nok til å betydelig fremme celleproliferasjon. Vi tror at det produserte BBF2H7 full lengde og C-terminalen av ekspresjonsvektorer hadde en mindre effekt på celleproliferasjon, fordi endogene BBF2H7 ble sterkt uttrykt i U251MG celler. Derfor transfektert vi human BBF2H7 full-lengde, N- eller C-terminus til
Bbf2h7
– /- MEFs [15], hvis celleproliferasjon ble nedsatt sammenlignet med villtype MEFs, for å eliminere effekter av endogen BBF2H7 på celleproliferering (figur 3A og 3B). Transfeksjon av BBF2H7 full-lengde eller C-terminus til
Bbf2h7
– /- MEFs gjenopprettet celleproliferasjon imidlertid transfeksjon av BBF2H7 N-terminus alene forbedret ikke celleproliferasjon, noe som indikerer at det humane BBF2H7 C -terminus, men ikke den N-terminale ende, har potensial til å fremme celleproliferasjon
(A, B)
Bbf2h7
-. /- MEFs ble dyrket i 5 dager etter transfeksjon med BBF2H7 full lengde (full), N-terminus (N), C-terminus (C) eller en tom vektor (Mock), og analysert ved hjelp av celle-telling på dag 5 (A) og WST-8-analyse ved den angitte tiden punkter (B). WT og KO indikere villtype MEFs og
Bbf2h7
– /- MEFs, henholdsvis. Feilstolpene representerer gjennomsnittet ± SD av fem uavhengige eksperimenter. *
P
0,05, **
P
0,01. (C) RT-PCR-analyse av Hh målgener i flere kreftcellelinjer som er utsatt for kondisjonert medium oppsamlet fra HEK293T celler transfektert med BBF2H7 C-terminus (C-Sup. +) Eller en tom vektor (C-Sup.-) for 48 h. (D) Kvantitativ real-time PCR-analyser av Hh målgener ekspresjon i C. Feilstolper representerer gjennomsnittet ± SD av fem uavhengige eksperimenter. *
P
0,05, **
P
0,01. (E) RT-PCR analyse av Hh målgener i U251MG celler behandlet med C-Sup., C-Sup. utarmet på BBF2H7 C-terminusen ved immunoutfelling ved å bruke et anti-BBF2H7 C-terminus antistoff (C-Sup. + Ab.), eller C-Sup. i nærvær av 5 pM cyclopamine (C-Sup. + CPN). Mock indikerer kondisjonert medium oppsamlet fra HEK293T celler transfektert med tom vektor. (F) Kvantitativ real-time PCR-analyser av Hh målgener ekspresjon i E. Feilstolper representerer gjennomsnittet ± SD av fem uavhengige eksperimenter. *
P
0,05, **
P
0,01. (G, H) U251MG celler ble dyrket i 5 dager etter behandling kondisjonert medium og analysert ved hjelp av celle-telling på dag 5 (G) og WST-8-analyser på de angitte dagene (H). Feilstolpene representerer gjennomsnittet ± SD av fem uavhengige eksperimenter. *
P
0,05, **
P
0.01.
utskilt BBF2H7 C-terminalen har blitt rapportert å fremme celle spredning av chondrocytes gjennom aktivering av Hh signale [16]. For ytterligere å undersøke effekten av utskilt BBF2H7 C-terminus på kreftcelleformering ble kreftcellelinjer utsettes for kondisjonert medium oppsamlet fra HEK293T celler transfektert med human BBF2H7 C-terminus (C-Sup.) Inneholdende en BiP signalpeptid-sekvens ved sin N-terminalen, for å muliggjøre dens sekresjon fra celler. Behandling av kreft cellelinjer med C-Sup. resulterte i betydelig oppregulering av Hh målgener, for eksempel
Gli1 Hotell og
Foxl1
, i alle cellelinjene unntatt LS174T celler (figur 3C og 3D). Spesielt U251MG og LNCaP-celler viste mer signifikant induksjon av Hh målgener, hvilket indikerer at effekten av C-Sup. på Hh signale var annerledes blant de kreftcellelinjer. For å bekrefte at det utskilte BBF2H7 C-terminale forfremmet celleproliferasjon gjennom aktivering av Hh signalering, undersøkte vi om Hh signalisering i U251MG celler vil fortsatt bli aktivert etter uttømming av BBF2H7 C-terminalen fra C-Sup. ved immunoutfelling ved å bruke et anti-BBF2H7 C-terminus antistoff (C-Sup. + Ab .; figur 3E-3H). Som forventet, utarming av BBF2H7 C-terminalen fra C-Sup. forårsaket en signifikant reduksjon i ekspresjonen av målgener Hh og i celleproliferasjon. I tillegg behandling med cyclopamine (CPN) [32], en Smo antagonist som hemmer Smo og dens nedstrøms Hh signalering, kansellert effekten av C-Sup. på induksjon av Hh målgener som
Gli1 Hotell og
Foxl1 plakater (Fig 3E og 3F). Videre, fremming av celleproliferasjon ved C-Sup. ble undertrykt ved behandling med CPN (Fig 3G og 3H), noe som tyder på at det skilles BBF2H7 C-terminalen fungerer oppstrøms Smo og forbedrer Hh ligand-avhengige spredning.
Effekter av
Bbf2h7
siRNA på spredning av kreftceller
Vi neste fastslått om knockdown av
Bbf2h7
undertrykker cellevekst ved downregulating Hh signalering i kreftceller. For å oppnå dette, brukte vi to forskjellige sirnas (siBBF2H7-1 og siBBF2H7-2). 0,001. *
P
0,05, **
P
0,001. *
P
*
P
0,05, **
P
0,001. *
P
