Abstract
Bakgrunn
activin reseptor 2 (
ACVR2
) er ofte mutert i mikro ustabil (MSI) tykktarm kreft, som fører til protein tap, signal avbrudd, og større svulster. Her undersøkte vi activin signale avbrudd i mikro stabil (MSS) tykktarm kreft.
Metoder
Femti-en populasjonsbasert MSS tykktarm kreft ble vurdert for ACVR1, ACVR2 og pSMAD2 protein. Consensus mutasjon utsatt deler av
ACVR2
ble sekvensert i primær kreft og alle eksoner i tykktarm kreft cellelinjer. Tap av heterozygositet (LOH) ble evaluert for
ACVR2 Hotell og
ACVR1
, og
ACVR2
promoter metylering ved metylering spesifikk PCR og bisulfite sekvensering og kromosom ustabilitet (CIN) fenotype via fluorescerende LOH analyse av 3 dupliserte markører.
ACVR2
promoter metylering og ACVR2 uttrykk ble vurdert i tykktarm kreft cellelinjer via qPCR og IP-vestlige blotter. Re-uttrykk for ACVR2 etter demetylering med 5-aza-2′-deoksycytidin (5-Aza) ble bestemt. Ytterligere 26 MSS tykktarm kreft ble vurdert for ACVR2 tap og dens mekanisme, og ACVR2 tap i alle testede kreft korrelerte med clinicopathological kriterier.
Resultater
Av 51 MSS colontumorer, 7 (14% ) mistet ACVR2, 2 (4%) ACVR1, og 5 (10%) pSMAD2 uttrykk. Ingen somatisk
ACVR2
mutasjoner ble oppdaget. Tap av ACVR2 uttrykk var assosiert med LOH på
ACVR2 product: (p 0,001) og
ACVR2
promoter hypermethylation (p 0,05).
ACVR2
LOH, men ikke arrangøren hypermethylation, korrelert med CIN status. I tykktarm kreft cellelinjer med fullt metylert
ACVR2
promoter, tap av
ACVR2
mRNA og protein uttrykk ble restaurert med 5-Aza behandling. Tap av ACVR2 var assosiert med en økning i primærtykktarmskreft volum (p 0,05).
Konklusjoner
Bare en liten prosentandel av MSS tykktarm kreft mister uttrykk for activin signal medlemmer. ACVR2 tap skjer gjennom LOH og
ACVR2
promoter hypermethylation, avslørende forskjellige mekanismer for ACVR2 inaktivering i både MSI og MSS subtyper av tykktarmskreft
Citation. Jung B, Gomez J, Chau E, Cabral J, Lee JK, Anselm A, et al. (2009) activin signale i mikro Stabil tykktarm kreft blir forstyrret av en kombinasjon av genetiske og epigenetiske mekanismer. PLoS ONE 4 (12): e8308. doi: 10,1371 /journal.pone.0008308
Redaktør: Irene Oi-Lin Ng, The University of Hong Kong, Hong Kong
mottatt: 18 juni 2009; Godkjent: 20 november 2009; Publisert: 14.12.2009
Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Public Domain erklæring som fastslår at en gang plassert i det offentlige rom, dette arbeidet kan fritt kopieres, distribueres, overføres, endres, bygd på, eller brukes av alle for ethvert lovlig formål
Finansiering:. støttet av UCSD akademiske kollegium til BJ, US Public Health service DK074019 til BJ; DK067287, VA Research Service, og American Cancer Society Institutional stipend # 70-002 til J.M.C., og UCSD Digestive Diseases Research Development Center (DK080506). DNA-sekvensering ble utført av DNA Sekvense delt ressurs, UCSD Cancer Center, som er finansiert delvis av NCI Cancer Center Support Grant # 2 P30 CA023100-23. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Colon kreft med mikro ustabilitet høy frekvens (MSI-H) er assosiert med mutasjoner i flere gener med koding repetitive sekvenser, for eksempel
transformerende vekstfaktor β-reseptor 2 (TGFBR2) Hotell og
aktivin type 2 reseptor (ACVR2) product: [1] – [3]. Mikro stabil (MSS) tykktarm kreft har intakt DNA mismatch reparasjon, men kan havnen
TGFBR2
kinase domene mutasjoner [4]. Andre komponenter i TGFB kanoniske signalkaskade som SMAD2 og SMAD4, er spesielt inaktivert i et mindretall av tykktarm kreft [5] – [7]. Systematisk inaktivering av TGFB søster vei, activin, er ikke helt klarlagt i MSS tykktarm kreft.
activin er medlem av TGFB super som regulerer celledifferensiering i mange vev [8]. I likhet med TGFfi, benytter aktivin to celleoverflatereseptorer, aktivin reseptor 1 (ACVR1) og aktivin reseptor 2 (ACVR2), etterfulgt av SMAD aktivering. En annen type 2-reseptoren, ACVR2B, kan ikke erstatte funksjonene og signalering av ACVR2 [9].
ACVR2
ble funnet mutert i de fleste MSI-H kolorektal kreft [10], [ ,,,0],11], først og fremst på grunn av et rammeskifte i A
8 traktat av ekson 10. Restaurering av activin signalisering og vekst undertrykkelse oppstår i respons til
ACVR2
komplemente i
ACVR2
-mutant kolon kreftceller [12], [13]. Vi har tidligere vist en høy frekvens av
ACVR2
mutasjoner i MSI-H tykktarm kreft i forbindelse med tap av ACVR2 protein uttrykk [2] og tilknytning til større colontumorer og dårligere histologisk grad [14]. Dessuten fant vi en undergruppe av MSS tykktarm kreft som mistet ACVR2 uttrykk [2], beslektet med
TGFBR2
tap funnet i MSS tykktarm kreft [4].
I denne studien utforsket vi activin signalveien avbrudd og mulige mekanismer i grunnskolen MSS tykktarmskreft prøver og tykktarm kreft celler. Vi har funnet at tap av ACVR2 ekspresjon forekommer i en undergruppe av MSS tumorer, noe som ofte er forbundet med beholdt pSMAD2, den neste nedstrøms effektor av både TGFp og aktivin signalering. I motsetning til det av TGFBR2, ACVR2 tap i MSS svulster skjer gjennom en kombinasjon av LOH på
ACVR2 Hotell og tydelig
ACVR2
promoter metylering, men ikke genetisk mutasjon. I tykktarm kreft cellelinjer, mekanismer for ACVR2 tap også skille ifølge mikro status, med MSI-H cellelinjer som viser
ACVR2
polyadenine kanalen mutasjon og MSS tykktarm kreft celler demonstrere promoter hypermethylation. Dermed viser vi at avbrudd av activin signalering skjer i MSI og MSS tykktarm kreft av ulike mekanismer, avslører activin signale som et viktig mål i de to vanligste genomiske undergrupper av tykktarmskreft.
Resultater
activin signalveien medlemmer målrettet for inaktivering i delsett av Primary MSS tykktarm kreft
Våre tidligere data foreslåtte minst delvis tap av ACVR2 protein uttrykk i en undergruppe av primære MSS tykktarmskreft prøver tross vill type
ACVR2
polyadenine traktater [2]. Vi undersøkte dette videre og søkte å bestemme uttrykk mønstre både ACVR2, ACVR1 samt dens nedstrøms effektor, pSMAD2, i 51 forskjellige primærtykktarmskreft prøver med mikro stabile genomiske bakgrunn hentet fra samme kohort av North Carolina Colon Cancer Study (NCCCS ) [15], [16]. Mens ACVR1 reseptor uttrykk gikk tapt i bare 4% (2/51) av pasient vevsprøver (figur 1AB, øverste raden), tap av primær reseptoren, ACVR2, forekom hos 14% (7/51) (figur 1CD, midtre rad). I tillegg tap av pSMAD2 uttrykk nedstrøms ACVR2 og ACVR1 aktivering av activin skjedde i 10% (5/51) av testede tilfellene (figur 1EF, nederste rad), og ble ofte observert i tumorer avslørende fullt uttrykt reseptorer (tabell 1).
Immunhistokjemisk analyse av parafininnstøpte primære coloncancere utlignet ekspresjon av målproteinet (brun) som i forhold til tilstøtende normalt vev. A og B (Top rad): ACVR1 uttrykk er tapt i en undergruppe av MSS svulster. Eksempel på tumor med ekspresjon i både normal og colon tumorvevet (venstre panel) og selektivt tap i en undergruppe av tumorer, men ikke tilstøtende normalt kolonvev (høyre panel). Total, ACVR1 tap ble observert i 2/51 eller 4% av alle MSS coloncancere analysert. C og D (Middle rad): ACVR2 uttrykk er tapt i en undergruppe av MSS svulster. To eksempler på selektivt tap av ACVR2 i tykktarm tumor, men ikke normalt kolonvev (venstre og høyre panel) er vist. Totalt sett ACVR2 tap ble observert i 7/51 eller 14% av alle MSS tykktarm kreft analysert. E og F (Nederste rad): pSMAD2 uttrykk er tapt i en undergruppe av MSS svulster. Eksempel på ekspresjon i både normal og colon tumorvevet (venstre panel) og selektivt tap i en undergruppe av tumorer, men ikke normalt kolonvev (høyre panel). Totalt sett pSMAD2 tap ble observert i 5/51 eller 10% av alle tykktarm kreft analysert.
Alle prøver med tap av minst ett activin reseptor pathway komponent avslørte uttrykk for både total SMAD2 og TGFBR2 (tabell 1, figur 2). Disse dataene antyder at ACVR2 proteintap har størst utbredelse blant MSS svulster, etterfulgt av pSMAD2 tap, og deretter ved ACVR1 tap. ACVR2 tap og pSMAD2 tap synes å forekomme i komplementære undergrupper, noe som tyder på mer enn ett mål å inaktivere activin signalisering i MSS tykktarm kreft. Omvendt, alle MSS tykktarmskreft prøver med activin signaliserer komponent tap uttrykt TGFBR2.
Av de 51 MSS tykktarm kreft fra NCCCS kohorten testet for ACVR2 og ACVR1 tap, 8 avslørte tap av enten reseptor (7 tapt ACVR2 og 2 mistet ACVR1 med en svulst å miste begge, se tabell 1). Av de åtte, en tapt pSMAD2. Av de 7 svulster med ACVR2 tap, 3 avslørt LOH og 3 hadde selektiv ACVR2 promoter hypermethylation, mens ingen mutasjoner ble funnet i noen av de tre kinase domene hotspots eller koding polyadenine traktat av ekson 10, ofte mutert i MSI colontumorer. Ingen av de 2 svulster med ACVR1 tap avslørt LOH på
ACVR1
locus. Motsatt av de 43 svulster som uttrykker både ACVR2 og ACVR1, 4 eller 9% tapt pSMAD2 uttrykk, og samtidig opprettholde total SMAD2 og TGFBR2 uttrykk, og understreker tap av SMAD2 fosforylering evne som en ekstra primære begivenhet for å forstyrre activin signalering.
LOH, men ikke Mutation, er forbundet med tap av ACVR2 Expression i Primær MSS Colon Cancer Prøver
for å vurdere om tap av reseptor uttrykk skyldes tap av heterozygositet (LOH), en vanlig genomisk mekanisme tumor suppressor inaktivering i MSS tykktarm kreft, vi analysert for LOH på
ACVR2 Hotell og
ACVR1
genloci. Av de 51 MSS svulster analysert, 4 avslørte allel tap. LOH ved
ACVR2
var sterkt assosiert med tap av ACVR2 proteinekspresjon (p = 0,006, Fishers eksakte test), og 3/7 (43%) av MSS tumorer med tap av ACVR2 proteinekspresjon viste også LOH (figur 2), sammenliknet med 1/44 ACVR2 uttrykkende tumorer. Ingen LOH ble funnet på
ACVR1
locus i enten ACVR1 uttrykker eller ikke-uttrykke svulster. For ytterligere ACVR2 uttrykk sammenheng med LOH, vi utvidet antall pasient svulster fra 51 til 77 prøver, som avslørte 5 flere svulster med ACVR2 protein tap, og det totale antallet til 12/77 eller 16% (tabell 2). I denne utvidede gruppen, 6/12 (50%) av MSS svulster med ACVR2 tap viste LOH (tabell 2).
Vi deretter sekvensert koding mikro samt 3 separate hot spots i kinase domenet til
ACVR2 plakater (beslektet med tilsvarende mutasjoner i
TGFBR2
i MSS svulster) [4]. Det bør bemerkes at exon 10 A
8 kanalen i
ACVR2
ligger i kinasedomenet av denne reseptor, og rammeskiftmutasjoner i tillegg til andre mutasjoner i kinasedomenet avskaffe fosforyleringsmiddel kapasitet på ACVR2. Men vi fant ingen tumorspesifikke mutasjoner som tilsvarer tap av ACVR2 protein uttrykk. Disse dataene antyder at andre inaktive mekanismer spiller en rolle i tap av ACVR2 uttrykk.
ACVR2
Arrangøren Hypermethylation er forbundet med tap av ACVR2 Expression i Primær MSS Colon Cancer Prøver
for å undersøke om epigenetiske forandringer er assosiert med ACVR2 uttrykk tap, vi vurderte om
ACVR2
promoter ble hypermethylated i tykktarm kreft vev i forhold til normal og i så fall om en bestemt metylering mønster av
ACVR2
korrelert med ACVR2 proteintap i grunnskolen MSS tykktarmskreft prøver. Vi i utgangspunktet delt
ACVR2
promoter inn i tre regioner, region 1 (142 til -603), region 2 (-607 til -958) og region 3 (-958 til -1484). Våre bisulfitt-sekvenseringsresultatene viste at det var ingen metylering i region 1 og minimal metylering i region 2, men de 46 CpG-dinukleotider mellom til -958 til -1484 nukleotider i forhold til transkripsjons-startsetet (region 3) (figur 3A) ble metylert i begge cellelinjer og kliniske prøver (figur 3B), men ikke tilsvarende tilstøtende normalt vev (data ikke vist). På grunn av problemer med forsterkning av større amplikonene fra parafin innebygd vev DNA, utførte vi metylering bestemt bisulfite sekvensering av et litt mindre område (-603 til -1297 stillinger) i
ACVR2
promoter i kliniske prøver.
A) ACVR2 promoter med kart over plassering av MSP primere B) ved hjelp av en CpG øyer søkeprogram, identifiserte vi CPG øyene innenfor
ACVR2
arrangøren basert på følgende strenge kriterier: ~CG prosent 55%; observerte CpG /forventet CpG 0,65; Lengden 500 bp. Alle CpG dinukleotidpolyfosfater sekvenser er representert ved vertikale barer over den horisontale linjen viser promotersekvensen. Hver sirkel i bunnfeltet illustrerer et CpG område som svarer til de vertikale stenger som er vist i det øvre felt. Basert på bisulfite sekvensering, ble hver CpG stedet scoret kvantitativt som 100% denaturert (mørke sirkler), 50% denaturert (mørk grå sirkler), 50% denaturert (lys grå sirkler) eller unmethylated (hvite sirkler). Som indikert, 3 av 7 ACVR2-negative CRC demonstrerte fullstendig metylering av den kritiske regionen ACVR2 arrangøren, mens ingen av de ACVR2-uttrykke svulster viste noen bevis for høy grad /komplett metylering av ACVR2 promoter. En metylering mønster som ligner på det man ser i ACVR2 negativ tykktarm kreft ble observert i MSS tykktarmskreft cellelinje HT29 med genomisk DNA fra HT-29 åpner for sekvensering av et litt større område av
ACVR2
promoter. C) Seks koloncancer-cellelinjer med forskjellig mikro ustabilitet bakgrunn (se tabell 3) ble analysert for ACVR2 protein ekspresjon ved hjelp av immunoutfellingsstudier teknikker. To cellelinjer, HCT116 (en MSI tykktarmskreft cellelinje med biallelic rammeskifte mutasjoner i
ACVR2
) og MSS tykktarmskreft cellelinje HT29 (med
ACVR2
promoter hypermethylation), avslørte tap av ACVR2 protein uttrykk. D) Tap av ACVR2 protein ekspresjon korrelerte med reduksjon i ACVR2 mRNA-transkripsjon via kvantitativ PCR på HT29-celler når sammenlignet med ACVR2 uttrykkende cellelinje ved hjelp av FET GAPDH for standardisering. Dette eksperimentet ble utført tre ganger i tre paralleller, og søylediagrammet representerer et eksperiment med * indikerer en statistisk signifikant forskjell med en p 0,001. E) ACVR2 protein uttrykk ble reetablert etter demetylering behandling med 5’Aza.
I ACVR2 non-uttrykke primær tykktarm kreft fra den opprinnelige størrelsen på utvalget av 51 MSS svulster, 3/7 kreft demonstrert komplett metylering (100% denaturert alleler) innenfor region 3 av
ACVR2
promoter, mens ingen av de 13 ACVR2 uttrykke primær tykktarm kreft vev analysert viste fullstendig
ACVR2
metylering, som støtter en utløsende rolle for metylering og mangel på ACVR2 uttrykket (p = 0,03, Fishers eksakte test) (tabell 2, figur 3B). Bisulfitt sekvense resultater var i overensstemmelse med MSP observasjonene (data ikke vist), hvor 3/7 ACVR2-negative CRC viste nærvær av spesifikt denaturert alleler. Selv om lave nivåer av metylering ( 50% denaturert alleler) ble også funnet i 7/13 av de ACVR2-uttrykkende CRC, ingen av CRC viste fullstendig metylering av eventuelle CpG-dinukleotider, som var konsistent med aktivering ACVR2 ekspresjon i disse tumorene ( Figur 3B).
ACVR2
Arrangøren Hypermethylation korrelerer med ACVR2 transkripsjon og protein uttrykk i tykktarmskreft cellelinjer
For å underbygge våre funn fra kliniske prøver
in vitro
, vurdert vi mekanismer for
ACVR2
tap i tykktarmskreft cellelinjer basert på mikro ustabilitet. Vi testet tre MSI-H og 3 MSS tykktarmskreft cellelinjer for: 1) mutasjon i kodingen polyadenine kanalen av ekson 10 av
ACVR2
, 2)
ACVR2
promoter hypermethylation, 3) kvantitative RT-PCR av
ACVR2
mRNA, og 4) ACVR2 protein uttrykk ved immunoprecipitation. Som tidligere rapportert [2], [12], biallelic mutasjon i polyadenine kanalen av
ACVR2 product: (A
8 til A
7) i MSI-H tykktarmskreft cellelinje HCT116 forårsaker tap av ACVR2 protein (Figur 3C og tabell 3).
i MSI-H cellelinjer SW48 og RKO, er ACVR2 protein til stede, som det er i MSS tykktarmskreft cellelinjer CaCo2 og FET ( Figur 3C). Både RKO og SW48 inneholde en heterozygot mutasjon på
ACVR2
, avslører villtype A
8 samt mutante alleler (tabell 3). A
8
ACVR2
allelet gir uttrykk for ACVR2 protein. MSS tykktarmskreft cellelinje HT29 uttrykker redusert nivå av ACVR2 mRNA og protein (figur 3C, D og E), ikke ulikt sin MSS kolleger CaCo2 og FET, verken som havna noen exonic
ACVR2
mutasjon (data vist ). HT29-celler viste en tydelig
ACVR2
promoter hypermethylation mønster (figur 3B) i forbindelse med mRNA og protein tap, noe som tyder på at denne spesifikke metylering mønster fører til tap av
ACVR2
uttrykk. Demetylering av
ACVR2
promoter med 5-Aza førte til reetablert uttrykk for ACVR2 mRNA og protein (Figur 3D og E). Vi utførte en ekstra skjerm på 11 tykktarmskreft cellelinjer med enten MSI (DLD1, HCA7, HCT15, LoVo, LS174, SNU175, SNU407), eller MSS (SNU81, SNU503, SW480, og T84) bakgrunn avslørende tilsvarende nivåer av ACVR2 mRNA og etablere HT29 som eneste observerte MSS tykktarmskreft modell med tydelig ACVR2 tap.
for å relatere ACVR2 uttrykk med tumor størrelse, karakter og scene, vi analyserte den utvidede gruppen av 77 svulster, som inneholdt 12 svulster med ACVR2 tap ( tabell 2). Av disse 69 hadde data om kjønn og rase, 46 på tumorvolum, 59 på tumor scenen, og 65 på Karakter (se tabell 4) slik at subanalyses. Beslektet med MSI-H coloncancere [14], tap av ACVR2 ekspresjon korrelerte med større svulster (p = 0,024), mens trinn var upåvirket i forhold til ACVR2-uttrykkende tumorer (tabell 4). Dette er en parallell til vår tidligere funn i MSI-H tykktarm kreft, der tap av ACVR2 protein ble forbundet med større og mer dårlig differensierte svulster i en scene uavhengig måte [14].
Vi deretter utført genomisk subtype analyse av alle ACVR2 ikke uttrykke kreft og fant at mangel på kromosom ustabilitet (CIN) fenotype korrelert med
ACVR2
promoter hypermethylation (tabell 2), noe som tyder separate veier for MSI- /LOH + og MSI- /LOH -. tykktarm kreft
samlet utgjør disse data tyder på at klinisk-patologiske effekter av ACVR2 proteintap kan være lik i begge MSI og MSS kolorektal kreft til tross for ulik underliggende mekanismene for tap, impliserer ACVR2 tap som et viktig skritt i kolon kreftutvikling.
Diskusjoner
Brudd activin signalering er vanlig i MSI-H tykktarmskreft cellelinjer gjennom mutasjon av
ACVR2
i en av sine polyadenine traktater [10] føre til redusert ACVR2 protein [2]. Tap av ACVR2 protein uttrykk ble også nevnt i en liten undergruppe av MSS tykktarm kreft [2]. Her vurderte vi forekomst og mekanismen for forstyrret activin signalisering i MSS tykktarm kreft og vise at activin signale er målrettet for avbrudd på flere nivåer i MSS colontumorer. Vanligst,
ACVR2
uttrykk er tapt gjennom en kombinasjon av LOH og epigenetisk stanse av
ACVR2
promoter. Disse funnene understreker viktigheten av opphevet activin signalisering i tykktarm tumorigenesis, som sin avbrudd forekommer i både MSI og MSS subtyper av tykktarmskreft med ulike forskjellige mekanismer.
I MSI-H tykktarm kreft, både TGFp og activin er opphevet på grunn av rammeskifte mutasjoner i type II-reseptoren [2], [17]. Tapet av begge disse signalveier kan være fordelaktig for tumorvekst [12], [18]. Både TGFp og aktivin bruke de samme intracellulære proteiner Smad (Smad 2 og 3) for å overføre sitt signal. Vi har tidligere observert større enn 50% overlapping mellom
ACVR2 Hotell og
TGFBR2
mutasjoner i primær MSI colontumorer [2], muligens på grunn av additiv effekt med formidling av vekstrespons, noe som er for tiden under etterforskning .
Det fremgår at i MSI coloncancere
ACVR2
mutasjoner kan oppstå tidlig i tumorigenese og er forbundet med økt lokal vekst [14]. I MSS tykktarm kreft, tap av ACVR2 korrelert med større svulster, i samsvar med avbrudd av activin-indusert veksthemming. Tidspunktet for
ACVR2
mutasjoner i MSI tykktarmskreft kan være lik som
TGFBR2
hvori de rammeskifte mutasjoner forekommer i høy grad dysplasi ved grenseflaten til malignitet [17].
Vi viser at i MSS tykktarm kreft minst tre medlemmer av activin signalkaskade, er ACVR2, ACVR1, og pSMAD2 forstyrret. vist en betydelig undergruppe av colontumorer en reduksjon i fosforylert SMAD med intakt ACVR2 og TGFBR2, noe som indikerer en separat primær hendelse nedstrøms av de primære reseptorer. Ett tilfelle av tap av ACVR1, ACVR2 og pSMAD2 ble identifisert, som var TGFBR2 farging positive (tabell 2). Dette kan skyldes primære inaktivering av pSMAD2 og separat målretting av både activin reseptorer, eller en IHC positiv avkortet TGFBR2, fører pSMAD2 tap. Effekten av tap av flere mål med samme signalkaskade fortsatt må nøye utforsket og foreslår ulike funksjoner for hvert medlem.
Vi oppdaget LOH på
ACVR2
locus i 6% av MSS colontumorer, økende til 50% i tumorer med tap av ACVR2 proteinekspresjon. Denne samlede prisen er litt lavere enn frekvensen av
ACVR2
LOH rapportert tidligere i en kohort med ukjent
ACVR2
status [19], selv om vi tidligere har observert kohort-avhengige frekvenser for ACVR2 uttrykk som kan være scene eller rase-avhengig [14].
Vår mutasjonsanalyse fokusert på hotspots beslektet med de som er innblandet i inaktivering av
TGFBR2
kinase domene inaktive [4], men vi fant ikke eventuelle tumorassosierte mutasjoner når sekvensere alle eksoner i ACVR2 uttrykke og ikke-uttrykke tykktarmskreft cellelinjer. Det er mulig at mutasjoner utenfor de soner kan bidra til tap av ACVR2 i primær koloncancer prøver, selv i lys av bevisene for LOH samt epigenetisk stanse, er det sannsynlig å være en mindre viktig tumorigen mekanisme. Imidlertid kan det spille en rolle i de tre svulster med tap av ACVR2 der fant vi ingen genetisk eller epigenetisk mekanisme direkte forklarer at tap.
Dette er den første rapporten som beskriver ACVR2 tap i MSS tykktarm kreft og
ACVR2
promoter hypermethylation som en mekanisme, og står i kontrast til mekanismene for
ACVR2
tap i MSI tykktarmskreftceller [12]. I begge primære MSS colontumorer og HT29 tykktarm kreft celler, regionen arrangøren hypermethylation som er knyttet til tap av
ACVR2
uttrykk er mellom nukleotidene -1297 til -958. Blant genene som er mål for epigenetisk stanse,
hMLH1
er best undersøkt for metylering, og det har blitt foreslått at promotorområdet som grenser til transkripsjonsstartsetet (TSS) er kritisk for transkripsjonen stanse av dette genet [ ,,,0],20]. Det er mangel på lignende data for de fleste andre gener, men
hMLH1
promoter-regionen data blir ofte brukt som et paradigme, og det antas at for de fleste genene, er analyse av en tilsvarende promoter region kritisk for å korrelere DNA-metylering funn med tap av genuttrykk. I denne studien har vi analysert 1500 bp proksimale til TSS, og funnet god korrelasjon mellom
ACVR2
promoter metylering (i regioner -958 til -1297) og tap av protein uttrykk ved IHC. Våre data tyder på at i stedet for bare nærhet til TSS, differensial tilgang til metylering co-aktivatorer eller repressors i en promoter bestemmer genet Slå, og for
ACVR2
et slikt område kan forekomme i overkant av 900 bp fra TSS.
Vi er oppmerksom på at det totale antallet MSS pasienter med ACVR2 tap som ble undersøkt i denne studien er ikke stor, og understreker at dette er en relativt sjelden begivenhet [15]. Vi hadde ikke tenkt å bestemme den samlede frekvenser av slike hendelser, men for å vise en alternativ mekanisme ACVR2 proteintap i MSS tykktarm kreft. Av 51 primær, populasjonsbaserte MSS tumorprøver, 7 viste tap av ACVR2 uttrykk. I tråd med de 51 fagene blir tilfeldig trukket fra kohorten, mellom 7% og 21% av MSS svulster i befolkningen bør vise tilsvarende tap på ACVR2 uttrykk med 95% sikkerhet (Clopper-Pearson eksakt konfidensintervall). Økning av utvalgsstørrelsen til 77 avdekket tap av ACVR2 i 12/77 eller 16%, og en statistisk signifikant korrelasjon for tap av ACVR2 med økt tumorstørrelse. Videre avslørte genomisk subtype analyse som LOH på
ACVR2
ble assosiert med CIN fenotype, mens
ACVR2
hypermethylation korrelert med CIMP fenotype. Selv om disse kategoriseringer tillate fordeling av tap av
ACVR2
uttrykk til arrangøren hypermethylation og /eller kromosomal instabilitet som en mekanisme i MSS kreft, alternative mekanismer som histone modifikasjon og /eller microRNAs kan være på spill, spesielt i LOH negativ /metylering negative kreft. Våre data viser imidlertid en signifikant sammenheng mellom tap av ACVR2 uttrykk og LOH /epigenetisk lyddemping. Dermed gir vi bevis for eksistensen av enten kromosomal instabilitet eller epigenetisk modifikasjon av
ACVR2
i tykktarmskreft og identifisere en celle modell for epigenetisk stanse av
ACVR2
. Den fulle kliniske betydningen av disse dataene vil kreve ytterligere bekreftelse i fremtidige studier med større pasientprøver.
I konklusjonen, tap av ACVR2, ACVR1 og pSMAD2 uttrykk forekommer i en undergruppe av MSS svulster, og bevisene støtter at dette fører til opphør av normal vekst undertrykkende aktivitet av aktivin signalering. Redusert pSMAD2 er vanligvis forbundet med villtype ACVR2 og ACVR1. Mekanismer for
ACVR2
tap inkluderer LOH på
ACVR2 Hotell og
ACVR2
arrangøren hypermethylation mellom nukleotidene -1297 og -958, som er forbundet med CIN og CIMP fenotyper, henholdsvis. Tap av ACVR2 er assosiert med økt tumorstørrelse. Derfor kan activin signale bli inaktivert av særegne mekanismer i MSI og MSS tykktarm kreft, antyder betydningen av denne veien i å kontrollere colonocyte vekst.
Materialer og metoder
Etikk erklæringen
Denne undersøkelsen ble gjennomført i henhold til de prinsipper som er nedfelt i Helsinkideklarasjonen. Studien ble godkjent av Institutional Review Board ved University of North Carolina sykehus. Alle pasienter gitt skriftlig informert samtykke for innsamling av prøver som en del av de under IRB godkjennelse som en del av North Carolina Colorectal Cancer Study (NCCCS) se nedenfor. Analyse som en del av denne studien var helt avidentifisert og ingen identifiserbar informasjon var tilgjengelig for PI, noe som gjør denne studien fritatt fra en separat samtykke.
Pasientprøver
Sporadiske colontumorer ble prospektivt samlet etter IRB godkjennelse som en del av North Carolina Colorectal Cancer Study (NCCCS), en populasjonsbasert, case-control studie som omfatter 503 pasienter [15], [16]. Mikroanalyse ble utført fra parafin-innleiret vev som tidligere beskrevet [2], segregerende kohort til 54 MSI-H, og 449 MSS /MSI-L-pasienter. For denne studien ble 51 MSS pasientprøver med rikelig tumor og normalt vev tilfeldig valgt.
Cellelinjer
MSI tykktarmskreft cellelinjer HCT116, SW48, DLD1, HCA7, HCT15, LoVo, LS174T, SNU175, SNU407, SW48, og RKO, samt MSS tykktarmskreft cellelinjer CaCo2, HT29, SNU81, SNU503, SW480, og T84 ble opprettholdt i Iscove modifiserte Dulbeccos Medium (Invitrogen Corporation, Carlsbad, California) og FET var opprettholdt i F12 /Dulbeccos modifiserte Eagles medium ved betingelser som tidligere er beskrevet [12]. Alle cellelinjer er tilgjengelige fra ATCC unntatt FET (gaver av Michael Brattain, Medical College of Ohio, Toledo, OH) [21].
Tissue mikrodisseksjon, DNA Extraction, og RNA Utvinning
DNA fra formalinfiksert, parafininnebygd materialet ble hentet følgende mikrodisseksjon hjelp av Takara DEXPAT kit (Takara Bio Inc., Japan). Genomisk DNA fra cellelinjer ble oppnådd ved å bruke QIAamp DNA mini-kit (Qiagen, Valencia, CA). RNA fra cellelinjer ble innhentet ved hjelp av TRIzol reagens (Life Technologies Inc. Carlsbad, California).
Antistoffer
Kanin anti-TyrGly mACVR2 (482-494) (sjenerøs gave fra W. Vale , Salk Institute), med sin target epitop i den C-terminale region av ACVR2 (utover den resulterende trunkering av rammeskifte i ekson 10) ble anvendt for immunhistokjemi som tidligere beskrevet [2], [12]; kanin anti-TyrGly ACVR1 (474-494) ble brukt på 1:800; pSMAD2 (Cell Signaling) på 1:250; total SMAD2 (Epitomics) på 1:400; og TGBR2-C16 (Santa Cruz) på 1:300.
Immunhistokjemi for ACVR1, ACVR2, pSMAD2, TGFBR2 og SMAD2 Protein Expression
Immunohistochemistry ble utført som beskrevet tidligere [2]. Farging ble gruppert i tap eller 0 (fravær eller betydelig reduksjon i forhold til tilstøtende normalt vev), redusert eller 1+ (subtile nedgang i forhold til tilstøtende normalt vev), uendret eller 2+ (ingen endring i forhold til tilstøtende normalt vev), og økt eller 3+ (økning i forhold til tilstøtende normalt vev). Tre uavhengige etterforskere blindt scoret alle lysbilder. Alle tre etterforskere måtte være enige for en svulst å bli kalt 0 eller tap av uttrykk.
Tap av heterozygositet (LOH) Analyse
Vurdering av LOH på
ACVR2
og
ACVR1
loci ble utført som tidligere beskrevet [22] utnytte 2 mikro markører (D2S1353 og D2S1399) flankerer
ACVR2 product: [19] samt en intragenic markør for
ACVR1
(D2S2686) (se tabell S1).
CIN Analyse
Analyse for CIN ble utført som tidligere beskrevet [23]. I korte trekk forover oligonukleotidprimere ble fluorescens-merket med FAM ved 5’end (Applied Biosystems) og et sett med 6 polymorfe mikrosatellittmarkører (D5S346, D5S409 D17S261 D17S250 D18S81, D18S91, og D18S69) (se tabell S1) ble anvendt for å bestemme LOH på kromosom 5q, vED BETJENING 17Q og 18q.
