Abstract
SRC, også kjent som proto-onkogen c-Src, er en ikke-reseptor tyrosin kinase som spiller en viktig rolle i kreft progresjon ved å fremme overlevelse, angiogenese, spredning, og invasjon veier. I denne studien fant vi at SRC protein nivåer konsekvent ble oppregulert i lungekreft vev, men at SRC mRNA nivåer variert tilfeldig, noe som tyder på at en post-transcriptional mekanisme var involvert i SRC regulering. Fordi microRNAs (mirnas) er kraftige post-transcriptional regulatorer av genuttrykk, brukte vi bioinformatiske analyser for å søke etter mirnas som potensielt rettet mot SRC. Vi identifiserte spesifikke målgruppe nettsteder for MIR-203 i 3′-utranslaterte område (3′-UTR) av SRC. Vi så eksperimentelt validert MIR-203 som en direkte regulator av SRC bruk, celle, transfeksjon og luciferase analyser og viste at MIR-203 hemmet SRC uttrykk og dermed utløste undertrykkelse av SRC /Ras /ERK veien. Til slutt viste vi at undertrykkelsen av SRC av MIR-203 trykt spredning og migrasjon og fremmet apoptose av lungekreft celler. Oppsummert denne studien gir de første hint om hvilken rolle MIR-203 som en tumor suppressor i lungekreftceller gjennom hemming av SRC oversettelse
Citation. Wang N, Liang H, Zhou Y, Wang C Zhang S, Pan Y, et al. (2014) MIR-203 Undertrykker spredning og migrasjon og fremmer apoptose av lungekreft celler ved målretting SRC. PLoS ONE 9 (8): e105570. doi: 10,1371 /journal.pone.0105570
Redaktør: Jin Q. Cheng, H.Lee Moffitt Cancer Center Research Institute, USA
mottatt: 07.04.2014; Godkjent: 21 juli 2014; Publisert: 20 august 2014
Copyright: © 2014 Wang et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet:. Den forfatterne bekrefter at alle data som underbygger funnene er fullt tilgjengelig uten restriksjoner. Alle relevante data er i avisen og dens saksdokumenter filer
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet med tilskudd fra National Basic Research Program of China (973 Program) (No. 2014CB542300), National Natural Science Foundation of China (No. 81101330, 31271378, og 81250044), Foundation Natural Science i Jiangsu-provinsen (No. BK2011013 og BK2012014) og Forsknings Special Fund for offentlig velferd Industry of Health (nr 201 302 018). Dette arbeidet ble også støttet av programmet for New Century gode talenter i University fra Kunnskapsdepartementet, Kina (NCET-12-0261). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
lungekreft er den ledende årsak til kreft-relaterte dødsfall på verdensbasis, og ikke-småcellet lungekreft (NSCLC) står for ca 80% av alle tilfeller [1]. Flertallet av lungekreft (56%) blir diagnostisert ved en fjerntliggende stadium fordi tidlig sykdom er vanligvis asymptomatisk; bare 15% av tilfellene er diagnostisert på en lokal scene [2]. Faktisk pasienter med lungekreft viser ofte svulst celle invasjon og metastasering før diagnose, som gjengir nåværende behandlinger, inkludert kirurgi, strålebehandling og kjemoterapi, ineffektiv. Den samlede fem års overlevelse for ikke-småcellet lungekreft er ekstremt lav (17,1%). Derfor studerer det molekylære grunnlaget for lungekreft er avgjørende for å designe nye terapeutiske midler som vil forbedre overlevelse.
Med de betydelige fremskritt i vår forståelse av tumorbiologi, viktige signalveier involvert i formidling lungekreft vekst og progresjon er identifisert [3]. Dominerende onkogener og tumorsuppressorgener involvert i patogenesen av lungekreft har tiltrukket seg betydelig interesse, og deres sentrale roller og grunnleggende bidrag til dårlig oppførsel av kreftceller har blitt klart [4]. Disse genene tilby nye mål for biologisk behandling. Et slikt mål er SRC (også kjent som c-Src), et proto-onkogen som koder for en tyrosinkinase som ofte overuttrykt og aktiveres i mange krefttyper, inkludert lungekreft [5], [6]. På den molekylære basis, regulerer SRC flere signaleringskaskader forbundet med tumorutvikling og progresjon, herunder fokal adhesjonskinase (FAK) vei, epidermal vekstfaktor reseptor (EGFR) vei, og Ras /ERK-reaksjonsveien [7]. Følgelig, for å SRC fungerer som et onkogen favorisere proliferasjon, migrering og invasjon av ulike typer kreftceller [8], [9]. Til tross for disse nylige fremskritt i vår forståelse av de viktige rollene SRC i tumorigenesis, forblir nøyaktige molekylære mekanisme som SRC bidrar til lungekreft progresjon ikke helt klarlagt.
En klasse av små, ikke-koding, singel -stranded RNA kjent som microRNAs (mirnas) har vist seg å være involvert i kreft. mirnas binde mål-mRNA i det komplementære områder i sine 3′-ikke-translaterte regioner (3′-UTR), for derved å undertrykke ekspresjon av målgenet ved posttranskripsjonelt nivå [10], [11]. Gjennom denne mekanisme, mirnas regulere et bredt spekter av biologiske prosesser, inkludert celleproliferasjon og differensiering, migrasjon, apoptose, utvikling, og metabolismen [10]. På den annen side er dysfunksjon av mirnas implisert i forskjellige humane kreftformer, inkludert lungekreft, og mirnas kan fungere som både onkogener og tumorundertrykkere i løpet av karsinogenese [12], [13]. For eksempel er lav ekspresjon av la-7a og høy ekspresjon av det MIR-17-92 klynge forbundet med en dårlig klinisk resultat i lungekreft [14], [15]. Videre ble det rapportert at Mir-31 kan direkte undertrykke kreftdempere LATS2 og PPP2R2A i menneskelig lungekreft [16]. Disse funnene understreker behovet for en grundig søk etter mirnas som er avvikende uttrykk under lunge kreftutvikling, samt behovet for en intensiv etterforskning av sin rolle i tumorbiologi.
Selv om deregulering av miRNAs og SRC spill viktige roller i lunge kreftutvikling, har ingen sammenheng mellom SRC og mirnas i lungekreft blitt rapportert. I denne studien, spådde vi at SRC er et mål på MIR-203. Etter måling uttrykket nivåer av MIR-203 og SRC i menneskelig lungekreft vev og paret noncancerous vevsprøver, vi har oppdaget en invers korrelasjon mellom MIR-203 og SRC proteinnivåer. Videre har vi eksperimentelt validert direkte hemming av SRC oversettelse av MIR-203 ved hjelp av celle transfeksjon og luciferase analyser. Til slutt viste vi at MIR-203 hemmet SRC ekspresjon og derved utløste undertrykkelse av nedstrøms signalveier for SRC, slik som SRC /Ras /ERK svei, som til slutt undertrykt proliferasjon og migrering og fremmet apoptose av lungekreftceller.
Materialer og metoder
Cells og menneskelig vev
den menneskelige lungekreft cellelinjer A549, HCC827, og H1975, og den menneskelige normal lunge fibroblastcellelinje HLF ble kjøpt fra Shanghai Institute of Cell Biology, Chinese Academy of Sciences (Shanghai, Kina). A549, HCC827 og H1975-celler ble dyrket i DMEM supplementert med 10% føtalt bovint serum (GIBCO, CA, USA), og HLF-celler ble dyrket i F12K supplert med 10% føtalt bovint serum (GIBCO) og 2,5 g /l NaHCO
3. Alle celler ble inkubert i en 5% CO
2 ved 37 ° C i en vannmettet atmosfære. De lungesvulster og sammenkoblede normale tilstøtende vev ble avledet fra pasienter som gjennomgår et kirurgisk inngrep på Affiliated Gulou Hospital of Nanjing University (Nanjing, Kina). Deretter ble tumor delen glir utsatt for immunohistokjemisk analyse av SRC (sc-8056, Santa Cruz Biotechnology, California, USA) i henhold til produsentens instruksjoner. Alle pasientene eller deres foresatte har gitt skriftlig samtykke, og etikkomiteen fra Nanjing University godkjent alle aspekter ved denne studien. Vevsfragmentene ble umiddelbart frosset i flytende nitrogen ved tidspunktet for kirurgi og lagret ved -80 ° C. De kliniske funksjonene pasientene er oppført i tabell S1 i File S1.
RNA isolering og kvantitativ RT-PCR
Total RNA ble ekstrahert fra de dyrkede celler og menneskelig vev ved hjelp TRIzol Reagens (Invitrogen , Carlsbad, California) i henhold til produsentens instruksjoner. Analyser å kvantifisere mirnas ble utført ved hjelp Taqman miRNA sonder (Applied Biosystems, Foster City, CA) i henhold til produsentens instruksjoner. Kort fortalt, en mikrogram total RNA ble revers-transkribert til cDNA ved hjelp av AMV revers transkriptase (Takara, Dalian, Kina) og en stilk-løkke RT primer (Applied Biosystems). Reaksjonsbetingelsene var som følger: 16 ° C i 30 min, 42 ° C i 30 min, og 85 ° C i 5 minutter. Real-time PCR ble utført ved hjelp av en TaqMan PCR kit på en Applied Biosystems 7300 Sequence Detection System (Applied Biosystems). Reaksjonene ble inkubert i en 96-brønners optisk plate ved 95 ° C i 10 minutter, etterfulgt av 40 sykluser på 95 ° C i 15 s og 60 ° C i 1 min. Alle reaksjonene ble kjørt i triplikat. Etter reaksjonen ble syklusen terskel (C
T) data bestemmes ved hjelp av faste terskelinnstillinger, og gjennomsnittlig C
T av tredoble PCR ble bestemt. En sammenlignende C
T metoden ble brukt til å sammenligne hver tilstand til kontrollene. De relative nivåer av mirnas i celler og vev ble normalisert til U6. Mengden av miRNA i forhold til den interne kontrollen U6 ble beregnet ved hjelp av to
-ΔΔCT ligningen, hvor ΔΔC
T = (C
T miRNA – C
T U6)
mål – (C
T miRNA – C
T U6)
kontroll. For å kvantifisere SRC mRNA, 1 ug total RNA ble revers-transkribert til cDNA ved anvendelse av oligo dT og Thermoscript (Takara) i reaksjonsblandingen, som ble utført med de følgende betingelser: 42 ° C i 60 min og 70 ° C i 10 min . Deretter ble real-time PCR utføres ved hjelp av RT produkt, SYBER grønt fargestoff (Invitrogen) og spesifikke primere for SRC og GAPDH. Sekvensene til primerne var som følger: SRC (sense): 5′-CATCCAAGCCTCAGACCCA-3 «; SRC (antisens) 5»-TGACACCACGGCATA CAGC-3 «; GAPDH (sense): 5»-GATATTGTTGCCATCAATGAC-3 «; og GAPDH (antisens) 5»-TTGATTTTGGAGGGATCTCG-3 «. Reaksjonene ble inkubert ved 95 ° C i 5 minutter, etterfulgt av 40 sykluser på 95 ° C i 30 s, 60 ° C i 30 s, og 72 ° C i 30 sek. Etter at reaksjonene var fullstendige, C
T-verdier ble bestemt ved å sette en fast terskel. Den relative mengden av SRC mRNA ble normalisert til GAPDH.
Overuttrykte og knockdown av MIR-203
Syntetiske pre-MIR-203, anti-MIR-203 og egge negative kontroll RNA ble kjøpt fra Ambion (Austin, Texas, USA). Alle celler ble sådd i 6-brønns plater eller 60-mm skåler, og cellene ble transfektert med Lipofectamine 2000 (Invitrogen) følgende dag når cellene var tilnærmet 70% sammenflytende. I hver brønn, like mengder pre-MIR-203, anti-MIR-203 eller egge negativ kontroll RNA ble brukt. Cellene ble høstet 24 timer etter transfeksjon for kvantitativ RT-PCR og Western blotting.
Luciferase reporter analysen
For å teste den direkte binding av MIR-203 til målet genet SRC, en luciferase reporter assayet ble utført som tidligere beskrevet [17]. Hele 3′-utranslatert region (3′-UTR) av human SRC ble amplifisert ved hjelp av PCR med humant genomisk DNA som templat. PCR-produktene ble innført i p-MIR-reporter plasmid (Ambion), og innsettingen ble bekreftet som korrekt ved sekvensering. For å teste bindingen spesifisitet, ble sekvensene som interaksjon med den MIR-203 frø-sekvensen mutert (fra AUUUCA til UAAAGU), og mutant SRC 3′-UTR ble innsatt i en tilsvarende luciferase reporter. For luciferase reporter-analyser, A549-celler ble dyrket i 24-brønners plater, og hver brønn ble transfektert med 1 jjg ildflue luciferase reporter plasmid, 1 ug av et β-galaktosidase (β-gal) ekspresjonsplasmid (Ambion), og like mengder (100 pmol) av pre-MIR-203, anti-MIR-203 eller forvrengt negativ kontroll RNA bruker Lipofectamine 2000 (Invitrogen). Den β-gal plasmid ble brukt som en kontroll transfeksjon. Tjuefire timer etter transfeksjon, ble cellene analysert ved hjelp av en luciferase assay kit (Promega, Madison, WI, USA).
Plasmid konstruksjon og siRNA forstyrrelser analysen
En siRNA sekvens rettet mot menneskelig SRC cDNA ble designet og syntetisert av GenePharma (Shanghai, Kina). SiRNA-sekvensen var 5′-CACUACAAGAUCCGGAAAC-3 «. En egge siRNA ble inkludert som en negativ kontroll. Et pattedyr-ekspresjonsplasmid som koder for det humane SRC åpen leseramme (pReceiver-M02-SRC) ble innkjøpt fra GeneCopoeia (Germantown, MD, USA). Et tomt plasmid tjente som en negativ kontroll. SRC ekspresjonsvektor og SRC siRNA ble transfektert inn i A549 cellene ved hjelp Lipofectamine 2000 (Invitrogen) i henhold til produsentens instruksjoner. Total RNA og protein ble isolert 24 timer etter transfeksjon. De SRC mRNA og protein uttrykk nivåer ble bestemt ved kvantitativ RT-PCR og Western blotting.
Protein ekstraksjon og Western blotting
Alle celler ble skylt med PBS (pH 7,4) og lysert i RIPA Lysis buffer (Beyotime, Kina) supplert med en protease og fosfatase-hemmer Cocktail (Thermo Scientific 78440) på is i 30 min. Vevsprøvene ble frosset fast med flytende nitrogen, malt til et pulver og lysert i RIPA-lyseringsbuffer inneholdende proteasen og fosfatase-hemmer Cocktail på is i 30 min. Når det er nødvendig, ultralydbehandling ble anvendt for å lette lysis. Cellelysater eller vevshomogenater ble sentrifugert i 10 minutter (12 000 g, 4 ° C). Supernatanten ble oppsamlet, og proteinkonsentrasjonen ble beregnet ved bruk av en Pierce BCA proteinanalysesett (Thermo Scientific, Rockford, IL, USA). De proteinnivåer ble analysert ved hjelp av Western blot med tilsvarende antistoffer. Proteinnivåene ble normalisert ved sondering de samme blotter med en GAPDH antistoff. Antistoffene ble kjøpt fra følgende kilder: anti-c-Src (B-12) (sc-8056, Santa Cruz Biotechnology), anti-ERK1 /2 (pT202 /pY204) (BD Biosciences 612359, USA), anti-ERK1 (BD Biosciences 610031, USA), anti-PKCalpha (H-7) (sc-8393, Santa Cruz Biotechnology) og anti-GAPDH (sc-365062, Santa Cruz Biotechnology). Ras aktivitet ble oppdaget ved hjelp av Ras Activation Assay Kit fra Upstate-Millipore (17-218). Proteinbåndene ble analysert ved anvendelse av programvaren ImageJ.
Celleviabilitet assay
For å vurdere cellelevedyktigheten ble A549-celler sådd ut i triplikat i 96-brønners plater i en tetthet på 5 x 10
3-celler per brønn i 100 ul av kulturmedium. Indeksen celleproliferasjon ble målt ved anvendelse av 3- (4,5-dimetyltiazol-2-yl) -2,5-difenyl-tetrazolium-bromid (MTT) analyse (Sigma, USA), som ble utført 12, 24, 36, og 48 timer etter transfeksjon i henhold til produsentens instruksjoner.
Cell migrasjon analysen
migrasjon evne til A549 celler transfektert med Mir-203 etterligne eller SRC overekspresjon plasmid ble testet i en Transwell Boyden Chamber (6,5 -mm, Costar, USA). Av polykarbonatmembraner (8- um porestørrelse) på undersiden av det øvre kammeret av Transwells ble belagt med 1% humant fibronektin (R og de vedlagte og flytende celler ble så høstet. Flowcytometri analyse av apoptotiske celler ble utført ved hjelp av en Annexin V-FITC /PI farging kit (BD Biosciences, CA, USA). Etter vaskinger med kald PBS ble cellene resuspendert i bindingsbuffer (100 mM HEPES, pH 7,4, 100 mM NaCl, og 25 mM CaCl
2) etterfulgt av farging med Annexin V-FITC /PI ved romtemperatur i mørke i 15 min. Apoptotiske celler ble deretter evaluert ved gating PI og annexin-V-positive celler på en fluorescens-aktivert cellesortering (FACS) strømningscytometer (BD Biosciences, San Jose, CA). Alle forsøk ble utført in triplo.
Statistisk analyse
Samtlige bilder av Western blotting er representative for minst tre uavhengige eksperimenter. Kvantitativ RT-PCR, luciferase reporter analysen, og celleviabilitet og apoptose-analyser ble utført i tre eksemplarer, og hvert forsøk ble gjentatt flere ganger. Dataene som vises, er det gjennomsnitt ± SE av minst tre uavhengige eksperimenter. Forskjellene ble vurdert som statistisk signifikant på p. 0,05 hjelp Student t-test
Resultater
oppregulering av SRC protein, men ikke mRNA, i lungekreft vev
først undersøkt SRC-ekspresjon ved hjelp av både immunohistokjemisk analyse og immunoblotanalyse i humane lungekreft vev og tilhørende noncancerous vev. Vi fant at Src-protein nivåene var dramatisk høyere i lungekreft vev (Figur 1, A-C). Selv om SRC protein ble konsekvent oppregulert i lungekreft vev, gjorde SRC mRNA nivåer ikke signifikant forskjellig mellom kreft og noncancerous vev (figur 1D). Videre fant vi at SRC proteinnivået var høyere i humane lunge adenokarsinom A549 celler i forhold til det normale lunge fibroblast HLF celler (figur S1, A og B i File S1), men SRC mRNA nivået var lik i disse to cellelinjer (Figur S1C i File S1). Dette misforholdet mellom protein og mRNA i SRC uttrykk i lungekrefttilfellene sterkt antyder at en post-transcriptional mekanisme er involvert i SRC regulering.
(A) Representant bilde av immunhistokjemisk analyse av SRC uttrykk i lungekreft (CL) og normale tilstøtende vev (NL) prøver. (B og C) Western blotting-analyse av ekspresjonsnivåer av Src-protein i seks par av CL og NL prøver. B: representant bildet; C: kvantitativ analyse. (D) Kvantitativ RT-PCR-analyse av de relative ekspresjonsnivå av SRC mRNA i seks par av CL og NL prøver. * P 0,05; ** P. 0,01
Identifikasjon av konserverte MIR-203 målse innenfor 3′-UTR av SRC
En viktig modus for post-transcriptional regulering er undertrykkelse av mRNA transkripsjoner av miRNAs. mirnas er derfor sannsynlig å spille en biologisk relevant rolle i regulering av SRC-ekspresjon i lungekreft. Tre beregningsalgoritmer, inkludert TargetScan [18], Miranda [19], og PicTar [20], ble brukt i kombinasjon for å identifisere potensielle mirnas som kan målrette SRC. Ved hjelp av disse metodene, ble MIR-203 identifisert som en kandidat regulatoriske miRNA av SRC. Den forutsagte interaksjonen mellom MIR-203 og målse i SRC 3′-UTR er illustrert i figur 2A. Fire potensielle MIR-203 målse ble funnet i 3′-UTR av SRC mRNA sekvens. Minste frie energi verdier av disse hybridene var -16,9, -20,1, -15,8 og -18,9 kcal /mol, henholdsvis, som er godt innenfor rekkevidden av ekte miRNA-target par. Videre skjedde perfekte baseparing mellom frøet region (kjernesekvens som omfatter de første 2-8 baser av den modne miRNA) og beslektede mål. Videre er MIR-203 bindende sekvenser i SRC 3′-UTR svært konservert over arter.
(A) Skjematisk beskrivelse av de hypotetiske tomannsboliger dannet av samspillet mellom bindingsstedene i SRC 3′ UTR (øverst) og Mir-203 (nederst). Den forutsagte fri energi verdien av hvert hybrid er indikert. Frøet gjenkjenningsseter er merket, og alle nukleotider i disse regionene er svært konservert over arter, inkludert menneske, mus og rotter. (B) Kvantitativ RT-PCR analyse av ekspresjonsnivåer av MIR-203 (i form av miRNA /U6 forhold) i seks par av CL og NL prøver. (C) Pearsons korrelasjon spredningsdiagram av fold endring av nivåene av MIR-203 og SRC protein i humane lungekreft vev. (D) Pearsons korrelasjon spredningsdiagram av fold endring av nivåene av MIR-203 og SRC mRNA i humane lungekreft vev. * P 0,05; ** P. 0,01
Påvisning av en invers korrelasjon mellom MIR-203 og SRC nivåer i lungekreft vevsprøver
mirnas er generelt antatt å ha uttrykk mønstre som er motsatt i tillegg til sine mål [21] – [23]. Vi neste undersøkt om MIR-203 ble omvendt korrelert med SRC i lungekreft. Etter å bestemme nivåene av MIR-203 i de samme seks par av lungekreft vev og de tilsvarende noncancerous vev, viste vi at Mir-203 nivåer ble konsekvent nedregulert i lungekreft vev (figur 2B). Den inverse sammenhengen mellom MIR-203 nivåer og SRC protein nivåer (Figur 2C) og misforholdet mellom MIR-203 nivåer og SRC mRNA nivåer (figur 2D) ble ytterligere illustrert ved hjelp av Pearsons korrelasjon spredningsplott. Som observert, en invers korrelasjon mellom de MIR-203 nivåer og Src-protein nivåer, men ikke mRNA-nivåer ble observert i humane lungekreft vev. Likeledes MIR-203 nivået var også lavere i A549 celler sammenlignet med i HLF celler (Figur S1D i File S1). Resultatene sterkt indikerte at en typisk, miRNA-mediert, post-transcriptional Reguleringen var involvert i SRC undertrykkelse.
Validering av SRC som et direkte mål for MIR-203
Sammenhengen mellom MIR -203 og SRC ble ytterligere undersøkt ved å evaluere SRC uttrykk i humane lunge adenokarsinom A549 celler etter overekspresjon av MIR-203. I disse forsøk ble MIR-203 overekspresjon oppnådd ved transfeksjon av cellene med pre-MIR-203 (en syntetisk RNA-oligonukleotid-dupleks ligne MIR-203 forløper). Som forventet ble det MIR-203 nivåer i A549 celler økt mer enn 300 ganger når disse cellene ble transfektert med pre-MIR-203 (figur 3A). For å validere at transfeksjon av MIR-203 var vellykket, en av de representative målgener av MIR-203, PKCalpha (NR), ble vurdert og det ble vist at PKCalpha var signifikant nedregulert i A549 celler etter transfeksjon av MIR-203 (figur S2 Fil S1). Likeledes, ble ekspresjon av Src-protein reduseres ved innføring av MIR-203 i A549-celler (figur 3, B og C). For å bestemme hvilket nivå MIR-203 påvirket SRC uttrykk, vi gjentas de ovennevnte forsøk og undersøkt ekspresjon av SRC mRNA etter transfeksjon. Selv om den intracellulære nivået av MIR-203 ble betydelig endret etter behandling med pre-MIR-203, gjorde overekspresjon av MIR-203 ikke påvirke SRC mRNA stabilitet (figur 3D). På den annen side ble korrelasjonen mellom MIR-203 og SRC også undersøkt ved å vurdere SRC ekspresjon i normale lunge fibroblast HLF-celler etter knockdown av MIR-203 med anti-MIR-203 (kjemisk modifiserte antisensoligonukleotider utformet spesifikt mot moden speil 203) (Figur 3A). Banket ned MIR-203 i HLF-celler resulterte i økning av Src-protein (figur 3, B og C), men ikke mRNA (figur 3D) nivåer. Disse resultater viser at MIR-203 regulerer spesifikt Src-protein ekspresjon på post-transkripsjonelle nivå, som er en typisk dyre miRNA-mediert mekanisme regulering. For å demonstrere robustheten av testen, vi gjentas de ovennevnte forsøk på ytterligere to lunge adenokarsinom-cellelinjer, HCC827 og H1975. Likeledes, Mir-203 nivåene ble betydelig økt når HCC827 og H1975 celler ble transfektert med pre-MIR-203 (Figur S3, A og E i File S1). Følgelig ble Src-protein nivåer trykkes når HCC827 og H1975-celler ble behandlet med pre-MIR-203 (figur S3, B, C, F og G i File S1), men SRC mRNA-nivåer ble ikke påvirket av slik behandling (figur S3, D og H i File S1).
(A) Kvantitativ RT-PCR analyse av MIR-203 nivåer i A549 celler behandlet med pre-MIR-kontroll eller pre-MIR-203 og i HLF celler behandlet med anti-MIR-kontroll eller anti-MIR-203. (B og C) Western blot-analyse av Src-protein-nivåer i A549-celler behandlet med pre-MIR-kontroll eller pre-MIR-203 og i HLF celler behandlet med anti-MIR-kontroll eller anti-MIR-203. B: representant bildet; C: kvantitativ analyse. (D) Kvantitativ RT-PCR analyse av SRC mRNA nivåer i A549 celler behandlet med pre-MIR-kontroll eller pre-MIR-203 og i HLF celler behandlet med anti-MIR-kontroll eller anti-MIR-203. (E) Firefly luciferase journalister som inneholder vill-type (WT) eller mutant (MUT) MIR-203 bindingssteder i SRC 3′-UTR ble ko-transfektert inn i A549 celler med pre-MIR-kontroll eller pre-MIR-203 og i HLF celler med anti-MIR-kontroll eller anti-MIR-203. Tjuefire timer etter transfeksjon, ble cellene analysert ved hjelp av et luciferase-analysesett. Resultatene beregnes som forholdet mellom ildflue luciferase-aktivitet i den pre-MIR-203- eller anti-MIR-203-transfekterte celler normalisert til kontrollcellene. * P 0,05; ** P. 0,01
For å avgjøre om de negative regulatoriske effekter som MIR-203 som utøves på SRC uttrykk ble formidlet gjennom binding av MIR-203 til de antatte områder i 3′-UTR av SRC mRNA, den fulle lengde SRC 3′-UTR inneholdende de fire antatte MIR-203 bindingsseter ble sammensmeltet nedstrøms fra ildflue luciferase-genet i en reporter plasmid. Det resulterende plasmid ble transfektert inn i A549-celler sammen med en transfeksjon styre plasmid (β-gal) og pre-MIR-203. Som forventet, overekspresjon av MIR-203 resulterte i en mer enn 50% reduksjon av luciferase reporter aktivitet sammenlignet med celler behandlet med den negative kontroll-RNA (figur 3E). Videre introduserte vi punktmutasjoner i de tilsvarende komplementære områder i SRC 3′-UTR å eliminere den anslåtte MIR-203 bindingsseter (alle de fire innbindingsposisjonene var mutant). Dette mutert luciferase reporter var upåvirket av overekspresjon av MIR-203 (Figur 3E). I motsetning til dette, når det resulterende plasmidet ble transfektert inn i HLF-celler sammen med en transfeksjon styre plasmid (β-gal) og anti-MIR-203, knockdown av MIR-203 resulterte i en mer enn 75% økning av luciferase reporter aktivitet sammenlignet med celler behandlet med den negative kontroll RNA, mens den muterte luciferase reporter var upåvirket av knockdown av MIR-203 (figur 3E). Dette funnet tyder på at bindingssteder bidrar sterkt til miRNA: mRNA samhandling formidling av post-transcriptional undertrykkelse av SRC uttrykk. I konklusjonen, våre resultater viser at MIR-203 direkte gjenkjenner og binder seg til 3′-UTR av SRC mRNA-transkript og hemmer SRC oversettelse.
Undertrykkelse av SRC /Ras /ERK signalveien ved MIR-203
Vi neste analysert de biologiske konsekvensene av redusert SRC uttrykk forårsaket av MIR-203 i lungekreftceller. Som et potent onkogen, SRC regulerer proliferasjon og motilitet av kreftceller ved å påvirke FAK, EGFR, og Ras /ERK signalveier [7]. Derfor, undersøkte vi hvorvidt undertrykkelse av SRC ekspresjon på grunn av MIR-203 regulerer aktivitetene til molekylene i SRC /Ras /ERK-signalveien. For det første validert vi effekten av SRC aktivitet på Ras /ERK-reaksjonsveien signal i A549-celler. I overensstemmelse med tidligere rapporter [7], [24], knockdown av SRC ved siRNA-mediert RNA interferens resulterte i redusert SRC mRNA og proteinnivåer (figur 4, A-C), som i sin tur førte til redusert Ras-GTP og fosforylert ERK1-/2 (figur 4, A og B). I motsetning til overekspresjon av SRC resulterte i økt SRC mRNA og proteinnivåer (figur 4, A-C), som i sin tur ført til økt Ras-GTP og fosforylert ERK1-/2 (figur 4, A og B). Deretter undersøkte vi om MIR-203 induksjon kan etterligne SRC reduksjon i å undertrykke Ras /ERK signalveien. Som forventet, overekspresjon av MIR-203 i A549-celler downregulated den Src-protein, og resulterte i mindre aktive Ras-GTP, som i sin tur førte til mindre fosforylert ERK1 /2 (figur 4, D og E). Tatt sammen tyder disse resultatene på at Ras /ERK, som nedstrømssignalveien fra SRC, kan bli kontrollert av den MIR-203 /SRC reguleringsveien.
(A og B) Western blotting-analyse av proteinet nivåer av SRC, Ras-GTP, total Ras, fosforylert ERK1 /2, og ERK1 i A549-celler transfektert med kontroll siRNA, SRC siRNA, kontroll vektor, eller SRC vektor. A: representant bildet; B: kvantitativ analyse. (C) Kvantitativ RT-PCR analyse av de SRC-mRNA-nivåer i A549-celler behandlet med kontroll siRNA, SRC siRNA, kontroll vektor, eller SRC vektor. (D og E) Western blotting-analyse av proteinnivåer SRC, Ras-GTP, total Ras, fosforylert ERK1 /2, og ERK1 i A549-celler transfektert med forhånds MIR-kontroll eller pre-MIR-203. D: representant bildet; E: kvantitativ analyse. * P 0,05; ** P. 0,01
Rollen MIR-203 i regulering SRC i lungekreftceller
neste fokusert på å studere rollen MIR-203 i regulering SRC. Fordi SRC er kjent for å være involvert i reguleringen av celleproliferasjon, apoptose, og migrasjon, undersøkte vi hvorvidt MIR-203 vil regulere SRC for å modulere celleproliferasjon, apoptose, og migrasjon i A549-celler. Til støtte for ideen om at SRC er viktig for å fremme spredning [25], A549 celler transfektert med SRC siRNA viste hemming av celleproliferasjon (figur S4A i File S1); i motsetning til transfeksjon med SRC-overuttrykkende plasmid, som spesielt uttrykker full-lengde åpen leseramme (ORF) av SRC uten MIR-203-responsive 3′-UTR, hadde en motsatt virkning på celleformering (figur S4B i File S1). Deretter vurderes vi rollen som MIR-203 på celleproliferasjon. Som forventet, hadde A549-celler transfektert med forhånds MIR-203 reduserte SRC proteinnivåer (figur 5, A og B) og proliferert ved en betydelig lavere hastighet (figur 5C).
