Abstract
IL-2 er den primære vekstfaktor for å fremme overlevelse og spredning av aktivert T-celler som oppstår etter inngrepet av Janus kinase (JAK) 1-3 /og Signal Svinger og Activator av transkripsjon (STAT) 5 signalveien. STAT5 har to isoformer: STAT5A og STAT5B (ofte referert til som STAT5) som, i T-celler, spiller roller redundante transkribere cellesyklus og overlevelses gener. Som sådan, kan inhibering av STAT5 av en rekke mekanismer hurtig indusere apoptose i visse lymfoide tumorceller, noe som tyder på at den og dens målgener representere terapeutiske mål for å kontrollere visse lymfoide sykdommer. For å søke etter disse molekylene vi justert IL-2 regulerte gener oppdaget av Affymetrix genuttrykk mikromatriser med STAT5 cistrome identifisert av chip-on-Chip analyse i en IL-2-avhengig human leukemi cellelinje, Kit225. Velg overlappende gener ble deretter validert ved hjelp av Qrt
2PCR medium-throughput arrays i humane PHA-aktiverte PBMC. Av 19 antatte gener, en nøkkel regulator av T-celle-reseptor-signalisering, PDE4B, ble identifisert som en ny mål, som var lett oppregulert på proteinnivået (3 h) i IL-2-stimulerte, aktiverte humane PBMC. Overraskende nok bare renset CD8 + primære T-celler uttrykte PDE4B, men ikke CD4 + celler. Videre PDE4B ble funnet å være sterkt uttrykt i CD4 + lymfoide kreftceller, noe som antyder at det kan representere en fysiologisk rolle som er unik for CD8 + og lymfoide kreftceller og derved kan representere et mål for farmasøytisk intervensjon for visse lymfoide sykdommer.
Citation: Nagy ZS, Ross JA, Rodriguez G, Balint BL, széles L, Nagy L, et al. (2013) Genome Wide Mapping avslører PDE4B som en IL-2 Induced STAT5 Target Gene i aktiverte humane PBMC og lymfoid kreftceller. PLoS ONE 8 (2): e57326. doi: 10,1371 /journal.pone.0057326
Redaktør: Ramin Homayouni, University of Memphis, USA
mottatt: 06.09.2012; Godkjent: 21 januar 2013; Publisert: 25 februar 2013
Copyright: © 2013 Nagy et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av National Institutes of Health (NIH) tilskudd antall AI053566 til RAK og et pilotprosjekt tilskudd til ZSN (NIGMS SCORE program, Grant S06 GM008012-37), og gjort mulig av Grant Number 5G12RR008124 fra National Center for Forskning Resources, en komponent av NIH. ZSN er mottaker av János Bolyai Forskning Felowship fra den ungarske Academy of Sciences og støttes av NKTH-OTKA-EU 7KP (Marie Curie actions) Reintegrering Grant (OTKA MB08C 84630). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
pattedyr Signal Svinger og Activator av transkripsjon (STAT) familie består av 7 medlemmer (1-4, 5a, 5b og 6). STAT molekyler utøver avgjørende roller i celleproliferasjon, differensiering og overlevelse (oversikt i [1]). Opprinnelig statistikk ble antatt å være latente faktorer bosatt i cytosol og bare aktiveres når cytokiner binde seg til sin kognatreseptoren etter aktivering av Janus tyrosin kinaser (JAK). Faktisk den sentrale modellen tyder på at Jaks phosphorylate tyrosinrester på reseptoren fungerer som docking nettsteder for SH2 domenet inneholder signalmolekyler som statistikk. Etter docking via fosfotyrosin-SH2 interaksjoner, statistikk selv blir tyrosin fosforylert av Jaks, løsner fra reseptoren og danner dimerer via gjensidige fosfotyrosin-SH2 domenet interaksjoner. STAT-dimer blir deretter translokert til kjernen for å initiere gentranskripsjon [2] – [3]. Men nå vet vi at STATISTIKK kan dimerisere og danne tetramers i fravær av tyrosinfosforylering og være atom lokalisert til styre genregulering i mange unike måter som er mindre forstått [4] -. [5]
Det som er klart er at statistikk 1, 3, 5A og 5B allment benyttes av forskjellige cytokiner og er viktig for regulering av cellevekst, spredning og død, mens statistikk 2, 4 og 6 fremme viral forsvar og Th1 versus Th2 differensiering, henholdsvis. Videre STAT3 og STAT5 har blitt funnet å være nært beslektet og relevant til tumorgenese (oversikt i [1]). Faktisk er konstitutivt tyrosin-fosforylerte former av STAT5 lett observert i en rekke kreftceller og vev i forskjellige opprinnelse som et resultat av translokasjon, deregulerte tyrosin-kinaser og viral transformasjon (oversikt i [1]).
fysiologiske rollen til STAT5A og B er i stor grad hentet fra
in vivo
studier av STAT5A og B knockout dyr. Fra disse studiene synes det klart at STAT5A er hovedsakelig involvert i melkekjertlene utvikling [6] og STAT5B er ansvarlig for å regulere vekst via veksthormon signaliserer [7]. I T-lymfocytter, men de har kompenserende funksjoner: studier fra STAT5A /B dobbel manglende mus har vist at de har redundante roller i å mediere cellesyklusprogresjon av aktiverte T-celler [8], [9]. I tillegg har studier som anvender STAT5A /B-null-mus tyder på at disse molekylene er viktige for lymfoid organutvikling som en mangel i disse proteinene kan resultere i alvorlig kombinert immunsvikt fenotype [10]. Dessuten, synes STAT5 å virke som en kritisk overlevelsesfaktor for T-celler, ettersom konstitutivt aktiv (dvs. tyrosin-fosforylert) STAT5 er ofte til stede i lymfoid og leukemiske kreftceller blant andre typer av tumorer sammenlignet med normale, ikke-transformerte celler (gjennom i [1]). Videre blokkerer STAT5 ekspresjon i humane perifere mononukleære blodceller, så vel som lymfoide og leukemiske kreftceller alvorlig kompromiss celleviabilitet og indusere apoptotisk celledød [11]. Bevis fra mange grupper tyder på at STAT3 spiller en lignende rolle onkogen til STAT5 og avhengig av celletype, en kan være mer dominant [12]. Nye funn for denne familien av proteiner tyder også på at deres celle overlevelse fremme egenskaper når un-fosforylert kan spille et gen regulerende rolle også [4]. Disse data bidra til å gi spennende nye modeller som tyder på at farmakologisk frakobling av aktivert samt un-aktivert STAT5 kan være nødvendig å forstyrre sine mål gener for å indusere kreft celledød. Dermed identifisere celle overlevelse og svulst relevant STAT5 målgener er et viktig mål for utvikling av nye anti-kreft terapier.
En metode som har vist seg vellykket i å identifisere nye målgener er kromatin immunoprecipitation som kan avsløre direkte transkripsjon faktor-DNA-interaksjoner [13] og gir mulighet for identifisering av ukjente transkripsjonsfaktorbindingsseter i nye målgener ved å generere et genom-bibliotek bred som kan være (i) sekvensert og lokalisert i det humane genom, eller (ii) hybridisert til mikromatriser som representerer ikke-kodende regioner av genomet. Genome-wide kartlegging av cytokin indusert STAT5 målgener har blitt utført og publisert i ulike celletyper (T-, pre-B-, menneske NK-lignende svulst og brystkreft celler) ved hjelp av chip klone eller chip-Seq teknologier [4] [14] – [18]. Spesielt kartlegge IL-2 induserbar STAT5 bindende hendelser og transkripsjons endringer i primær T-celler ved hjelp av chip sekv, genuttrykk mikromatriser eller RNA-Seq teknologi har blitt utført og publisert for både mus [5], [16], [19 ], [20] og human [16], [19] modeller. Disse viktige studier primært fokusert på rollen STAT5 i T-hjelpercelledifferensiering og fysiologiske immunresponser.
Den nåværende arbeid søkt å identifisere nøkkel celle overlevelse og svulst relevante STAT5 målgener i IL-2 avhengige humane leukemiceller ved hjelp genekspresjon og formidler microarray studier. Resultatene av disse ble justert og en utvalgt pool av kandidat mål ble deretter validert i normale menneskelige aktiverte PBMC. Fosfodiesterase (PDE) 4B, en regulator av cyklisk AMP signalisering i T-celler ble vist å være IL-2 reguleres på primede humane PBMC og CD8 + T-celler renset. Interessant dette molekylet var sterkt over uttrykt i lymfoid svulst, men ikke primet primære CD4 + T-celler.
Diskusjon
En Genome-wide tilnærming for å identifisere STAT5 Spesifikke IL-2-medierte Gener
Resultater og
STAT5 er en potent regulator av T-celle-overlevelse som dens depletion fører til massiv celledød av aktiverte T- og lymfoide tumorceller [11] – [12]. Hittil har genomstudier vært benyttet til å identifisere og lokalisere IL-2 regulerte STAT5 bindende hendelser og målgener i normal mus [5], [16], [19], [20] og humane T-celler [16], [19] anmeldt i [21]. Men i denne studien søkte vi å identifisere genom IL-2 mediert STAT5 genet mål fra lymfoide tumorceller (Figur S1). Å systematisk kartlegge STAT5 bindingsseter på genomisk skala som vi definerer som STAT5 cistrome [22] og IL-2-medierte genuttrykk endringene vi ansatt mikromatriser. For disse studiene vi først bestemt den STAT5 cistrome ved hjelp av chip-on-chip i IL-2-avhengige Kit225 celler som enten var venstre un-stimulert eller stimulert med IL-2 i 30 minutter, fulgt av etterfølgende genekspresjon analyse for å påvise IL-2- mediert mRNA forandrer på 3 timer. De resulterende data bassengene var så statistisk analysert og justert og en utvalgt sett av gener som næret STAT5 bindingssteder innenfor sine promotorområdene ble validert ved hjelp medium gjennomstrømming QRT
2PCR arrays.
generere et bibliotek av IL-2 regulerte STAT5 bindingssteder
Først ble tre biologiske replikater chip, under anvendelse av en blanding av antistoffer rettet mot C-enden av STAT5A og STAT5B i Kit225 celler stimulert med IL-2 i 30 minutter. Analysen ble validert ved å måle IL-2-indusert anrikning av IL2RA enhancer [23]-elementet angitt Positiv regulatoriske område (PRR) III (figur 1A) via STAT5 antistoffer sammenlignet med kontrollserum. Deretter ble det tatt DNA forsterket som beskrevet i Materialer og metoder ved hjelp av en tilfeldig amplifikasjonsprotokoll. For å bekrefte at bibliotekene forble beriket for den positive kontrollen PRR III element post-forsterkning, ble PRR III målt ved hjelp av qPCR (figur 1B) fra alle replikere eksperimenter. Deretter ble mikroarray-analyse ved hjelp av Menneskelig Affymetrix Genechip Promoter 1.0R matriser utføres ved anvendelse av inndata genomisk DNA (som en kontroll) og IL-2-stimulert prøver i tre biologiske replikater som er beskrevet ovenfor. De resulterende «.cel filer» ble deretter analysert ved hjelp MAT (Modellbasert analyse av teglstein array, [24]) som ga «.bed filer» med kromosom koordinatene til alle chip-regioner, inkludert p-verdier, MAT score (til tillate berikelse i ulike regioner av forskjellig lengde for å bli sammenlignet direkte), FDR (false funnrate) beregninger og gjenta flagg. Gjentatte og segment duplisering elementene ble fjernet og de resterende 1581 treff ble kartlagt med CEAS (Cis-regulerende Element Kommentar System) [25] innen 300 kb kommenterte genomiske regioner. Som vist i figur 2A bare omtrent 17% av kandidatgener ligge innenfor nærliggende promotorer, mens ca 25% og 42%, er lokalisert i forsterkere og introner, respektivt. Disse funnene er i god overensstemmelse med andres data som indikerer at flertallet av TF bindingsseter er funnet i intronic og intergeniske regioner [26]. For å sammenligne våre resultater med tidligere publiserte chip-Seq datasett, STAT5A og STAT5B bindingsseter avledet fra primære humane CD4 + T-celler ble re-analysert (GSE27158, [16] med en chip-Seq analyse rørledningen ved Barta et al, [27 ]), og de resulterende topper kastet CEAS analyse. De resulterende utfall for STAT5A og STAT5B områder fordeling var som følger: promoter-bundet 21% og 19%, intronic 34% og 35%, enhancer-bundet 38% og 39%, henholdsvis, noe som indikerer at det genomiske STAT5 bindingsmønster fra den aktuelle chip-on-chip datasett så lik chip-Seq resultatene etter Liao og kolleger [16]. Interessant bare ca 20% av de STAT5 bindingsseter var begrenset til arrangører. Deretter berikelse av TF bindende motiver ble også analysert basert på CEAS tildelt fold endringsverdien som representerer betydelig beriket motiver med 2 fold-endring i brikken regioner over hele genomet. Figur 2B øvre bord og panel viser at TF motivene med høyest fold endringene inkluderer de klassiske STAT bindende motiver TTCNNNGAA i ulike former. Den Interferon Sensitive responselement (SBR) ble også signifikant anriket noe som antyder at i visse celler STAT5 kan også muligens binde seg til disse motivene: enten direkte eller ved hjelp av en annen TF som binder SBR. Figur 2B lavere bord og panel representerer den mest betydelig beriket TF bindingssteder. Intriguingly disse er TTC STAT halv-sider. Kanskje i disse typer celler STAT5 kan binde halvsider direkte eller indirekte, noe som tyder på en unormal regulering som denne type DNA-binding er ikke observert
in vitro product: [28].
(A ) Kit225 IL-2-avhengige humane leukemiceller ble gjort hvilende og deretter stimulert med medium (-) eller IL-2 (+) i 30 minutter ved 37 ° C, fiksert med 1% formaldehyd i 10 minutter ved romtemperatur og deretter kromatin immunoutfelt med antistoff til C-terminal STAT5A /B-blandingen eller kontroll IgG. Den eluerte DNA ble amplifisert med primere som korresponderer til det humane IL2RA PRR III. Representative data fra tre uavhengige eksperimenter er vist. Input materialet representerer 5% av immunopresipitert kromatin. Perler kontroll representerer prøver hvor immunutfelling ble utført uten noen antistoffer, men forøvrig håndtert på identisk. (B) Cellene ble behandlet som beskrevet ovenfor, og deretter for microarray eksperimenter chip-ed DNA ble tilfeldig forsterket etter ligering av forbindelsesledd som beskrevet i Materialer og metoder fra tre uavhengige forsøk. Den forsterkede DNA ble så brukt som mal i qPCR reaksjoner for å måle berikelse av IL2RA PRR III.
(A) Genome-wide distribusjon av STAT5 bindingsseter (prosent av totalt antall nettsteder). Brikken-on-chip identifisert elementer som falt under 300 kb fra kodende områder ble analysert basert på deres avstand fra nærmeste gener ved hjelp av CEAS. Diagrammet representerer «%» distribusjon. (B) Beriket transkripsjonsfaktor bindende motiver med høyest fold-endring (øvre panel) og høyest betydning (nedre panel). Beriket TF bindingssteder og deres matriser innen chip-on-chip identifisert, CEAS analysert regulatoriske elementer vises.
Identifisere IL-2 regulerende gener i Kit225 celler ved hjelp av Gene Expression Analysis
for å identifisere IL-2-medierte gener i Kit225 celler, celler utarmet av IL-2 ble behandlet med IL-2 eller kontroll kjøretøy i 3 timer og utsatt for genekspresjon mikromatriseanalyse i to biologiske replikater. Fra denne analysen, 469 gener endres mer enn to ganger, med 129 ned- og 340 oppregulert gener inkludert flere IL-2-medierte mål som CISH, SOCS1, OSM, PIM-en, BCL6 og BCL2. Dette genet Listen ble analysert med oppfinnsomhet Pathway Analysis web-basert programvare som ytterligere bekreftet STAT5A og STAT5B aktiveringsstatusen etter IL-2 behandling (figur S2) og identifiserte mobilnettverk som er relevante for immunfunksjon inkludert Cellular Development Cell Cycle, Hematologisk System Development Funksjon, Reproductive System Development Funksjon samt Cellular bevegelse, Growth Spredning betydelig overrepresentert (Figur S3).
Identifisere IL-2-regulerte gener av STAT5 Cistrome
Vårt mål var å finne en pool av IL-2 responsive gener som inneholder STAT5 regulatoriske områder. Derfor skapte vi skjærer av STAT5 cistrome og IL-2 responsive gener ved hjelp av UCSC Tabell Browser. Først ble den Affymetrix IDer av genuttrykk bassenget konvertert til genomiske steder (.bed filer) som deretter ble justert med chip-on-chip resultater. Disse bassengene ble visualisert på genomisk skala ved hjelp av «.bed filer» og Integrative Genomics Viewer (IGV, figur 3). Fra skjærer bassenget består av 106 gener, en liste over 57 gener som inneholdt de regulatoriske områder STAT5 innenfor sin proksimale promoter (30 gener), umiddelbare nedstrøms segmenter av genet (7 gener), forsterker (14 gener) eller første ekson (6 gener) ble valgt for validering i menneskelige grunnede PBMC (Figur 3 og Tabell S1) på mRNA-nivå ved hjelp medium gjennomstrømming QRT
2PCR genuttrykk arrays (beskrevet i Materialer og metoder og statistisk signifikante resultater (p-verdi 0.05) er vist i tabell 1). De kjente IL-2 målgener (indikert med stjerner i tabell 1) BCL2, ble BCL6, CDK6 og IL2RA identifisert som IL-2 induserbare gener med STAT5 bindingssteder. Andre kjente IL-2 målgener som CISH, IFNg og foxp3 ble også identifisert av GEA og derfor ble inkludert som positive kontroller på arrays. Selv om disse genene er kjent for å være regulert av STAT5, i Kit225 cellene sine STAT5 bindingsseter ikke ble identifisert ved chip-on-Chip analyse, som vi ikke kan utelukke en celletype spesifikk effekt. For å klargjøre disse funn ble IGV brukt til å visualisere de genomiske steder med kjent (SOCS2, SOCS3, IL2RA, CISH, BCL2, BCL6 og CDK6 (figur 4A) understreket er de som er identifisert i vår skjerm) og 18 ukjent IL-2 /STAT5 target gener (figur 4B). Blant disse er for eksempel CD69 (opptil 2,3 ganger) har blitt vist å påvirke Th17 differensiering, som er en kjent STAT5 avhengig prosess [29]. CDKN2C, også kalt p18 (INK) 4c, er en kjent inhibitor av G1 cellesyklusstart, som her er nedregulert omtrent to ganger med IL-2. Lymfocytt cytosolprotein (LCP) 2 (1,7-fold up) er et mål for Zap70 kinase i T-lymfocytter og dens mangel er kjent for å indusere et fravær av dobbelt-positive CD4 + CD8 + thymocyttene og de perifere T-celler [30]. RAFTLIN (flåte bindende protein) ble også vist å påvirke T-celle medierte immunresponser og Th17 differensiering [31]. STK17B er en serin-kinase også kjent som DRAK (DAP-kinase-relatert apoptose-induserende kinase) 2, som er kjent til å mediere apoptose indusert ved hjelp av IL-2 og regulere T-cellereseptoren følsomhet i u thymocytter [32] – [33]. Fosfodiesterase (PDE) 4 B er en type 4 PDE (opptil ca. 2 ganger) som regulerer TCR-signalisering ved temperering den negative effekten av cAMP [34] og i CD4 + humane T-celler ble redusert PDE4B ekspresjon fører til redusert IL-2-produksjon ved anti -CD3 /CD28 co-stimulering [35]. Chip-on-chip identifisert STAT5 bindingssetet i PDE4B er vist i figur 4B, visualisert ved IGV. Intriguingly, IL-2 økte nivå av PDE4B, som inneholder flere intronic STAT5 bindingsseter, på grunnlag av murine T-cellestudier [5].
Visualisering av resultatene oppnådd fra genomet-wide identifikasjon av IL-2- induserte gener og STAT5 bindingsseter (som beskrevet i fig. 1) med IGV.
(A) Vist er kjent STAT5 målgener inkludert SOCS2, SOCS3, CISH og de også identifisert av chip-on -ChIP (IL2RA, BCL2, BCL6 og CDK6) og (B) 18 nylig identifiserte promoter ligger gener visualisert ved IGV hjelp hg19.
STAT5 Opptar en antatt IL-2 Responsive GAS Side innenfor PDE4B Gene
in vivo
i human PBMC
for å bekrefte at STAT5 er i stand til å binde en antatt GAS nettsted innenfor PDE4B genet (ligger på kromosom 1, hg18 stillinger 66567898-66573077) i en IL-2 induserbar måte, utførte vi chip eksperimenter på hvilende humane PBMC ubehandlet (-) eller behandlet med IL-2 i 30 minutter (+) isolert fra tre uavhengige givere. Som et resultat har vi observert at STAT5 bundet PDE4B i en IL-2-avhengige og signifikant måte (p 0,05) med en omtrent 1,7 gangers økning sammenlignet med ubehandlede celler (figur 5A). Den IL2RA PRR III ble anvendt som en positiv kontroll (figur 5B). Interessant, PDE4B genet inneholdt både STAT5A og STAT5B IL-2 responsive bindingssteder undersøkt innen primær humane T-celler [16] som overlappet med vår chip-on-Chip regionen. Videre økte STAT5 DNA-bindende aktivitet etter IL-2 behandling korrelert godt med den observerte to gangers økning i mRNA nivåer (tabell 1).
chip analyser utført med STAT5 antistoffer eller kontrollsera (IgG) ble gjennomført ut i hvilende (-) eller IL-2-stimulerte (30 min) + hPBMCs isolert fra tre uavhengige givere for å måle anrikningen av PDE4B antatte STAT5 regulert område (A) eller den IL2RA enhancer PRR III (B) identifisert ved chip- on-chip. Innganger representerer 1% av kromatin brukes i chip analyser og feilfelt representerer standardavvik. * Representerer statistisk signifikante forskjeller (p 0,05)
Short Term IL-2 behandling (3 h) induserer PDE4B Protein Expression i PHA-aktiverte humane PBMC og CD8 + men ikke CD4 + celler
For ytterligere å validere at PDE4B reguleres av IL-2, vi også undersøkt proteinforandringer nivå i naive (N), PHA-aktiverte (A), hvilende (Sp) og IL-2 stimulerte humane PBMC 3 h (+) i to uavhengige donorer (Figur 6A). Nivået på PDE4B protein økt 2 ganger (figur S4, densitometry analyse), som korrelerer med ~1.7 gangers økning i DNA-bindende aktivitet av STAT5 og 2 ganger økning i mRNA nivåer (figur 5A og tabell 1, henholdsvis) . Primære humane CD4 + eller CD8 + T-celler ble også testet (figur 6B). YT NK-lignende celler tjente som positiv kontroll og ß-aktin som en lasting kontroll. Både PHA-aktivering (72 h) og kort sikt IL-2 induserte behandlingen PDE4B protein ekspresjon i PBMC og CD8 +, men ikke CD4 + T-celler. Basert på disse dataene er det interessant å spekulere i at PDE4B kan være den første «forsvarslinje» i PBMC og CD8 + T-celler mot forhøyede cAMP signalering som oppstår med T-celle stimulering [36]. Det er kjent at en annen type 4 isoform, blir PDE4D også uttrykt i CD4 + T-celler [35], som leder oss til å spekulere en mulig modell hvor det er konstant tempering av cAMP indusert veier i forhold til CD8 + -celler. En annen mulighet kan være at den forsinkede oppregulering av PDE4B i CD4 + celler er å ned-regulere cAMP i disse cellene ved en fjerntliggende tidspunkt. Testing av CD4 + vs CD8 + celler ble utført fra en enkelt donor, og vi mener gir nye muligheter for å undersøke hvilken rolle PDE4B i disse typer T-celle undergrupper.
Normale menneskelige PBMC fra tre uavhengige donorer (som vises er to representative resultater) var igjen un-aktivert (N, naiv) eller ble aktivert med PHA (A, Q, +) deretter gjort hvil etter 72 timer PHA aktiverings av CO
2 stripping som beskrevet i Materialer og metoder (Q ), deretter stimulert med IL-2 i 3 timer (+). Celler ble høstet og deretter Western blottet med antistoffer mot PDE4B eller ß-aktin som indikert til høyre. Molekylvektmarkører er vist til venstre. I det nedre panel umiddelbart etter PBMC isolert CD4 + (sporene fi) eller CD8 + (sporene være) celler ble negativt valgt som beskrevet i avsnittet Materialer og metoder delen ved å bruke magnetiske kuler, og deretter aktivert med PHA, gjort passiv, stimulert med IL-2 og Western blottet for PDE4B og ß-aktin som beskrevet ovenfor. YT celler tjente som positive kontroller for PDE4B uttrykk. (C) PDE4B er uttrykt i CD4 + lymfoide tumorcellelinjer. Kit225, H9, Molt3, MT2, Hut102 CD4 + og YT NK-lignende lymfoide cellelinjer ble lysert og like mengder protein Western blottet for PDE4B og ß-aktin som beskrevet for Figur 6A. Representative data fra to uavhengige eksperimenter er presentert.
PDE4B er uttrykt i CD4 + Lymfoide tumorcellelinjer
Siden PDE4B ble funnet unormalt uttrykt i diffuse store B-celle lymfom prøver [35] kom spørsmålet hva som kan være status PDE4B uttrykk i ulike CD4 + og andre lymfoide kreftcellelinjer. Derfor ble et sett av humane CD4 + lymfoide tumorcellelinjer og en NK-lignende cellelinje YT, undersøkt ved hjelp av Western blotting som viste høy grad uttrykt PDE4B protein som er tilstede i disse celler (figur 6C). STAT5 signalveien er relevant for flere av disse cellelinjer: human MT2 og Hut102 og vise hyperaktiv STAT5 pathway [37], mens YT og Kit225 celler gjennomgår apoptose når STAT5 er oppbrukt [11], [38]. Forbløffende nok PDE4B ble funnet over-uttrykt i brøkdel av diffuse store B-celle lymfom prøver som var refraktære til kjemoterapi [39]. Det ville derfor være interessant å undersøke celle skjebne hvis PDE4B kan være effektivt tømt og om død kan føre til.
Til sammen er det plausibelt å postulere at overekspresjon av PDE4B kan være et resultat av unormal genomisk DNA binding av STAT5 som senere vil kunne bidra til den tumorgene fenotypen til disse cellelinjene. Testing av denne hypotesen krever videre undersøkelser.
Konklusjoner
I konklusjonen, bruk en systematisk tilnærming som kombinert fastsettelsen av IL-2 indusert STAT5 cistrome og analyse av genuttrykk i en human leukemi cellemodell ; og med oppfølging genet ontologi samt medium gjennomstrømming transkripsjon uttrykk validering i primære humane PBMC har vi identifisert 19 nye STAT5 målgener, noen med funksjoner ennå-å-være bestemt og noen med relevans til immunceller. Vi har også validert en ny kandidat målgen, PDE4B på proteinnivået i PBMC og fant det over-uttrykt i CD4 + lymfoide tumorlinjer. Disse data tyder også på at tumorceller av lymfoid opprinnelse kan ha skråstilte genomiske STAT5 bindingsseter og følgelig målgener sammenlignet med normale lymfoide celler (som foreslått ved sammenligning av våre data med allerede eksisterende data i litteraturen ved Liao og medarbeidere [16] ); derfor å finne konkrete mål å utrydde dem kan kreve genom-wide kartlegging av større sett av primærtumorprøver av samme opprinnelse. Enten lymfoide celler med en overaktiv STAT5 sti kan være følsomme for PDE4B hemmere og en mekanisme for å kontrollere visse svulster vil være gjenstand for fremtidige studier.
Materialer og metoder
Cell Culture and Treatment
human lymfom-cellelinje YT [40], CD4 + humane T-cellelinjer Hut-102 [41] og MT-2 [42], thymus-avledede CD4 + T-lymfocytt-cellelinje Molt-3 [43], CD4 + T-cellelinje H9 [44] og humant CD4 + IL-2-avhengige leukemicellelinje Kit225 [45] (vennligst tilveiebrakt av Dr. J. Johnston, Queens University, UK) ble dyrket som beskrevet [4], [38]. IL-2 ble innhentet fra NCI Preklinisk Repository. Humane perifere mononukleære blodceller (PBMC) ble isolert, aktivert med PHA og opprettholdt som beskrevet [46]. CD4 + eller CD8 + T-celler ble isolert ved negativ seleksjon ved hjelp Dynabeads Urørt ™ menneskelige CD4 T-celler (kat. Nr. 113.46D) eller menneskelig CD8 T-celler (kat. Nr. 113.48D) kits, henholdsvis.
Chromatin Immunpresipitasjon
Chromatin immunoutfellinger ble utført fra ca 5 × 10
7 Kit225 celler som beskrevet [4] med anti-STAT5A /B-antistoffer (miksing sc-1081 og sc-835 (C-terminal STAT5A og STAT5B antistoffer, henholdsvis)) eller normalt kaninserum (kontroll IgG) i 3 timer ved 4 ° C. For å bekrefte at analysene var vellykket, PCR forsterkning av den kjente STAT5 bindingssetet ligger 5 «for det menneskelige IL2RA genet innenfor Positive Regulatory Region III [23] (Forward: 5′-ACG TCT AGA AAG AAA GTG GTC-3′ Reverse : 5»-CTG TCC CTG GAT GAA CCT AGT-3 «) ble utført ved bruk av kvantitativ sanntid PCR. [4] Verdier av transkripter i ukjente prøver ble oppnådd ved å interpolere Ct (PCR-sykluser til terskelverdier) på en standardkurve. Standardkurver ble fremstilt fra kjente mengder av renset PCR-amplifisert DNA. ChIP qPCR primer analyser for PDE4B ChIP validering ble bestilt fra SABiosciences, et Qiagen selskap (Cat # GPH900044 (-) 01A), ved å gi kromosom stillinger for 250 bp rundt den antatte GAS nettstedet (chr1:66569949-66570198, hg18). PCR-reaksjonene ble utført ved bruk av 2 x SYBR grønn Mastermix fra BioRad og en BioRad iQ5 termo i triplikater. Vilkårlige enheter definert som «DNA-bindende, (Db)» ble oppnådd ved 2∧ (-averageCt) og standardavvik som SD ≈ ln (2) * stdav (averageCt) * Db.
Tilfeldig Forsterkning av Kromatin immunopresipitert DNA
For å generere biblioteker fra ChIP-ed DNA, ble tilfeldig forsterkning utført som beskrevet i https://research.stowers-institute.org/gertonlab/protocols/RandomPCRamplification.pdf av DeRisi lab ved UC San Fransisco. Kort sagt ble chip ed DNA-prøver forsterket med en modifisert versjon av en tilfeldig PCR-protokollen [47]. DNA ble annilert til primer A (5′-GTTTCCCAGTAGGTCTCNNNNNNNN), og andre-tråd DNA-syntese ble utført med Sequenase (US Biochemical). Dette materiale ble deretter anvendt som templat for 35 sykluser med PCR med primer B (5′-GTTTCCCAGTAGGTCTC) ved hjelp av følgende profil: 30 s ved 94 ° C, 30 s ved 40 ° C, 30 s ved 50 ° C, 60 s ved 72 ° C og en dNTP-miks inneholdende dUTP. Produktene ble renset med QIAGEN PCR rensing kit, kvantifisert og kjørt på en 1% agarosegel for å undersøke for fragmentstørrelse, og deretter testet for anrikning av den positive regulatoriske område III, som beskrevet ovenfor.
In silico
Analyse
chip-on-chip resultatene ble analysert med MAT (Modellbasert basert~~POS=HEADCOMP analyse av teglstein array, [24] https://liulab.dfci.harvard.edu/MAT/) av Liu Lab i Avdeling for biostatistikk og Computational Biology ved Dana-Farber Cancer Institute, Harvard School of Public Health. Proksimale genet kartlegging av genomiske sekvenser på opptil 300 kb ble utført ved hjelp av Cis-Regulatory Element Kommentar System (CEAS https://liulab.dfci.harvard.edu/CEAS/). Resultatene ble visualisert ved den IGV. Konverteringen av genom koordinater og genomet merknads filer av forskjellige versjoner av det menneskelige genom forsamlinger ble utført ved hjelp av UCSC Genome Liftover verktøy til https://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgLiftOver.
RNA Isolation og cDNA Synthesis
Total RNA ble isolert ved anvendelse av RNeasy-sett (QIAGEN). cDNA ble syntetisert med BioRad sin iScript cDNA Synthesis Kit i henhold til produsentens instruksjoner.
Microarray analyse
Gene Expression analyse ved hjelp av Affymetrix Human Genome U133 Plus 2,0 mikromatriser ble utført ved microarray kjernen Facility, Baylor College of Medicine, Houston, TX. Statistisk analyse ble utført med GeneSpring GX ved Universitetet i Debrecen. Affymetrix Genechip Menneskelig Arrangøren 1.0R arrays avhøre regioner proksimale til transkripsjonsstartsider og inneholder prober for cirka 59 prosent av CpG øyer. Disse arrays inneholde 4,6 millioner prober flislagt gjennom over 25 500 mennesker promoter regioner til en gjennomsnittlig oppløsning på 35 bp.
