Abstract
sfingosin-1-fosfat (S1P) transporter Spns2 regulerer hjerteinfarkt forløper migrasjon i sebrafisk og lymfocytt menneskehandel i mus. Imidlertid har sin funksjon i kreft ikke blitt undersøkt. Vi viser her at ektopisk Spns2 uttrykk indusert apoptose og dens knockdown forbedret celle migrasjon i ikke-småcellet lungekreft (NSCLC) celler. Metabolsk, Spns2 uttrykk økt ekstracellulære S1P nivå mens knockdown den intracellulære. Farmakologisk hemming av S1P syntese avskaffet utvidet cellemigrasjon formidlet av Spns2 knockdown, noe som indikerer at intracellulær S1P spiller en nøkkelrolle i denne prosessen. Celle signaliserer studier indikerte at Spns2 uttrykk svekket GSK-3β og Stat3 mediert pro-overlevelse veier. Omvendt, ble disse banene aktivert ved Spns2 knockdown, noe som forklarer den økte cellemigrering siden de er også avgjørende for migrering. Endringer i Spns2 ble funnet å påvirke flere enzymer involvert i S1P metabolisme, inkludert sfingosin kinaser, S1P fosfataser og S1P lyase 1. Genetisk ble Spns2 mRNA nivå seg å bli redusert i avansert lungekreft (LC) pasienter som kvantifiseres ved hjelp av en liten skalere qPCR array. Disse dataene viser for første gang at Spns2 spiller viktige roller i å regulere cellulære funksjoner i NSCLC celler, og at nedregulering er en potensiell risikofaktor for LC
Citation. Bradley E, Dasgupta S, Jiang X, Zhao X, Zhu G, Han Q, et al. (2014) Kritisk rolle Spns2, en Sphingosine-1-fosfat Transporter, i Lung Cancer Cell Survival og migrasjon. PLoS ONE 9 (10): e110119. doi: 10,1371 /journal.pone.0110119
Redaktør: Junming Yue, The University of Tennessee Health Science Center, USA
mottatt: 17 juni 2014; Godkjent: 08.09.2014; Publisert: 20 oktober 2014
Copyright: © 2014 Bradley et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet:. Den forfatterne bekrefter at alle data som underbygger funnene er fullt tilgjengelig uten restriksjoner. Alle relevante data er i kroppen og saksdokumenter filer av papir
Finansiering:. Dette prosjektet er støttet av en egenutført stipend fra Georgia Regents University og en SDG utmerkelse fra American Heart Association (GW). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Lungekreft (LC) er den ledende årsak til kreft dødsfall i USA og på verdensbasis [1], [2]. I 2012 er det mer enn 220.000 nye tilfeller og mer enn 160.000 dødsfall i USA alene [1], [3], [4]. LC er en bemerkelsesverdig heterogen sykdom. De to hovedformer er ikke-småcellet LC (NSCLC) og småcellet LC, blant NSCLC er den vanligste formen som står for ca 85% av nydiagnostiserte tilfeller [1], [4].
genetiske avvik har knyttet flere gener og signalveier til NSCLC, inkludert epidermal vekstfaktor reseptor (EGFR) familie, signal svinger og aktivator av transkripsjon 3 (Stat3), og phosphoinositide 3-kinase
–
Akt-mTOR trasé [ ,,,0],1], [2], [4]. Disse oppdagelsene har ført til entydig målrettede terapier med spesifikk inhibitor medikamenter slik som erlotinib og gefitinib for mutasjoner i EGFR [5] eller crizotinib for genet trans resulterer i EML4-ALK-onkogenet [6]. Epigenetiske variasjoner er også knyttet til NSCLC [7], [8]. Selv om sin diagnose og behandling er i rask utvikling, meningsfulle forbedringer i resultatene for de fleste NSCLC pasienter er fortsatt unnvikende [1], [3]. Mange pasienter tilbakefall og danner mer aggressive metastatiske svulster [9]. Dermed en dypere forståelse av opprinnelsen og de molekylære mekanismer for metastasering av sykdommen er stort behov for å bedre forebygging og behandling.
Sphingosine 1-fosfat (S1P) er en potent bioaktivt signalmolekyl som spiller viktige roller i forskjellige fysiologiske og patologiske prosesser slik som immunitet og kreft [10], [11], [12], [13]. Det fremmer kreft ved å regulere celleproliferasjon /overlevelse, migrasjon, angiogenese, og lymphangiogenesis [10], [14], [15]. En av de enzymer som genererer S1P, sfingosin kinase 1 (SphK1) (Fig. 1A), regnes som en onkogen enzym, hvis aktivitet kan bli stimulert av et bredt spekter av agonister, f.eks hormoner og vekstfaktorer [16], [17]. Omvendt, enzymet som forringer S1P, S1P lyase 1 (SGPL1) (Fig. 1A), er nedregulert i prostatakreft [17]. Stanse av SGPL1 forbedrer celle overlevelse; og håndheves SGPL1 uttrykk sensitizes celle til bestråling eller kjemoterapi [17]. I tillegg er mange aspekter av S1P signalveier nært beslektet med tumorgenese (Fig. 1A) [10], [18]. Ekstracellulær S1P utøver mesteparten av sin funksjon gjennom fem celleoverflate-G-protein-koblede reseptorer S1P1-S1P5 [10]. Det stimulerer forskjellige signaloverføringsveier i ulike celletyper, så vel som innenfor den samme celle, avhengig av reseptorer uttrykt. For eksempel er S1P1 utelukkende koplet
via
Gi-proteinet for å aktivere Ras, mitogen aktivert proteinkinase (MAPK), PI3K /Akt, og fosfolipase C-reaksjonsveier [10], [19]. Den intracellulære S1P, på den annen side fremmer progresjon av kreft i et reseptor-uavhengig måte, [11], [12], enten ved å mediere kalsium-frigjøring fra endoplasmatisk retikulum, eller ved å interagere med sine intracellulære mål, slik som HDAC og TNF reseptor- assosiert faktor 2 (TRAF2) [20]. Enda viktigere, har S1P høyde vært innblandet som en risikofaktor for LC i en epidemiologisk studie [21]
(A), Skjematisk fremstilling av S1P metabolisme og funksjon, SGPP, S1P fosfatase.; SphK, sfingosin kinase; SGPL, S1P lyase; Erter, phosphoethanolamine. (B), Western blot analyse av Spns2-EGFP ekspresjon detektert av et anti-GFP-antistoff. β-aktin (Actin) ble anvendt som en kontroll lasting. A549-celler ble transfektert med Spns2-EGFP og cellelysater samlet 48 timer senere. Molekylvekten av Spns2-GFP er omkring 84 kD (58 + 26; pil). (C), Spns2 uttrykk økt ekstracellulær nivå av S1P, sfingosin (Sph), og dihydrosphingosine (dhSph). Celler ble endret til media med delipidert FBS 24 timer etter transfeksjon. Ytterligere 24 timer senere ble mediene samlet opp og sentrifugert, og supernatanten ble analysert ved lipidomics. (D), bortfaller tidsbilder av Spns2 positive celler. A549-celler ble transfektert med Spns2-EGFP som i A. 12-16 timer senere ble cellene plassert i et miljøkammer som holder 37 ° C og 5% CO
2 og intervall bilder som tas ved tidspunkter indikert. Scale bar er 10 mikrometer. (E), Confocal laser skanne bilder av celler immuno-farget med aktiv (spaltet) caspase 3 (Casp3). A549 celler ble transient transfektert, fiksert og farget med et antistoff mot kløyvde Casp3. Scale bar er 20 mikrometer.
S1P genereres intracellulært ved SphKs og dens cellenivå opprettholdes av en finjustert balanse mellom produksjon, omforming, nedbrytning og eksport (Fig. 1a). S1P eksporteres ut av cellene ved transportørproteiner (Fig. 1A). Flere ATP-bindende kassett (ABC) familiemedlemmer, for eksempel ABCA1, ABCC1, og ABCG1 er blitt foreslått å transportere S1P basert på observasjoner som deres knockdown eller farmakologisk hemning reduksjon S1P meldingen [22], [23], [24], [ ,,,0],25], [26]. Imidlertid fortsatt dette begrepet omstridt siden S1P utførselen ikke endres når disse proteinene er eksogent uttrykt i celler eller slått ut i mus [18], [27], [28]. Nylig, ugift kvinne homolog 2 (Spns2), et medlem av den store tilrettelegger super av ikke-ATP-avhengige transportører, har vist seg å transportere S1P både
in vitro Hotell og
in vivo product: [27 ], [29], [30], [31], [32], [33], [34]. Mer interessant, selv om redusert i plasma, er S1P nivåene økt i noen vev, inkludert lungene i Spns2 mangelfull mus [33], som er i samsvar med en tidligere rapport som viser at Spns2 uttrykkes mest rikelig i den menneskelige lunge [18].
Disse tidligere funn bedt oss til hypoteser som Spns2 er involvert i LC utvikling. Vi har utført gain-of-funksjon og tap-av-funksjon eksperimenter i NSCLC celler. Vi har også oppdaget Spns2 uttrykk nivå i LC pasientprøver.
Materialer og metoder
Material
Antistoffer mot fosfor-GSK-3β (Tjen 9), GSK-3β, fosfor-Stat3, Stat3, kløyvde caspase 3, og survivin var fra cellesignalisering Technologies (Danvers, MA). Antistoffer mot AIF og β-aktin var fra Santa Cruz Bioteknologi (Santa Cruz, California). Antistoffet mot LC3B var fra Abcam (Cambridge, MA). Antistoff mot SphK2 var fra Exalpha Biologicals (Dublin, Ohio). Den fluorescerende merking av hemmere av caspases (FLICA) kit var fra Immunokjemisk Technologies (Bloomington, MN). SphK inhibitor Ski-en var fra Biovision (Milpitas, CA). Den pan kaspaseinhibitor Z-VAD var fra Promega (Madison, WI). Den PI3K inhibitor LY294002 var fra Cayman (Ann Arbor, MI). Og Jak inhibitor Jaki var fra Millipore (Billerica, MA). Menneske LC sanntid PCR arrays var fra Origene (Rockville, MD).
Metoder
Plasmid kloning.
Menneskelig SPNS2 ble PCR amplifisert fra en BAC bruke primere hSpns2forward: AAG CTT ATG TGC CTG GAA TGC GCC TCG, og hSPns2reverse: GGT ACC AA GAC TTT CAC AGA TGC GGG CGG; og ble subklonet inn i pGEM Teasy vektor (Promega, Madison, WI). Fragmentet ble spaltet ved hjelp av enzymer Hindlll og Kpnl og klonet inn pEGFP-N1 vektor (Clontech, Mountain View, CA), noe som resulterer i pSPNS2-EGFP konstruere. For HA tagget Spns2, ble primere som inneholder HA tag utformet. PCR-produktet ble klonet inn pcDNA3.1 (Livet Tech., Carlsbad, CA, USA) ligner pSPNS2-EGFP.
Cellekultur og behandling.
Den menneskelige NSCLC cellelinjer A549 og H1299 (ATCC, Manassas, Virginia) var generøse gaver fra Dr. Zhonglin Hao, Cancer Center, Georgia Regents University. Den primære humane brachialis epitelceller (HBEpC) var fra ATCC (Manassas, Virginia). A549 celler og H1299-celler ble opprettholdt i Dulbeccos modifiserte Eagles medium (Cellgro, Herndon, VA, USA) som inneholdt 10% FBS (Hyclone, Thermo Fisher Scientific, Austin, TX), og Pen /Strep (Liv Tech.). HBEpC ble opprettholdt i henhold til produsentens anvisninger. Transfeksjon av Spns2 siRNAs ble utført av enten Lipofectamine 2000 i henhold til produsentens instruksjoner (Livet Tech.) Eller electroporated ved hjelp av en Nucleofactor (Lonza, Allendale, NJ).
Live celle tid lapse bildebehandling, immunocytokjemi, og konfokal laser mikroskopi.
live celle bildebehandling ble utført etter tidligere publiserte prosedyrer [35], [36], [37], [38]. I korthet ble cellene transfektert med Spns2-GFP. Seksten timer senere ble kulturen satt i en levende celle bildebehandling kammer og fasekontrastmikroskopi tatt hver 30-60 minutter med en Nikon Eclipse TE300 (Nikon Instruments, Inc., Melville, NY, USA. For immunocytokjemi og laser konfokalmikroskopi, den faste celler ble immunostained med antistoffer som er oppført og bilder tatt med en Zeiss LSM510 konfokal laser scanning mikroskop utstyrt med en to foton argon laser på 488 nm (Cy2), 543 nm (Cy3), og 633 nm (Cy5, Alexa Fluor 647), henholdsvis . LSM 510 Meta 3.2 programmet ble brukt for bildeopptak. Adobe Photoshop CS4 ble brukt for bakgrunnsreduksjon og redigering. Bilder hentet med sekundært antistoff bare ble brukt som negative kontroller representerer bakgrunnen intensiteten i en bestemt laser kanal. Antigen-spesifikk farging ble kvantifisert ved å telle celler som viste signaler todelt eller mer over bakgrunnsfluorescens.
RNA ekstraksjon, RT-PCR og qPCR.
RNA ble ekstrahert med TRIzol reagens (Invitrogen). Første kjede-cDNA ble generert av iScript cDNA syntese kit (BioRad, Hercules, CA, USA). Sanntid qPCR ble utført med SYBR grønn /Rox qPCR Master Mix på en PTC-200 Gradient Cycler utstyrt med en chromo fire sammenhengende fluorescerende detektor (BioRad). De primere for qPCR var: menneskelig hSpns2 frem: TTA CTG GCT CCA GCG TGA, hSpns2 omvendt: TGA TCA TGC CCA GGA CAG; hPOLR2A fremover: GGGTGGCATCAAATACCCAGA; hPOLR2A omvendt: AGACAC AGCGCAAAACTTTCA; hSphK1 frem: GGC TGC TGT CAC CCA TGA A, hSphK1reverse: TCA CTC TCT AGG TCC ACA TCA G; hSphK2 frem: AGC GTG GTA GCC ACT TCA G, hSphK2 omvendt: GAG CAG TGT ACC GAT GCC A; hSGPP1 frem: ATC ATC ATC GGG CTT CAT TTA GC, hSGPP1reverse: GTG CTC CAG GTG TCA AGA GT; hSGPP2 fremover, TCA C CG CAC TCC TCA TCG T, hSGPP2 omvendt: CCG GGT TGG GCT GTA GTA ATC; hSGPL1 frem: CCT AGC ACA GAC CTT CTG ATG T, hSGPL1 omvendt: ACT CCA TGC AAT Tags CTG CCA; hABCA1 frem: TTA AAC GCC CTC ACC AAA GAC, hABCA1reverse: AAA AGC CGC CAT ACC TAA ACT; hABCC1 frem: TTA CTC ATT CAG CTC GTC TTG TC, hABCC1reverse: CAG GGA TTA GGG TCG TGG AT; hABCG1 frem: ACT GCA GCA TCG TGT ACT GGA, hABCG1reverse: CGT CTC GTC GAT GTC ACA GTG; hABCG2 frem: TGA GCC TAC AAC TGG CTT AGA, hABCG2 omvendt. CCC TGC TTA GAC ATC CTT TTC AG:
Cell levedyktighet og celledød analyser
spredning og apoptose ble utført med A549. og H1299-celler transfektert med hSPNS2-EGFP eller HA-Spns2 som tidligere beskrevet [39], [40], [41]. Antall levende celler ble målt med en mikroplateleser ved bruk av celletellingsleder-8 (CCK8) (Dojindo Molecular Technologies, Inc., som er basert på den dehydrogenase-aktivitet i levedyktige celler). I korte trekk ble det CCK8 oppløsningen tilsatt til den behandlede cellekulturer, inkubert i 2-4 timer, og deres absorpsjon ved bølgelengde 450 nm lest av en mikroplateleser. Absorpsjonen ved 450 nm ble korrelert til den levende celle nummer til stede i brønnen. Den FLICA Analysen ble utført med Spns2-EGFP plasmid-transfektert A549 celler ved hjelp av Sulforhodamine-merket fluormetyl keton peptid inhibitor (rød) i henhold til produsentens instruksjoner. I korthet, 48 timer etter transfeksjon med de Spns2-EGFP plasmider, ble FLICA reagens tilsettes til mediet, og cellene ble inkubert i 1 time ved 37 ° C under 5% CO
2. Cellene ble vasket en gang med vaskeløsning og deretter fiksert med 4%
p
formaldehyd-i fosfatbufret saltvann for videre analyse ved mikroskopi.
Strømningscytometri-analyse.
Spns2 -GFP transfektert A549 celler ble samlet, med fast med 4% paraformaldehyde, og immun-merket med caspase 3 antistoff etterfulgt av Alexa Fluor 555 sekundært antistoff. De merkede cellene ble analysert ved et Becton Dickinson FACSCalibur fire-farge analysatorer utstyrt med 4 lasere (BD Biosciences, San Jose, California).
Cell migrasjon analyser.
Cell migrasjon ble målt ved såret healing analyser som tidligere publisert [42]. I korthet ble cellene transfektert med Spns2 sirnas eller kryptert kontroll av lipofektamin 2000. Celler ble dyrket i 72 timer etter hvilken tid de var blitt sammenflytende. Et gap på omtrent 400 um ble generert av en pipettespiss. Bredden av gapet ble målt ved ulike tidspunkt. For Ski-I behandling, 10 mm Ski-jeg ble supplert 24 timer etter siRNA transfeksjon. Cellene ble dyrket i ytterligere 48 timer og deretter analysen utføres.
sphingolipid og S1P måling.
Celler transfektert med Spns2 eller Spns2 siRNA ble dyrket i 48 timer og deretter begge celle pellets og media ble samlet . Cellepelletene ble vasket tre ganger med kald PBS. Kulturmedier ble sentrifugert i 10 minutter ved 4 ° C for å fjerne flytende celler og celleavfall. S1P nivåer i celler og kulturmedier ble målt ved lipidomics kjernen i Medical University of South Carolina (under oppsyn av Dr. Jacek Bielawski) ifølge publiserte protokoller på et ThermoFisher TSQ Quantum trippel kvadrupol massespektrometer, som opererer i en Multiple Reaction Monitoring (MRM) positiv ionisering modus med modifisert versjon [43]. Kort, celle pellets eller media som tilsvarer omtrent 2-3 × 10
6 celler, ble forsterket med de interne standarder (ISS: C
17 basis D-erythro-sphingosine (17CSph), C
17 sfingosin -1-fosfat (17CSph-1P), N-palmitoyl-D-erythro-C
13 sfingosin (13C16-Cer) og heptadecanoyl-D-erytro-sfingosin (C17-Cer)), og ekstrahert med etylacetat /iso-propanol /vann (60/30/10 v /v) løsningsmiddelsystem. Etter fordampning og rekonstituering i 100 ul metanol-prøvene ble injisert på HP1100 /TSQ Quantum LC /MS system og gradient eluert fra BDS Hypersil C8, 150 x 3,2 mm, 3 um partikkelstørrelse kolonne, med 1,0 mM metanolisk ammoniumformiat /2 mM vandig ammoniumformiat mobil fase system. Topper som svarer til de målanalytter og interne standarder ble oppsamlet og behandlet ved hjelp av Xcalibur programvaresystem. Kvantitativ analyse var basert på kalibreringskurver generert ved å tilsette en kunstig grunnmasse med de kjente mengder av målanalytten syntetiske standarder og en lik mengde av de interne standarder (ISS). Målanalytten /IS topparealene forhold ble plottet mot konsentrasjonen av analytt. Målanalytten /IS topparealforhold fra prøvene var tilsvarende normalisert til sine respektive iss og sammenlignet med kalibreringskurvene, ved hjelp av en lineær regresjonsmodell. Andre sphingolipids, som ceramider og sfingosin, ble også analysert.
Statistikk.
Verktøy og standardavvik ble beregnet av Microsoft Excel. Den statistiske signifikans ble beregnet ved hjelp av en vei ANOVA og Tukey sin post hoc test eller gjentatt tiltak ANOVA med GraphPad Prism. P 0,05 regnes som betydelig
Resultater
Ektopisk Spns2 uttrykk induserer celledød i NSCLC celler
For å studere Spns2 funksjon i LC, brukte vi NSCLC celler.. Vi først forsøkte å etablere en Spns2-EGFP stabil-uttrykkende cellelinje A549, men ingen slik linje ble erholdt (data ikke vist). Dermed har vi fokusert på forbigående uttrykk for Spns2. Western blot-analyse ved anvendelse av et anti-GFP-antistoff indikerte at Spns2 ble uttrykt som en ~84 kD-fusjonsprotein (58 kD + 26 kD, pil, figur 1B.). For å sikre at ektopisk uttrykt Spns2 var funksjonelle, målte vi om det transporteres S1P. Lipidomics data viste at S1P nivået i kulturmediet ble økt med 5,6 ± 0,55 ganger (fig. 1C), i samsvar med tidligere rapporter [29], [31], [32], [33], [34] og bekrefter at transfektert Spns2 var fullt funksjonell. Interessant, ekstracellulære nivåer av sfingosin (Sph) og dihydrosphingosine (dhsph) ble også økt med 1,5 og 2,8 ganger i henholdsvis (figur 1C.), Noe som tyder på at Spns2 kan transportere disse to sphingolipids også. Ulike arter av ceramid ble analysert, men ingen viste en signifikant forskjell sammenlignet med kontroll (Fig. S1 A).
Neste vi undersøkt de cellulære funksjoner av Spns2 i A549 celler. Live-cell imaging viste at Spns2 celler gikk gjennom dramatiske morfologiske endringer og løsrevet fra cellekultur retter (piler i Fig. 1D), noe som tyder på apoptotisk celledød. Således vi immuno-merkede celler med et antistoff påvisning av aktivert (spaltet) kaspase 3 (Casp3) (fig. 1E). Dobbel-blindet kvantitativ analyse viser at 34,2 ± 9% av Spns2 positive celler ble Casp3 positive (fig. 1E og 2A). Denne induksjon av Casp3 ble bekreftet ved Western blot-analyse og flow-cytometri; og blokkert av en pan caspase inhibitor Z-VAD (fig. 2B, S1B, og S1C). Induksjon av Casp3 ble reprodusert ved ekspresjon av HA-Spns2 som har en mindre tag (ikke vist). I tråd med Casp 3 aktivering ble den anti-apoptose-genet Survivin betydelig redusert (fig. 2B) [36], [44]. Apoptose Induksjon faktor (AIF) og spaltet LC3B ble også målt, men ingen ble økt med Spns2 uttrykk (Fig. 2B), noe som tyder på at Spns2 ikke induserer caspase-uavhengige apoptose eller autofagi.
(A), Kvantifisering av Casp3 positive celler som er vist i D. Vehicle (pEGFP) transfekterte celler ble anvendt som kontroll (Con). N 100 celler telles fra tre separate eksperimenter. (B), Western blot analyser for celledød markører. A549-celler ble transient transfektert som i A. Cellelysater ble samlet og blottet med antistoffer indikert. Vehicle (pEGFP) transfekterte celler ble anvendt som en negativ kontroll og Aktin ble anvendt som en kontroll lasting. (C), Representative bilder av FLICA farging av Spns2 positive celler. Levende A549 celler ble inkubert med FLICA i 1 time 48 timer etter transfeksjon. Celler ble fikset og mikrofotografering tatt. Scale bar er 10 mikrometer. (D), Kvantifisering av FLICA-positive celler som er vist i C. N ble 100 celler fra tre separate forsøk talt dobbelt blindt. (E), Spns2 ekspresjon redusert levedyktig celleantall i A549-celler. -Celler ble transfektert som i A. 48 timer senere ble den relative levende celletallet målt ved hjelp av en CCK-8 kit ved anvendelse av en mikroplateleser. N = 4. (F), Spns2 uttrykk redusert celle nummer i H1299 celler. Lev H1299 celle nummer ble målt som i I. N = 4. I B, E, H, I, J, feilfelt representerer SD, *, p 0,05, **, p 0,01
for ytterligere å validere at Spns2 indusert apoptose, utførte vi FLICA (fluorescerende merket hemmer av pan caspases) analyser på levende celler. Figur 2C viser typiske mikrofotografering av analysen. Dobbeltblind kvantifisering viste at 70 ± 15,9% av Spns2 positive celler var FLICA positive (Fig. 2D).
En sluttresultatet av celledød er reduksjon i total levedyktig celle nummer. Objektive celle telling ved anvendelse av en mikroplateleser (CCK-8) indikerte at Spns2 ekspresjon resulterte i 59 ± 1,2% reduksjon av levedyktige A549-celler i 48 timer (fig. 2E). Disse resultatene ble reprodusert i et annet NSCLC cellelinje H1299 (fig. 2F).
Tatt sammen de ovenfor angitte data viser at ektopisk Spns2 ekspresjon induserer caspase-avhengig apoptose i NSCLC-celler.
Spns2 uttrykk modulerer S1P metabolisme
Vi viste at Spns2 uttrykk transportert S1P utenfor cellene (fig. 1C). Interessant, cellulære nivåer av S1P, sfingosin, og forskjellige ceramid arter ble ikke signifikant endret ved Spns2 ekspresjon, bortsett fra dhSph og langkjedede ceramid C20:1were økte med ca. 2,0 og 1,4 ganger, henholdsvis (fig. 3A og ikke vist).
(A), gjorde Spns2 uttrykk ikke endre den intracellulære nivået av S1P. A549-celler ble endret til media med delipidert FBS 24 timer etter transfeksjon. Ytterligere 24 timer senere ble cellene samlet opp, vasket og lipid nivåer analysert ved lipidomics. (B), Spns2 uttrykk førte til en akutt økning av SphK1 i A549-celler. Celler ble transfektert, mRNA oppsamlet, og sanntids QRT-PCR utført for å måle SphK1. (C), Spns2 uttrykk førte til en akutt økning av SphK2. A549-celler ble behandlet som beskrevet i B, bortsett fra at QRT-PCR utført for å måle SphK2. (D), Spns2 uttrykk førte til reduksjon av SGPP1 i A549-celler. Celler ble behandlet som beskrevet i B, bortsett fra at QRT-PCR utført for å måle SGPP1. (E), Spns2 ekspresjon redusert S1P reseptorer. Celler ble behandlet som beskrevet i B, bortsett fra at QRT-PCR utført for å måle S1P1, S1P2, og S1P3. N = 3. Feilfelt representerer SD. *, P 0,05, **, p 0,01. Data ble normalisert til GAPDH.
For å avgrense sin underliggende metabolske mekanisme, vi analyserte de viktigste enzymer i sphingolipid metabolismen av sanntid kvantitativ PCR (qPCR). Både SphK1 og SphK2 mRNA ble betydelig forhøyet innen 24 timer Spns2 transfeksjon, og vendte tilbake til normale nivåer etter 48 timer (fig. 3B og 3C). Økning av SphK2 ekspresjon ble bekreftet ved western blot-analyse, bortsett fra at dets proteinnivå holdt seg på et relativt høyt nivå, selv ved 48 timer etter transfeksjon Spns2 (fig. S1D). Dette er rimelig siden proteiner vanligvis tar lengre tid å bli dårligere enn mRNA. S1P fosfatase 1 (SGPP1), enzymet som dephosphorylates S1P, ble dramatisk redusert til 8,5% av kontrollnivået i løpet av 24 timer, og holdt lav inntil 48 timer etter transfeksjon (fig. 3D og S1E). SGPP2 og S1P lyase 1 (SGPL1) ble ikke signifikant påvirket av Spns2 uttrykk (fig. S1E-S1F). Disse data indikerer at cellene endrer uttrykket nivåer av flere nøkkelenzymer for å kompensere for S1P utførsel mediert av Spns2 uttrykket, inkludert øker generasjon (økning i SphKs) samt stansing konvertering (reduksjon i SGPP1).
Spns2 uttrykk fører til reduksjon av S1P-reseptorer og flere pro-overlevelse trasé
Som nevnt tidligere, er S1P generelt en pro-overlevelse faktor. For å forstå hvorfor Apoptose ble indusert når det ekstracellulære S1P ble øket etter Spns2 transfeksjon, vi har oppdaget nivåene av S1P reseptorer og funnet at mRNA-nivåene av reseptorer S1P1, S1P2, og S1P3 var alle signifikant nedregulert etter Spns2 ekspresjon (Fig. 3E ).
for ytterligere å bekrefte denne observasjonen vi bestemt cellesignalveier nedstrøms av disse S1P reseptorer. Spns2 uttrykk førte til drastiske reduksjoner i fosfo-GSK-3β (pGSK-3β, serin 9) i begge A549 og H1299-celler (fig. 4a og 4b). For å validere denne observasjonen, analysert vi GSK-3β oppstrøms aktivator Akt [35], [45]. Figurene 4A og 4B viste at pakt nivåene ble redusert med Spns2 ekspresjon, noe som indikerer at Spns2 svekker PI3K /Akt pathway. Jak /Stat3 vei, en annen signalveien nedstrøms S1P-reseptorer, spiller avgjørende roller i celle overlevelse, migrasjon, og immunrespons [46], [47]. Vi er fast bestemt om Spns2 påvirker denne veien ved å måle Stat3 aktivitet. Western blot-analyser viste at fosfo-Stat3 (pStat3) nivåer ble betydelig redusert ved Spns2 ekspresjon i begge cellelinjer (fig. 4A og 4B). Casp3 ble aktivert ved Spns2 på H1299-celler som er i samsvar med dataene oppnådd fra A549-celler (Fig. 4B). Deretter vi immuno-merkede Spns2-EGFP transfekterte celler med antistoffer mot pGSK-3β og pStat3 og fant at deres fluorescens-signaler ble signifikant redusert i alle celler i den samme kultur, enten Spns2 positiv eller ikke, når sammenlignet med kontroll GFP transfekterte celler ( con) (fig. 4C og 4D). Dette er sannsynligvis på grunn av akkumulering av ekstracellulær sfingolipider, som for eksempel Sph. Mer interessant, det fluorescente signalet for pGSK-3β ble ytterligere redusert i Spns2-GFP-celler enn de ikke-transfekterte celler (piler i fig. 4C). Disse data bekrefter at disse pro-overlevelse trasé ble utsatt når Spns2 ble ectopically uttrykt.
(A), analyserer Western blot på A549 celleprøver. A549-celler ble transient transfektert og lysatene samlet 24 og 48 timer senere og blottet med antistoffer indikert. pGSK, fosfor-GSK-3β; tGSK, total GSK-3β; Pakt, fosfor-Akt; pStat3, fosfor-Stat3; tStat3, total Stat3; Aktin ble anvendt som en kontroll lasting. (B), Western blot analyser på H1299 celleprøver. H1299 cellene ble transient transfektert som nevnt tidligere. Cellelysater ble samlet 48 timer senere og blottet med antistoffer indikert. (C), Confocal laserskannings bilder av celler farget for pGSK-3β. A549-celler ble transfektert med Spns2-GFP og dekkglass oppsamlet etter 48 timer. (D), Confocal laser skanne bilder av A549-celler farget for pStat3. Celler ble fremstilt som i C.
Spns2 knockdown øker intracellulær S1P nivå
De ovennevnte data viser at Spns2 regulerer S1P metabolismen og dens ektopisk uttrykk fører til apoptose i NSCLC celler. For ytterligere å dissekere Spns2 rolle i LC, vi slått ned Spns2 av siRNA. Figurene 5A og 5B viser at siRNA Spns2i-A betydelig redusert Spns2 mRNA nivå med mer enn 80%. Dermed har vi brukt Spns2i-A i våre videre studier. Egge RNA (SCR) og Spns2i-C (heretter SPC), som ikke undertrykke Spns2 uttrykk, ble brukt som negative kontroller.
(A), (B), Karakterisering av Spns2 siRNAs. 20 nM av Spns2 siRNA A, B og C ble transfektert individuelt i A549 celler. 48 timer senere total-RNA ble oppsamlet og RT-PCR (A) og QRT-PCR (B) utført for å måle Spns2. Egge RNA (SCR) ble anvendt som en negativ kontroll. (C), Spns2 knockdown av Spns2i-A betydelig økt intracellulær S1P nivå. A549-celler ble transfektert med Spns2 siRNA som i A, 24 timer etter transfeksjon, ble cellekulturmediet skiftet til media med delipidert FBS. Ytterligere 24 timer senere ble cellepelletene samlet og analysert ved hjelp av S1P lipidomics. N = 3. (D), Spns2 knockdown endrer nivået av SGPP1, SGPP2, og SGPL1. A549-celler ble behandlet som i A, bortsett fra QRT-PCR ble utført for å måle SGPP1, SGPP2, og SGPL1. N = 4. qPCR data ble normalisert til GAPDH.
For å karakterisere effekten av Spns2 knockdown på sphingolipid metabolisme hos NSCLC celler, vi fast bestemt på nivåene av sphingolipid og de av deres relaterte enzymer. Lipidomics data viser at Spns2 knockdown av Spns2i-A betydelig økt intracellulær S1P nivå, mens redusert Sph nivå, i A549 celler sammenlignet med Scr og SPC (fig. 5C og S2A). Nivåene av forskjellige ceramid arter ble ikke endret ved Spns2 knockdown (Fig. S2B). Dette stemmer overens med en tidligere rapport som S1P mangel hos mus fører til økt nivå av S1P i lungen [33]. For å analysere mekanismen for økt cellulær S1P, vi målte nivåene av store enzymer i S1P metabolisme. Figur 5D viser at nivåene av flere enzymer ble endret etter Spns2 knockdown av Spns2i-A: SGPP1 var signifikant økt med 8 ganger; SGPP2 ble redusert med ~ 50%; og SGPL1 ble redusert med mer enn 80%. Økning i SGPP1 vil akselerere S1P omdanning for å redusere celle S1P nivå, som vil bli motvirket ved reduksjon i SGPP2 og økning i SGPL1. Men SGPL1 var mye mer rikelig uttrykt enn SGPP1 i A549-celler (22 ganger høyere) (Fig. 5D). Dette forklarer hvorfor S1P ble økt etter Spns2 knockdown. Andre enzymer som SphKs, ble ikke signifikant påvirket av Spns2 knockdown (fig. S2C og S2D).
Spns2 knockdown forbedrer NSCLC celler migrasjon
Funksjonelt, vi først undersøkte Spns2 knockdown rolle på celle overlevelse /spredning siden ektopisk Spns2 uttrykk indusert apoptose. Levende celletellings analyser funnet at Spns2 knockdown med Spns2i-A ikke resulterte i en signifikant økning i antall levedyktige celler i hver A549 eller H1299 celler (ikke vist), noe som indikerer at Spns2 nedregulering ikke påvirker celleoverlevelse eller proliferasjon i NSCLC celler.
Vi deretter undersøkt hvilken rolle Spns2 knockdown på cellemigrasjon siden intracellulær S1P er avgjørende for lungecellemigrasjon og motilitet [48]. Sårtilheling skrape ble utført med både A549 celler og H1299 celler. Fire hundre mikrometer hull ble generert i løpende kulturer og mikrofotografering tatt på 8 og 24 timer etter riper. Figur 6A viser typiske bilder av analysen i A549-celler. Doble blindet kvantitative analyser viste at styre A549-celler (SCR) overført med en hastighet på 8,0 ± 1,5 um /h og 5,4 ± 0,8 um /h til 8 og 24 timers periode, henholdsvis (SPC-celler har en lignende resultat) (fig. 6B). Imidlertid Spns2 knockdown-celler overføres ved en hastighet på 14,9 ± 3,1 um /h og 10,0 ± 0,3 um /h i den samme tidsperiode, som representerer en 1,86 og 1,85 ganger økning, henholdsvis (fig. 6B). Denne observasjonen ble replikert på H1299-celler (Fig. 6C).
