Abstract
Bakgrunn
Samler bevis støtter konseptet at melanom er svært heterogen og opprettholdes av en liten undergruppe av melanom stilk-lignende celler. Disse celler anses som ansvarlig for tumor-resistens til terapi. Videre er melanomceller kjennetegnet ved deres høye fenotypisk plastisitet. Derfor må begge melanom stilk-lignende celler og deres mer differensiert avkom bli utryddet for å oppnå varig kur. Ved reevaluerer forbindelser i heterogene populasjoner melanom, kan det være mulig å velge forbindelser med aktivitet ikke bare mot hurtig-sykling celler, men også mot kreft stilk-lignende celler. Naturlige forbindelser var fokus for denne studien.
Metoder
Vi analyserte 120 forbindelser fra The Natural Products Set II for å identifisere forbindelser aktive mot melanom populasjoner dyrkes i en anker-uavhengig måte og beriket med celler utøve selvfornyende kapasitet. Cell levedyktighet, cellesyklus arrest, apoptose, genekspresjon, klonogene overlevelse og etikett-oppbevaring ble analysert.
Funn
Flere forbindelser effektivt utryddet celler med klonogene kapasitet og nanaomycin A, streptonigrin og toyocamycin var effektiv på 0,1 mikrometer. Andre anti-klonogene men ikke svært cytotoksiske forbindelser som bryostatin 1, siomycin A, Illudin M, michellamine B og pentoxifylline markert redusert hyppigheten av ABCB5 (ATP-bindende kassett, sub-familie B, medlem 5) -positive celler. Tvert imot, behandling med maytansine og kolkisin valgt for celler som uttrykker denne transporter. Maytansine, streptonigrin, toyocamycin og kolkisin, selv om svært cytotoksiske, forlot en liten undergruppe av sakte dele celler upåvirket. Forbindelser som er valgt i denne studien forskjellig forandret uttrykket av melanocyte /melanom bestemt mikroftalmi assosierte transkripsjonsfaktor (MITF) og proto-onkogen c-MYC.
Konklusjon
Valgte anti-klonogene forbindelser makt bli videre etterforsket som mulige hjelpemidler rettet mot melanom stilk-lignende celler i den kombinerte anti-melanom terapi, mens valgte cytotoksiske men ikke anti-klonogene forbindelser, som økte hyppigheten av ABCB5-positive celler og holdt seg sakte sykling celler upåvirket, kan betraktes som et verktøy for å berike kulturer med celler som utviser melanom stamcelleegenskaper
Citation. Sztiller-Sikorska M, Koprowska K, Majchrzak K, Hartman M, Czyz M (2014) Natural Forbindelser «aktivitet mot Cancer Stem-Like eller Fast-Sykling melanomceller. PLoS ONE 9 (3): e90783. doi: 10,1371 /journal.pone.0090783
Redaktør: Christopher Heeschen, spansk National Cancer Centre (CNIO), Spania
mottatt: 9. desember 2013, Godkjent: 04.02.2014; Publisert: 03.03.2014
Copyright: © 2014 Sztiller-Sikorska et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Finansiering: dette arbeidet ble finansielt støttet av et stipend 2011/01 /B /NZ4 /04921 fra National Science Centre. The Natural Products Set II ble levert uten kostnad av US National Cancer Institute (NCI, https://www.dtp.nci.nih.gov. De bevilgende myndighet hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere eller utarbeidelse av manuskriptet
konkurrerende interesser:. forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
intratumorale fenotypiske heterogenitet resultatene fra den genetiske variasjonen, men også. fra plastisitet av tumorceller som er observert i respons til microenvironmental stimuli. Blant forskjellige funksjonelle fenotyper i en tumor, en subpopulasjon av kreft stilk-lignende celler (cscs) er i stand til selvfornyelse og hoveddelen av en svulst som består av hurtig-sykling celler og mer differensierte celler kunne skjelnes [1] – [3] Som fenotypisk heterogenitet ble vist å være svært dynamisk i mange tumorer, inkludert melanom [4] -. [7] og den terapeutiske utrydding av CSC undergruppe kan etterfølges av sin regenerering fra ikke-cscs, både cscs og bulk befolkningen bør vurderes i utviklingen av kreftbehandling [8] – [14]. Derfor kan et stoff kombinasjon forårsaker en fullstendig utrydding av alle typer celler i en svulst være nødvendig for å oppnå varige botemidler. Ved utvelgelse av sterkt virkende legemiddelkandidater, er det et betydelig problem å skape eksperimentelle
in vitro
modeller som på en pålitelig måte predikerer legemiddelaktivitet hos pasienter. I denne studien, melanom celler hentet direkte fra patologisk forskjellige prøver, nodulær melanom og overfladisk spre melanoma, ble dyrket i en anker-uavhengig måte i stamcelleforskningen medium og ble beriket med celler som utøver selvfornyende kapasitet i forhold til serum-drevet monolayers [15]. Dette
in vitro
tredimensjonal modell har også blitt vist å bevare den heterogeniteten av den opprinnelige tumor mer nøyaktig enn to-dimensjonale monolagskulturer [16] – [18] og var en viktig del av nyhet i den foreliggende
in vitro
screening av den naturlige forbindelsen biblioteket
naturlige forbindelser er mye brukt i anticancerterapi og kan utøve betydelig biologisk aktivitet [19] -. [21]. Selv om deres virkningsmekanismer er ofte ikke godt definert, har de fleste av terapeutiske midler avledet fra naturlige produkter er hovedsakelig effektiv på å eliminere kreft celler med en høy spredning hastighet. Forbindelser som påvirker celledeling kan svikte, men å utrydde en undergruppe av langsomt sykling kreft stilk-lignende celler, noe som fører til slutt til tumor tilbakefall. I den foreliggende undersøkelse, selv om flere fremgangsmåter er blitt anvendt i utvelgelsesprosessen, ble gitt prioritet til de forbindelser som var istand til å redusere antallet klonogene celler. En reduksjon i clonogenicity ble tolket som en direkte virkning på den selv-fornyende potensial av kreft stilk-lignende celler. I tillegg apoptose, etikett-oppbevaring, hyppigheten av ABCB5-positive celler og uttrykk for Wnt /β-catenin signale målgener,
MITF Hotell og
c-MYC
, ble vurdert i melanom populasjoner som ble behandlet med forbindelser valgt som enten svært anti-klonogene eller sterkt cytotoksiske. Vi undersøkte påvirkning av utvalgte forbindelser på stemness-assosierte molekyler og veier. Slow-sykling celler betraktes som kreft stilk-lignende celler (cscs) kan merkes som label-beholder celler [12]. I denne studien har vi brukt et fluorescerende fargestoff CFSE å identifisere forbindelser som forlot etikettbevarmelanomceller upåvirket. ABCB5 transporter protein, en formidler av chemoresistance i melanom, er også anerkjent som en potensiell markør for melanom stilk-lignende celler [2], [22]. Melanomceller som uttrykker ABCB5 protein kan selektivt overleve når de utsettes for dacarbazine, vemurafenib og andre rusmidler [22]. Det ble demonstrert at anti-ABCB5 antistoff eller siRNA genet Slå reverseres melanom resistens mot anticancer legemidler [23], [24]. Vi har undersøkt om andelen av celler som bærer denne transporter er blitt endret ved behandling med utvalgte naturlige forbindelser. Wnt signal spiller en avgjørende rolle i å bevare pluripotency av embryonale stamceller og kreftutvikling [25]. Fersk rapport foreslått en rolle for Wnt /β-catenin signalveien i å opprettholde levedyktigheten og /eller opprettholde selvfornyelse av brystkreft svulst initiere celler
in vitro product: [26]. I melanom, β-catenin signal øker under tumorprogresjon og det fremmer chemoresistance [27]. Vår nylig studie viste at den Wnt /β-catenin signalveien er undertrykt i melanoma populasjoner med den lavfrekvente av klonogene celler (Hartman et al., Submitted). Påvirkningen av utvalgte naturlige forbindelser på to Wnt /β-catenin målgener,
MITF Hotell og
c-MYC
ble undersøkt. Transkripsjonsfaktor MITF fungerer som en rheostat bestemmer fenotypiske identitet blant ulike subpopulasjoner av melanomceller [28]. Selv forsterkes bare i omtrent 20% av melanomer, og MITF blitt foreslått som en avstamning avhengighet onkogen som bidrar til melanom chemoresistance [29], [30]. Proto-onkogen c-MYC spiller en avgjørende rolle i utviklingen av en lang rekke humane tumorer [31]. I det siste har det blitt vist at overekspresjon av c-myc i tumoren kan bli målrettet til spesifikke T-celler [32]. Forbindelser som induserer apoptose og /eller inhibering av proliferasjon i et c-MYC-spesifikk måte virker på forskjellige cellulære mål [33], [34]. c-MYC hemming i melanom celler resulterer i redusert spredning via mekanismer som involverer flere enzymer av nukleotid biosyntesen [35].
Så vidt vi vet er det ingen tidligere studier som utforsker så mange faktorer i parallell i den innledende utvelgelsesprosessen for aktive forbindelser fra The Natural Products Set II (NCI). Basert på de dannede aktivitetsprofiler, kan hver av de valgte forbindelser bli ytterligere undersøkt for sin potensielle anvendelse som en del av anticancerterapi, eller som et verktøy i laboratoriearbeid. De naturlige produkter valgt som aktive forbindelser mot melanomceller kan også gi romanen fører til konvertering til klinisk anvendelige midler.
Materialer og metoder
Forbindelser
Natural Products Set II ble hentet fra det amerikanske National Cancer Institute (NCI, https://www.dtp.nci.nih.gov). Forbindelsene ble i 96-brønners plater med 60 forbindelser per plate. Platene ble lagret tørt ved -20 ° C. Hver brønn inneholdt 0,02 umol av forbindelsen i 1 mL av glycerol. 10 mM-løsning (20 ul) av hver forbindelse ble oppnådd ved tilsetning av 19 ul DMSO til hver brønn. Umiddelbart etter oppløsning av medikamentløsninger ble aliqouted i flere testplater for å unngå mulig utfelling av forbindelsen. Alle forsøkene ble utført ved hjelp av forbindelser som tilbys av NCI.
tumorvev og etikk erklæringen
DMBC celler ble oppnådd i Molekylærbiologisk institutt for kreftforskning fra kirurgiske prøver av melanom i avanserte stadier. Pasientkarakteristikker av melanomprøver ble publisert tidligere [15], [36], [37]. Studien ble godkjent av Etisk Commission of Medical University of Lodz og skriftlig informert samtykke ble innhentet fra alle pasienter.
Cellekulturer
Celler ble opprettholdt i stamceller medium (SCM) i et krings-uavhengig måte som tidligere beskrevet [36].
Måling av levedyktig celle nummer
melanomceller ble telt etter farging med trypanblått (Sigma-Aldrich) og sådd ut i en tetthet på 4 x 10
3 levedyktige celler per brønn i 96-brønners plater. Cellene ble dyrket i 45 timer med bil (0,05% DMSO) eller forbindelser fra The Natural Products Set II ved 5 mikrometer. En sur fosfatase-aktivitet (TFO) assay ble anvendt for å måle levedyktig celleantall. I korthet, ble platene sentrifugert, mediet ble fjernet og erstattet med 100 ul analysebuffer inneholdende 0,1 M natriumacetat (pH = 5), 0,1% Triton X-100 og 5 mM p-nitrofenylfosfat, pNPP (Sigma-Aldrich) og inkubert i ytterligere 2 timer ved 37 ° C. Reaksjonen ble stanset med 10 ul /brønn av 1 M NaOH, og absorbansen ble målt ved bølgelengden på 405 nm ved anvendelse av en mikroplateleser (Infinite M200Pro, Tecan, Østerrike). Melanomceller ikke svare på 0,05% DMSO med redusert levedyktighet.
Livskraftig analysen
Narkotikainduserte endringer i celle levedyktighet etter 45 h behandling ble også vurdert ved flowcytometri etter propidiumjodid (PI) tilsmusses eller ved hjelp av en automatisert cellelevedyktighet analysator i henhold til standardprosedyrer. I begge analysene ble celler analysert ved hjelp av en FACSVerse flowcytometer (Becton Dickinson, San Jose, California, USA), og resultatene ble behandlet ved hjelp FACSuite programvare (Becton Dickinson).
Cell Cycle Analysis
Melanom-celler ble behandlet med kjøretøyet eller forbindelsene ved de angitte konsentrasjoner i 30 timer eller 45 timer, deretter samlet opp og fiksert med 70% (vekt /volum) etanol ved -20 ° C. Cellene ble vasket to ganger med PBS og resuspendert i buffer inneholdende PI Farging RNAse (Becton Dickinson, San Jose, CA, USA). Etter inkubering i 30 minutter ved romtemperatur i mørke, ble celler analysert ved hjelp av en FACSVerse strømningscytometer (Becton Dickinson). ModFit LT 3.0-programvaren (Bekreft Software, Topsham, MN, USA) ble brukt til å beregne prosenter av cellene i hver celle syklus fase, og FACSuit programvare (Becton Dickinson) ble brukt til å beregne prosenter av døde celler i subG
1 .
klonogene Assay
melanomceller ble først inkubert med forbindelser som ved indikerte konsentrasjoner i 4 timer. Deretter levedyktigheten ble bestemt ved trypan blå farving og 1000 enkelt, levedyktige melanomceller ble overført til 700 mL topp-agar medium blanding (SCM, 0,35% (w /v) agar), og de fremstilte cellesuspensjoner ble lagt over 12-brønners kulturplater belagt med 700 ul størknet bunnagar blanding (SCM, 0,5% (w /v) agar). Platene ble deretter inkubert ved 37 ° C i en fuktet inkubator i 2 uker, og i enkelte tilfeller også i 3 uker. Celler ble farget med 500 ul av 0,005% krystallfiolett i 2 timer, og kolonier på minst 50 pm i diameter ble tellet under mikroskop. Innvirkningen av forbindelsene på den clonogenicity ble uttrykt som prosent av kontroll i henhold til formelen: antall kolonier som genereres etter behandling med forbindelsene /antall kolonier i kontrollen med kjøretøyet x 100.
flowcytometrisk analyse av apoptose
Påvisning av celledød ble utført av to farging med Annexin V-FITC og PI (Roche Diagnostics, Manheim, Tyskland). Melanom-celler ble sådd på 12-brønners plater og behandlet i 45 timer med forbindelsene ved indikerte konsentrasjoner. Etter behandling ble cellene samlet, sentrifugert ved 400 x g i 5 minutter og farget med Annexin V-FITC og PI i 15 minutter ved romtemperatur i mørke. 15.000 hendelsene ble analysert for hver prøve ved flowcytometeret FACSVerse (Becton Dickinson), og resultatene ble behandlet ved hjelp FACSuite programvare (Becton Dickinson).
Vurdering av ABCB5-positive celler
Hyppigheten av celler som uttrykker ABCB5 ble bestemt ved flow-cytometri. Ukonjugert anti-ABCB5 primære antistoff fra Sigma-Aldrich, og FITC-konjugert geite-anti-kanin-sekundært antistoff (BD Pharmingen) ble anvendt i denne studien. Vanligvis ble 30.000 celler analysert per prøve. Isotype kontroller ble inkludert i hvert eksperiment. For å utelukke døde celler fra analysen, 7-Aminoactinomycin D farging (7-AAD; eBiosciences) ble brukt. Flowcytometrisk Kjøpet ble utført ved hjelp av en FACSVerse flowcytometer (Becton Dickinson) og analysert ved hjelp av FACSuite programvare. Endringer i hyppigheten av ABCB5-positive celler etter behandling i 45 timer ble uttrykt som prosent av kontroll med bilen.
CFSE Farging
For CFSE analyse, melanom celler ble farget med 1,5 mikrometer CFSE (prodrogen karboksyfluorescein-diacetat succinimidylester) i 30 minutter ved 37 ° C, vasket to ganger, sådd i tolv-brønns plater ved 1,25 x 10
5 /brønn, og eksponert for forbindelsene i 5 dager ved indikerte konsentrasjoner. Deretter ble mediet byttet ut og cellene ble inkubert i medikamentfritt medium i ytterligere 6 dager, og vurderes ved strømningscytometri. Grønn fluorescens utslipp ble målt ved hjelp av en FACSVerse flowcytometer (Becton Dickinson) og analysert ved hjelp av FACSuite programvare.
RNA Isolation, cDNA syntese og Real-Time PCR
RNA ble isolert og renset ved hjelp av Total RNA isolasjon kit med mini kolonnesystem (A A bioteknologi, Gdynia, Polen). RNA-konsentrasjon og renhet ble målt med en Tecan NanoQuant plateleser (Tecan, Østerrike). cDNA ble syntetisert ved anvendelse av 300 ng av tilfeldige primere og Superscript II revers transkriptase (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA, USA). Den Rotor-Gene 3000 Real-Time DNA analysesystem (Corbett Research, Morklake, Australia) ble brukt til å evaluere genuttrykket av kvantitativ real-time polymerase chain reaction (QRT-PCR). Forsterkningen ble utført ved hjelp av KAPA SYBR FAST qPCR Kit Universal 2X qPCR Master Mix (Kapa Biosystems, Cape Town, Sør-Afrika), 200 nM av hver primer og 25 ng cDNA mal per reaksjon. Primere som brukes for Real-Time PCR var som følgende: MITF: 5′-ACC GTC TCT CAC TGG ATT GG-3 «og 5» TAC TTG GTG GGG TTT TCG AG-3 «; C-MYC: 5»-AAT GAA AAG GCC CCC AAG GTA GTT ATC C-3 «og 5′-GTC GTT TCC GCA ACA AGT CCT CTT C-3′; SOX2: 5»-GCT AGT CTC CAA GCG ACG-3 «og 5′-GCA AGA AGC CTC TCC TTG-3». Glødetemperaturen for alle genene var 56 ° C. Den relative ekspresjon av målgener ble beregnet i forhold til en referanse-gen RPS17 (med primere: 5′-AAT CTC CTG ATC CAA GGC TG-3 «og 5′-CAA GAT AGC AGG TTA TGT CAC G-3»), og en matematisk modellen inkludert en effektivitet korreksjon for real-Time PCR ble brukt.
Statistical Analysis
data representerer gjennomsnitt ± SD fra tre separate forsøk med mindre annet er spesifisert. Betydningen av en tilsynelatende forskjell i middelverdier for alle testet parameter ble validert av en Students paret t-test. P 0,05 ble betraktet som signifikant
Resultater
Utvalg Strategy av naturlige forbindelser i melanomceller dyrket i et Anchorage-uavhengig måte
Natural Products Set II, som består av 120. forbindelser (Tabell S1 i File SI) avledet fra DTP Åpne Repository samling av 140.000 forbindelser, ble siktet for å identifisere forbindelser effektive mot melanomceller. I pre-skjerm av forbindelser, ble to cellelinjer avledet fra avansert melanom brukt, en fra knute melanom (DMBC12) [15] og en fra overfladisk spredende (DMBC11) [37]. Begge populasjoner ble dyrket i SCM i en ankeruavhengig måte som flercellede tre-dimensjonale kuler. I den primære screening, ble melanomceller fra dissosierte kuler utsettes for hver forbindelse ved en enkel konsentrasjon på 5 uM. Både ikke-klonogene og klonogene analyser ble anvendt i parallell (fig. 1).
Først ble forbindelsene fra de naturlige produktene Set II testet i to melanomcellelinjer erholdt fra patologisk forskjellige prøver, DMBC11 og DMBC12, ved en enkel konsentrasjon på 5 uM. Endringer i levedyktighet (APA analyse, volumetrisk analyse, PI flekker og subG
1 assay) ble målt som kortsiktige effekter og endringer i klonogene potensielle som langsiktige effektene av de testede forbindelser. Alle levedyktighet tester ble sammenlignet for potensielle uoverensstemmelser. To kriterier ble benyttet for å velge forbindelser for videre analyse: Forbindelse bør redusere cellenes levedyktighet (PI-farging) til ≤ 50% av kontroll og clonogenicity til ≤ 20% av kontroll. Deretter ble de utvalgte forbindelser som anvendes ved lavere konsentrasjoner for dose-responskurver. De mest potente forbindelser ble deretter undersøkt for deres evne til å indusere apoptose, for å påvirke frekvensen av ABCB5-positive celler og etikettholde slow-sykling-celler, og for å endre genekspresjon.
Short-Term cytotoksiske og Cytostatika Effekter av naturlige forbindelser på melanom celler
Fire ikke-klonogene metoder ble valgt for den innledende screening. Endringer i levedyktige celler ble beregnet basert på kvantifisering av cytosoliske syre fosfatase aktivitet (APA assay) (fig. S1 A i File SI) og ved flowcytometri hjelp av en automatisert celleviabilitet analysator (volumetrisk assay) (Fig. S1B i File SI ). Cytotoksisitet av forbindelsene ble målt ved flow-cytometri etter PI farging, enten som hyppigheten av PI-positive celler (Fig. 2 og fig. S2 i File SI) eller som prosentandelen av celler i subG
1 fraksjon. Histogrammer for de forbindelsene som akkumulert mer enn 40% av melanomceller i subG
en brøkdel inngår i fig. 3 og fig. S3A i File SI. Alle disse analyser ble brukt for å vurdere medikamentaktivitet etter kort inkubering, enten etter 45 timer for kvantifisering av fraksjoner av levedyktige og PI-positive celler, eller etter 30 timer for prosenter av celler i subG
1 fraksjoner. Parallelt ble det naturlige forbindelser ved 5 uM vurdert i medikament-resistent, p53-manglende leukemicellelinje K562 (fig. 2, fig. S1-S2 i File SI). Sammenligningen av cytotoksisiteten av naturlige produkter mot melanom og leukemiceller (Fig. 2) viste at flere forbindelser som er aktive mot melanom-celler var ikke aktive i K562-celler. For eksempel, streptonigrin (32), crassin (68) og geldanamycin analog (72) redusert levedyktighet av melanomceller til mindre enn 3% av kontroll, men reduksjon av levedyktigheten av K562-celler nådde ikke 50% av kontroll. Melanomceller var også mye mer følsom for fastigilin B (63), bactobolin (84), didemnin B (104), siomycin A (107), toyocamycin (108), geldanamycin (110) og tubulosine (119) blant andre (fig. 2). K562-celler, i sin tur, var mye mer følsomme for lapachone (20) enn melanomceller.
Levedyktigheten ble målt etter 45% av bærer (0,05% DMSO) -behandlet kontroll. For sammenligning ble det leukemicellelinje K562 anvendt. Hver rute representerer responsen av melanom eller leukemi celler til en av 120 forbindelser. Fargene indikerer nivået av celleresponsen. For klarhet tallene utpekt i denne studien til de testede forbindelser (Tabell S1 i File SI) er satt i første rå og den første kolonnen. Se figur S2 i File SI for kvantitative data.
Representative histogrammer av DMBC11 celler behandlet med naturlige forbindelser for 30
1 ikke overstige 40%, ble histogrammer analysert ved hjelp ModFit programvare for å beregne prosenter av cellene i hver cellesyklus fase. Histogrammer som viser cellesyklus arrest i G
0 /G
1 fase ble markert med grønn ramme, i S-fasen med blå ramme og G
2 /M i rød ramme, og prosenter av melanomceller arrestert i disse fasene er indikert. Når opphopning av melanomceller i subG
1 oversteg 40%, ble FACSuit programvaren som brukes og prosenter av døde celler er indikert. Resultater oppnådd for DMBC12 celler er vist i figur S3A i File SI. Effektene av lavere konsentrasjoner for de cytotoksiske forbindelsene eller lengre eksponering for forbindelser ineffektive ved 30 h inngår i fig S3b i File SI.
i cellesyklusanalyse, flere forbindelser i en konsentrasjon på 5 pM akkumulert melanomceller enten i ulike cellesyklusfaser eller genererte skadede celler samles i subG
1 (fig. 3 for DMBC11 celler og fig. S3A i File SI for DMBC12 celler). Kolchicin (1), rotenon (19), vinkristin (39), maytansine (60) og rhizoxin (86) arrestert majoriteten av melanomceller i G
2 /M-fasen. Resorufin (12), michellamine B (101) og fumagillin (120), blant andre stansede celler i S-fasen, mens Brefeldin A (47) og camptothecin (48) oppsamlede celler i G
0 /G
en eller subG
1 avhengig av narkotika og cellelinje. Flere forbindelser, som ved 5 uM forårsaket ingen virkning på cellesyklus etter behandling i 30 timer, ble anvendt i den etterfølgende eksperiment i 45 timer, mens forbindelser som forårsaker akkumulering av celler i subG
1 ble testet ved 1 pM, og i tilfellet av de mest potente stoffer på 0,1 mikrometer (fig. S3b i File SI). Streptonigrin (32) genererer en stor populasjon av celler i subG
1 5 mikrometer, akkumulert DMBC12 celler i S-fasen når det brukes på 0,1 mikrometer.
Pre-skjermen på klonogene kapasitet som en langsiktig effekt av naturlige forbindelser på melanomceller
En klonogene analysen ble ansatt for å undersøke effekter av naturlige forbindelser på selvfornyende kapasitet på melanomceller. Cellene ble inkubert med forbindelsene bare i 4 timer, og langsiktige virkningene av dette inkubasjon ble vurdert som evne til å danne kuler i myk agar etter 2 uker. Førti åtte og førti seks forbindelser på 5 mikrometer redusert antall kloner dannet i agar til ≤1% av kontroll i DMBC11 og DMBC12 populasjoner, henholdsvis (Fig. 4 og Fig. S4 i File SI). Som klonogene celler kan dele saktere, og kolonien kan ikke komme til riktig størrelse i løpet av 2 uker, for flere forbindelser kolonien telling ble gjort en uke senere. Det var ingen vesentlige forskjeller mellom antallet kloner oppnådd etter to og tre uker (data ikke vist).
Cellene ble inkubert i forbindelse-inneholdende medium i 4 timer, og deretter ble de dyrket på bløt agar i 14 dager i nærvær av medikament-fritt medium. Cellekolonier ble farget med krystallfiolett og tellet. Forbindelser ble gruppert på grunnlag av deres anti-klonogene aktivitet uttrykt som prosent av kontroll behandlet med vehikkel (0,05% DMSO). I det minste to uavhengige eksperimenter ble utført i duplikater. Se figur S4 i File SI for kvantitative data.
Sammenligning av kort- og langtidsvirkninger av Active naturlige forbindelser på melanomceller
Etter den innledende screening utført ved fem mikrometer, hver forbindelse fra The Natural Products Set II kan bli tildelt en av fem kategorier (Fig. 5). Førti seks forbindelser på 5 mikrometer var ikke aktiv i noen av ansatt analyser i begge testet populasjoner. De ble ekskludert fra videre analyser. Noen av de ikke-aktive forbindelser som for eksempel curcumine (27) eller rapamycin (69) er godt karakterisert for deres antikreft-aktivitet, men tilsynelatende ved 5 uM de var ikke aktive mot forankringsuavhengige melanomceller. Flere forbindelser var istand til å indusere celledød i løpet av de første to dager, og i tillegg er de effektivt utrydde celler med klonogene potensial. De forbindelser ble ansett som meget potent, og deres aktiviteter, både ikke-klonogene og klonogene, ble målt ved lave konsentrasjoner i de følgende eksperimenter. To narkotika, actinomycin D (105) og cyklofosfamid (117), ble ekskludert fra videre analyse, som de er svært godt karakterisert for deres
in vitro Hotell og
in vivo
anticancer aktivitet. I tillegg ble parthenolid (61) også utelukket som vår detaljerte rapport som beskriver dens virkning på forankrings-uavhengig melanomceller, ble publisert nylig [36]. Som prioritet er gitt til forbindelser som reduserte antallet melanomceller som viser selv-fornyende kapasitet, ble utvalgte forbindelser fra gruppen av anti-klonogene men ikke sterkt cytotoksisk også ytterligere analysert.
Etter innledende screening, Forbindelsene ble gruppert basert på deres aktiviteter. En forbindelse ble definert som anti-klonogene når det reduserte prosenten av kloner dannet i myk agar til mindre enn 20% av kontrollen ble behandlet med vehikkel (0,05% DMSO). En forbindelse ble kalt cytostatisk når det reduserte levedyktig celletall på mindre enn 50% av kontroll ved hjelp av levedyktig celleantall telling, og cytotoksiske ved hjelp av strømningscytometri etter PI-farging. Tall som tilsvarer forbindelser som akkumulert melanomceller i subG
1 er understreket. Forbindelser som forårsaket cellesyklus arrest er merket med grønt for G
0 /G
1 fase, blå for S-fasen og rødt for G
2 /M fase. Flere forbindelser (46) var ikke aktive i noen analyse. Noen forbindelser var cytotoksisk, men ikke merkbart påvirket av antall kolonier dannet på agar. Noen andre forbindelser som utøves deres effekt bare på klonogene celler eller redusert clonogenicity under 20% av kontroll, forårsaket cytostatisk /cytostatisk effekt uten å indusere betydelig celledød. Flere forbindelser ble cytostatisk og cytotoksisk og i tillegg er de effektivt utrydde celler med klonogene potensial. De var i fokus for videre studier. Se tabell S1 i File SI for navnene på forbindelser som tilsvarer tallene som vises i figuren.
Først ble den cytotoksiske effekten av potente naturlige forbindelser bekreftet i seks pasient avledet cellelinjer, inkludert fire flere cellelinjer avledet fra kirurgiske prøver av nodulær melanom, DMBC2, DMBC8, DMBC10 [15] og DMBC9 [36]. Konsentrasjonene av forbindelsene ble senket til 1 uM og 0,1 uM, og i noen tilfeller til 0,01 uM eller til og med 0,001 uM, inntil IC
50 effekt ble oppnådd (tabell S2 i File SI). Generelt er det bare små forskjeller mellom responsene til melanomceller fra forskjellige DMBC populasjoner var synlige ved medikamentkonsentrasjoner på 1 uM og 0,1 uM. DMBC8 celler så ut til å være mindre sensitiv for flere forbindelser enn andre populasjoner.
Deretter dose-responskurver ble fremstilt i 45 forbindelser som utøver sterke anti-klonogene og /eller cytotoksiske potensialer (fig. 6 og fig. S5 i File SI). Basert på dose-responskurver ble rangeringsliste over de mest potente forbindelser fra Natural Products Set II forberedt (tabell 1). Anti-klonogene aktivitet ble rangert over cytotoksisk aktivitet. IC
50 verdier av syv forbindelser som var under 0,1 um når medikamentet innflytelse på kapasiteten til å danne kloner i myk agar ble evaluert. Blant de forbindelser, maytansine (60) utøves et sterkere samlet cytotoksisk effekt enn anti-klonogene effekt, streptonigrin (32), toyocamycin (108), colchicin (1) og echinomycin A (102) hadde lignende potens i begge aktiviteter, mens nanaomycin A (74) og illudin M (114) var mer potente i utrydde celler med den klonogene potensial enn å redusere levedyktighet i løpet av den kortvarig inkubasjon. Lignende fenomener ble observert for flere forbindelser som var effektive ved høyere konsentrasjoner. For eksempel IC
50-verdier for anti klonogene forbindelser, bryostatin en (112), siomycin A (107), fumitremorgin C (118), fumagallin (120) michellamine B (101) og pentoksifyllin (100) var i området 0,1 – 1 uM i den klonogene analyse, men som i området 1 -. 5 uM i levedyktigheten analysen
Doseresponskurver respons~~POS=TRUNC kurver~~POS=HEADCOMP ble fremstilt for forbindelser som viser høy anti-klonogene og /eller cytotoksiske potensiale. Blå kurver, anti-klonogene aktivitet; sorte kurver, cytotoksisk aktivitet. Grafene oppsummert resultatene av minst 3 uavhengige eksperimenter utført i tre paralleller bruker DMBC11 (fylt kvadrat) og DMBC12 (åpen plass) cellelinjer. Kjemiske formler av testede forbindelser er inkludert. Dose-responskurver for mindre potent forbindelser er vist i figur S5 i File SI.
Induksjon av apoptose i melanomceller Utsatt for utvalgte forbindelser
Flowcytometrisk analyse av Annexin V /PI-fargede celler viste at meget cytotoksiske forbindelser indusert apoptose i melanomceller, mens forbindelsene utrydde hovedsakelig celler med evne til å danne kloner (tabell 1) ikke utløse apoptose i konsentrasjoner effektive for deres anti-klonogene-aktivitet (fig. 7) . For eksempel, maytansine (60) indusert apoptose i de fleste av cellene ved en konsentrasjon så lav som 0,01 uM. Tvert imot, har nanaomycin A (74), som ved 0.1 uM nesten helt utryddet celler med klonogene potensial ikke induserer apoptose ved denne konsentrasjonen.
Induksjon av apoptose ble bestemt ved hjelp av strømningscytometri etter Annexin V /propidiumjodidfarging . Typiske kontur plott av melanomceller behandlet med forbindelser ved indikerte konsentrasjoner er vist. Tallene i rektanglene indikerer de gjennomsnittlige prosentandeler av alle annexin-V-positive celler, både PI negativ (tidlig apoptose) og PI positiv (sen apoptose /nekrose) (n = 2). Figur S2. Figur S3. Figur S4. Figur S5. Tabell S2. Tabell S3.
