Abstract
Cdc7-Dbf4 kinase eller DDK (Dbf4-avhengig kinase) er nødvendig for å initiere DNA replikasjon ved å fosforylere og aktivere den replikative Mcm2-7 DNA helicase. DDK er overuttrykt i mange tumorceller og er en ny kjemoterapeutisk mål siden DDK hemming fører apoptose av ulike kreftcelletyper, men ikke fra normale celler. PHA-767 491 og XL413 er blant en rekke potente DDK hemmere med lav nanomolare IC
50 verdier mot den rensede kinase. Selv om XL413 er svært selektiv for DDK, dets aktivitet ikke har blitt grundig karakterisert på cellelinjer. Vi målte anti-proliferative og apoptotiske virkninger av XL413 på et panel av tumorcellelinjer sammenliknet med PHA-767 491, hvis aktivitet er godt karakterisert. Begge forbindelser var effektive biokjemiske DDK-hemmere, men overraskende, deres aktiviteter i cellelinjer var svært sprikende. I motsetning til PHA-767491, XL413 hadde signifikant anti-proliferativ aktivitet mot bare en av de ti cellelinjene som ble testet. Siden XL413 ikke effektivt å inhibere DDK i flere cellelinjer, har denne forbindelsen sannsynligvis begrenset biotilgjengelighet. For å identifisere potensielle kunder for ytterligere DDK hemmere, vi også testet kryssreaktivitet av ~400 kjente kinase hemmere mot DDK ved hjelp av en DDK termisk stabilitet shift analyse (TSA). Vi identifiserte 11 forbindelser som vesentlig stabiliserte DDK. Flere hemmet DDK med tilsvarende potens som PHA-767 491, inkludert Chk1 og PKR kinase hemmere, men hadde avvikende kjemiske stillas fra kjente DDK hemmere. Samlet utgjør disse dataene viser at flere kjente kinase hemmere kryssreagerer med DDK og også fremheve muligheten til å designe flere spesifikke, biologisk aktive DDK hemmere for bruk som kjemoterapeutika
Citation. Sasi NK, Tiwari K, Soon FF, Bonte D, Wang T, Melcher K, et al. (2014) Den potente Cdc7-Dbf4 (DDK) Kinase Inhibitor XL413 har en begrenset aktivitet i mange kreftcellelinjer og Discovery eventuelle nye DDK Inhibitor Stillas. PLoS ONE 9 (11): e113300. doi: 10,1371 /journal.pone.0113300
Redaktør: Irina V. Lebedeva, Columbia University, USA
mottatt: 30 juni 2014; Godkjent: 23 oktober 2014; Publisert: 20.11.2014
Copyright: © 2014 Sasi et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet:. Den forfatterne bekrefter at alle data som underbygger funnene er fullt tilgjengelig uten restriksjoner. Alle relevante data er i avisen og dens saksdokumenter filer
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av Van Andel Institute (KM HEX MW) og National Institutes of Health (R01-DK071662 HEX). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser. Ingen av forfatterne har noen sammenheng med Dr. Tong Wang eller selskapet translasjonell Drug Development, Inc. annet enn gjennom Dr. Wang hjelp utforme og koordinere syntese av de to forbindelsene forfatterne benyttet i studien, som han er medforfatter på dette manuskriptet. Det er heller ingen restriksjoner på deling av data eller materialer.
Innledning
initiering av DNA replikasjon er midlertidig delt inn i to faser i løpet av cellesyklusen. Først blir en inaktiv form av den replikative MCM (mini-kromosom vedlikehold) helikase applisert på opprinnelse DNA i G1 fase, og deretter aktivert ved inngåelse og i løpet av S-fasen av to sett av kinaser: cyklin-avhengige kinase og Dbf4-avhengig kinase ( DDK) [1]. DDK er en to-subenhet Ser /Thr kinase sammensatt av Cdc7 kinase og Dbf4 regulatoriske subenheter. DDK mediert fosforylering av den seks-subenheten Mcm2-7 (MCM) helikase er antatt å føre til en konformasjonsendring i sin struktur som fører til aktivering helikase [2], [3]. MCM aktivering følges av lokaliserte DNA avvikling, rekruttering av replisome maskiner og igangsetting av toveis DNA-syntese [1]. Andre funksjoner av DDK inkludere rette for kromosomal segregasjon i mitose og meiose [4], [5], initiering av meiotisk rekombinasjon [6], [7], og aktivering av DNA-reparasjonsbaner blant trans-lesjon DNA-reparasjon [8], [9].
Cdc7 kinase-aktivitet er avhengig av tilknytning til sin regulerende subenhet, Dbf4 [10], [11]. Dbf4 er et cellesyklusregulert protein som har overflod toppene i S-fasen, og deretter blir degradert ved utgangen av mitose [12] – [14]. Interaksjon med Dbf4 er nødvendig for Cdc7 ATP-binding og underlaget anerkjennelse [15]. Som alle andre proteinkinaser, avslører DDK krystallstrukturen et aktivt sete i en dyp kløft mellom det N- og C-terminale fliker [16], [17]. Den Dbf4 Zn-finger ( «motiv C») bindes til den N-terminale flik av DDK og er nødvendig for menneskelig DDK aktivitet, men er ikke avgjørende for spirende eller spalting gjær DDK kinase-aktivitet [18] – [20]. Dbf4 motiv M forbedrer dens tilknytning til Cdc7 subenheten og er nødvendig for den fulle aktivitet av kinasen i gjær og mennesker [16], [18], [19], [21]. DDK phosphorylates flere subenheter av MCM helicase [22] -. [24] og en fersk undersøkelse i spirende gjær indikerer at Cdc7 og Dbf4 fysisk samhandle med forskjellige subenheter av Mcm2-7 komplekse [25]
DDK er i løpet uttrykt i et antall av primære tumorer og tumorcellelinjer [26] – [32]. DDK løpet uttrykket har også vært assosiert med dårlig prognose i bryst kreft [33], avansert klinisk stadium i ovarialcancer [34], og med aggressive fenotype i papillær skjoldbrusk carcinoma [35]. Nivåregulering av DDK i tumorceller er en attraktiv tumor terapeutisk strategi. Ved hjelp av nøytraliserende antistoffer, Hunter og kolleger var de første til å vise at DDK uttømming fører til alvorlig forstyrrelse av DNA replikasjon i HeLa-celler [10]. Ved hjelp av små interfererende RNA, Santocanale og kolleger viste videre at DDK utarming førte til p53-uavhengige apoptose i HeLa-celler, mens en normal menneskelig dermal fibroblast cellelinje gikk en reversibel cellesyklus arrest [36]. HeLa-celler var ikke i stand til å arrestere på G1-S-fase overgang, framdrift gjennom en dødelig S-fasen resulterer i celledød via apoptose. Dette funn er blitt bekreftet i en rekke forskjellige cellelinjer [37] – [39]. Viktigere er tumor celledød indusert av uttømming av DDK ikke ledsaget av induksjon av kjente sjekkpunkt markører. Liknende cellulære responser blir sett ved uttømming av andre komponenter av replikasjonsstart maskineri, inkludert Cdc6, Cdc45 og MCM2 subenheter [40], [41]. Svulsten celle spesifikk dreping observert av uttømming av DDK har vekket interesse som et farmasøytisk mål for kreftbehandling. Innsats fra flere farmasøytiske selskaper har ført til en rekke små molekyl DDK hemmere (figur 1).
Den første godt karakterisert DDK inhibitor var en pyrrolopyridinon molekyl (PHA-767 491, figur 1) [42 ], [43]. Det er en potent DDK inhibitor med en IC
50 av 10 nM bruker renset kinase. PHA-767491 er også en effektiv cellevekst-inhibitor, med en gjennomsnittlig IC50 = 3,14 uM mellom 61 tumorcellelinjer [43]. PHA-767491 inhiberer også renset Cdk9 med en IC
50 til 34 nM, men er et mye mindre potent inhibitor av mange andre kinaser testet i [43]. Derfor PHA-767 491 er en dual DDK /Cdk9 inhibitor. Nylige studier har antydet at inhibering av Cdk9, en kinase som er rettet RNA-polymerase II, kan forbedre den apoptotiske respons indusert av PHA-767491 i noen cellelinjer [43] – [45]. Modifiseringer av denne forbindelse førte til identifisering av flere andre potente inhibitorer av DDK med noen som oppviser overlegen selektivitet og følsomhet [46] – [48]. XL413, et strukturelt distinkt DDK inhibitor, er en benzofuropyrimidinone basert forbindelse med en rapportert IC
50 på 3,4 nM mot renset DDK og hemmer celle spredning av Colo-205 celler med en IC
50 av 2,69 mikrometer [49] . Det var også meget selektiv for DDK når de ble testet mot et panel av 100 kinaser [49].
økte aktiviteten og selektiviteten av XL413 enn PHA-767491 ble rasjonalisert ved at krystallstrukturen av DDK i kompleks med de to DDK hemmere [16]. En grunn XL413 kan være en mer spesifikk inhibitor er at det gjøres kontakt med tre av de mest variant restene i kinase aktive setet i forhold til PHA-767491, hvilken interaksjon med to av disse restene. Det var derfor uventet å finne at XL413 var ikke et spesielt kraftig cellevekst-inhibitor i de fleste av cellelinjene som ble testet vi, ettersom Cdc7 er essensielt for cellesyklusprogresjon. XL413 hemmet spredning og indusert apoptose i Colo-205 celler som vist tidligere [49], men hadde begrenset aktivitet i 9 andre tumorcellelinjer som ble testet. Selv om begge forbindelser viser sammenlignbare biokjemiske DDK inhibitorer, PHA-767491 oppviste overlegen aktivitet til XL413 i cellelinjer. Analyse av DDK-spesifikke MCM2 fosforylering nivåer antyder at XL413 kan ha dårlig biotilgjengelighet i disse og andre kreftcellelinjer. For å hjelpe til i utviklingen av ytterligere DDK inhibitorer, testet vi hvorvidt kjent protein-kinase-inhibitorer (dvs. de som ikke er utformet for å hemme DDK) oppviste kryssreaksjon med DDK. Vi har vist ~400 forbindelser under anvendelse av en termisk stabilitet skiftanalyse (TSA) og identifisert 12 molekyler som forskyves den termiske stabilitet av DDK, flere med avvikende kjemisk stillaser og med nesten tilsvarende styrke som PHA-767491. Disse forbindelser er derfor lite sannsynlig å være meget spesifikke for et enkelt mål. Våre data markere muligheten til å designe flere spesifikke, biologisk aktive DDK hemmere for bruk som kjemoterapeutika.
Materialer og metoder
Syntese av PHA-767491 og XL413
DDK inhibitorer, PHA-767491 og XL413, ble syntetisert som tidligere beskrevet [42], [49]. HPLC-analyse og massespektrometri ble utført på begge forbindelser, som bekreftet den korrekte molekylvekt og en høy grad av renhet (mer enn 99%) for både
Cellelinjer
HeLa-celler (ATCC. ) ble dyrket i MEM supplert med Earls salter, 2 mM glutamin, 10% varme-inaktivert føtalt bovint serum (HI FBS), 1,5 g /l natriumbikarbonat, 0,1 mM ikke-essensielle aminosyrer, 1 mM natriumpyruvat, 50 enheter /ml penicillin og 50 ug /ml streptomycin. MDA-MB-453 (ATCC) celler ble dyrket i DMEM supplert med 4,5 g /L D-glukose, 4 mM L-glutamin, 110 mg /l natrium-pyruvat, 10% HI FBS, 50 enheter /ml penicillin, og 50 ug /ml streptomycin. HCC1954 (ATCC), HCC1187 (ATCC), BT-549 (NCI-60), MCF-7 (NCI-60), og Colo-205 (NCI-60) celler ble alle dyrket i RPMI 1640 medium supplert med 10% HI FBS, 50 enheter /ml penicillin og 50 ug /ml streptomycin. HCT-116 p53
+ /+ og p53
– /- cellelinjer ble dyrket i McCoys 5A medium supplert med 10% FBS HI, 50 enheter /ml penicillin og 50 ug /ml streptomycin. Alle celler ble opprettholdt ved 37 ° C med 5% CO
2 i en fuktet inkubator.
DDK proteininduksjon
pKT37 er et pETDuet-1 (Novagen) -vector at ko- uttrykker His6-Smt3-HsCdc7 (kodon optimalisert, Genescript) og Dbf4 rester 341-674, som inneholder motiver M og C som kreves for å binde og aktivere Cdc7.
E. coli BL21
-Ripl ble transformert med pKT37 og en frisk koloni ble dyrket over natten i LB inneholdende 150 ug /ml ampicillin, 50 ug /ml kloramfenikol og 1% glukose. To liter LB inneholdende 150 pg /ml ampicillin og 50 pg /ml kloramfenikol ble inokulert med -60 ml over natten kultur for å gi en OD
600 på 0,1. Kulturen ble dyrket til en OD
600 0,8 og deretter fremkalt i 6 timer med 0,5 mM IPTG, ved 25 ° C. Cellepelleten ble suspendert i 20 ml Ni-NTA buffer A (20 mM HEPES-NaOH (pH 7,4), 250 mM NaCl, 10% glycerol) med 1X protease inhibitor cocktail (Roche) og 1 mM β-merkaptoetanol. En mikro plastiseringsmiddel ble anvendt for å lysere cellene, etterfulgt av en 30 minutters sentrifugering (12000 rpm, F13 rotor) ved 4 ° C.
DDK rensing
DDK ble renset trinnvis ved hjelp av nikkel -NTA, SP Fast Flow, og S-200-kolonner. Cellelysatet som inneholdt 35 mM imidazol ble applisert på en 25 ml Ni-NTA-kolonne, vasket med 20 kolonnevolumer, og deretter elueres med en 250 ml 35 mM-150 mM imidazol gradient. DDK proteinfraksjoner (~115 mM imidazol) ble slått sammen og dialysert over natten ved 4 ° C mot 20 mM HEPES-NaOH, pH 7,4, 1 mM EDTA, 10% glycerol med ingen imidazol. Dialysatet ble deretter ført over tre 5 ml SP Fast Flow kolonne (koblet i tandem), vasket og eluert med en 100 ml 100 mM-0,5 M NaCl-gradient. DDK proteinfraksjoner (~0.2 M) ble slått sammen, MgCl
2 ble tilsatt til den samlede protein for å chelatere EDTA, og inkubert med PP2C (6His-GST-Hab1) fosfatase ved anvendelse av en ekvivalent mengde milligram til det totale proteinet i bassenget og 1/100 ekvivalente milligram mengde Ulp1 protease for å spalte His6-Smt3 (Sumo) tag ved 16 ° C over natten. DDK ble analysert på 15% SDS-gel for å kontrollere omfanget av defosforylering og Sumo spaltning (som var vanligvis større enn 95%). Proteinet Bassenget ble fylt på en andre Ni-NTA-kolonne (med ingen imidazol) og strømmer gjennom fraksjoner som inneholdt DDK ble samlet, ble 1 mM EDTA tilsatt til chelat Ni
++, og dialysert over natten ved 4 ° C mot 20 mM HEPES (pH 7,4), 100 mM NaCl, 1 mM EDTA. Proteinet ble konsentrert ved bruk av 30 000 MWCO sentrifuge konsentrator (Amicon ultra, Millipore) ved 4 ° C til et sluttvolum på 10 ml. Konsentrert protein ble fylt på en 300 ml S-200 gel-utelukkelseskolonne (Amersham-Pharmacia). HsCdc7-Dbf4 eluert ved ~150 kDa, nær dimer verdi på 110 kDa. Totalt utbytte var vanligvis 6 til 8 mg.
In vitro
kinase aktiveringsanalyser
20 ng av renset human DDK ble pre-inkubert med økende konsentrasjoner av hver inhibitor for DDK 5 min. Deretter ble 10 uCi (γ) –
32P ATP og 1,5 uM kald ATP ble tilsatt i en buffer inneholdende 50 mM Tris-HCl (pH 7,5), 10 mM MgCl
2, og 1 mM DTT og inkubert i 30 minutter ved 30 ° C. Proteinene ble denaturert i 1 x Laemmli-buffer ved 100 ° C etterfulgt av SDS-PAGE og autoradiografi på HyBlot CL film (Denville Scientific, Inc.). Auto-fosforylering av DDK ble brukt som en indikator på dets kinaseaktivitet.
32P-merkede bånd ble kvantifisert ved hjelp ImageJ og IC
50 verdier ble beregnet ved hjelp GraphPad (Prism 6).
Analyse av celle levedyktighet
For analyser i 96 brønners plater 2500-celler ble sådd ut per brønn. Etter 24 timer ble cellene behandlet med lavmolekylære inhibitorer og inkubert i 72 timer ved 37 ° C. Deretter ble cellene lysert, og ATP-innhold ble målt som en indikasjon på metabolsk aktive celler ved bruk av CellTiter-Glo assay (Promega). IC
50-verdier ble beregnet ved anvendelse av GraphPad programvare. For analyser i seks brønners plater, ble 100.000 celler belagt per brønn. Etter 24 timer ble cellene behandlet med lavmolekylære inhibitorer og inkubert i varierende tidspunkter. Cellene ble trypsinert og en suspensjon ble tatt opp i 5 ml fosfatbufret saltvann. 30 pl av denne suspensjonen ble blandet med 30 pl av CellTiter-Glo-reagens, etterfulgt av en 10-minutters inkubasjon ved romtemperatur. Luminescens ble målt ved hjelp av EnVision 2104 Multilabel Reader (PerkinElmer) og BioTek Synergy Neo -mikroplateleser.
Analyse av caspase 3/7 aktivitet
5000 celler per brønn ble sådd ut i en 96-brønners plate. Etter 24 timer ble cellene behandlet med lavmolekylære inhibitorer og inkubert i 24 timer ved 37 ° C. Caspase 3/7 aktivitet og levedyktig celle nummer ble deretter målt ved bruk av caspase-Glo 3/7 analyse (Promega) og CellTiter-Glo analyse (Promega), henholdsvis. Den «Caspase-aktivitet per celle» ble oppnådd ved å normalisere total Caspase aktivitet til celleantall.
immunoblotanalyse
Hele celleekstrakter ble fremstilt ved resuspendering av pelletene i RIPA-buffer (150 mM NaCl , 1% NP-40, 0,5% natriumdeoksycholat, 0,1% SDS, 50 mM Tris HCl, pH 8) inneholdende proteaseinhibitorer (100 uM PMSF, 1 mM benzamid med 2,5 ug /ml pepstatin A, 10 ug /ml Leupeptin, og 10 mikrogram /ml aprotinin) og fosfatase-hemmere (1 mM hver NaF, Na
3VO
4 og Na
4P
2o
7). Proteinkonsentrasjonen ble målt ved anvendelse av BCA proteinanalysesettet (Pierce) i henhold til produsentens protokoll. Like mengder protein, ble underkastet SDS-PAGE og overført til en nitrocellulosemembran (Millipore). Overføringseffektivitet og lik belastning ble bekreftet av Ponceau S farging. Etter primære og sekundære antistoff behandlinger, ble proteinene visualisert ved hjelp SuperSignal West Pico løsninger (Thermo Scientific). Anti-MCM2 og anti-S53-fosfor-MCM2 antistoffer ble kjøpt fra Bethyl Laboratories; anti-β-actin var fra Sigma; anti-mus og anti-kanin HRP antistoff fra GE Healthcare; og anti-Cdc7 og anti-Dbf4 antistoffer ble tidligere beskrevet [26].
Thermal Stability Shift Assay (TSA)
Alle reaksjoner ble inkubert i et 10 ul sluttvolum og analysert i 96- brønners plater ved bruk av 20 x SYPRO Orange (Invitrogen) og 200 ug /ml renset DDK [50]. Reaksjoner ble inkubert med inhibitor-forbindelser på is i 30 minutter. Forbindelser fra fire kinase inhibitor bibliotek (Calbiochem I, II, III, Tocriscreen Inhibitor Verktøykasse) ble screenet ved 20 uM for T
m øker med en total DMSO-konsentrasjon på 2% eller mindre. Termiske smelte eksperimenter ble utført ved anvendelse av StepOnePlus Real-Time PCR System (Applied Biosystems) smelter kurve program med en rampehastighet på 1 ° C og temperaturområde fra 15 ° C til 85 ° C. Påfølgende TSA på 12 treff som oppnås ble utført som ovenfor, men i tre eksemplarer, og ved hjelp av en 200-gangers spekter av inhibitorkonsentrasjoner. Dataanalyse ble utført som beskrevet [50]. Melting temperaturer (T
m) ble beregnet ved å montere den sigmoidal smelte kurven til Boltzmann ligningen ved hjelp GraphPad Prism, med R
2 verdier av 0,99. Forskjellen i T
m verdiene som er beregnet for reaksjoner med og uten forbindelser er AT
m.
Resultater
DDK hemmere utstillingen svært ulike cellulære potenser
skjermet et panel av 15 brystkreftcellelinjer for Cdc7 og Dbf4 uttrykk ved hjelp av monoklonale antistoffer mot hverandre underenhet [26]. De fleste av disse uttrykker DDK underenheter tilsvarende eller høyere enn MCF10A, en udødeliggjort, men ikke-tumorigen mammary epitelcellelinje som tjente som en ikke-tumorkontroll (figur 2). Vi brukte PHA-767491 og XL413 å inhibere DDK i et panel av seks brystcancercellelinjer som overuttrykker DDK på ulike nivåer (merket med stjerne i figur 2). Begge forbindelser er blitt rapportert å ha anti-proliferative aktivitet i det lave mikromolare området [43], [49]. Som kontroller, sammenlignet vi disse resultatene til PHA-767491 behandling av HeLa-celler og XL413 behandling av Colo-205-celler, som hemmer DDK og induserer celledød. Siden Cdc7 kinase er en viktig protein, hemmer dens aktivitet bør betydelig treg eller arrest celleproliferasjon. PHA-767491 signifikant inhiberte proliferasjon i alle cellelinjene som ble testet (figur 3A, verdier plottes i forhold til bærerkontroller). PHA-767491 var mest effektive på HeLa og HCC1187 cellelinjer og hadde minst effekt på MCF-7 [43] og MDA-MB-453 cellelinjer: 2 ganger og 2,5 ganger hemmet, henholdsvis. I kontrast, XL413 var anti-proliferativ bare i Colo-205 celler (figur 3A).
immunoblotter viser uttrykket nivåer av Cdc7 og Dbf4 i tumorcellelinjer. β-aktin nivåer indikerer lik belastning av proteiner.
(A) Åtte kreftcellelinjer ble behandlet med 5 mikrometer av hver DDK inhibitor og celle levedyktighet ble målt 72 timer poste narkotika tillegg. For å bestemme den IC
50-verdier, ble HCC1954 celler behandlet med økende konsentrasjoner av PHA-767491 eller XL413 (B) og cellelevedyktigheten ble målt 72 timer legge medikament tilsetning. Colo-205-celler ble behandlet med økende konsentrasjoner av PHA-767491 eller XL413 (D) og cellenes levedyktighet ble målt 72 timer legge medikament tilsetning. Graden av apoptose indusert av forbindelsene i hver cellelinje relativt til bærerkontroll ble målt ved hjelp av Caspase 3/7 aktivitet og er indikert i (C, E). Alle data som representerer gjennomsnittet av minst tre separate målinger +/- SD og var svært reproduserbare på forskjellige dager.
Vi deretter undersøkt potens profiler av begge forbindelser i mer detalj ved hjelp av XL413-sensitive ( Colo-205) og XL413-resistente (HCC1954) cellelinjer. Celler ble inkubert i nærvær av økende konsentrasjoner av inhibitorene i 72 timer ved 37 ° C etterfulgt av cellelevedyktighet målinger. PHA-767491 inhiberte proliferasjon i begge cellelinjer med en IC
50 til 0,64 uM i HCC1954 celler og 1,3 uM i Colo-205-celler (Figur 3, B og D), i samsvar med den gjennomsnittlige 3,17 pM IC
50 verdi beregnes ved hjelp av et panel av 61 tumorcellelinjer [43]. I motsetning til dette, XL413 hadde en IC
50 på 22,9 pM i HCC1954 celler og 1,1 uM i Colo-205-celler (figur 3, B og D). I overensstemmelse med den data levedyktighet, PHA-767491 indusert apoptose i både HCC1954 og Colo-205-celler, men XL413 indusert apoptose bare i de Colo-205-celler (figur 2, C og E). XL413 var ikke en spesifikk hemmer av kolorektal kreft linjer fordi det hadde begrenset effekt på ytterligere to kolorektal kreftcellelinjer: XL413 måtte 40- til 60 ganger høyere IC
50 verdier enn PHA-767491 på disse linjene (Figur S1 i File S1).
PHA-767491 og Xl413 er potente DDK hemmere
in vitro
de fattige styrken på XL413 på de fleste tumorcellelinjer kan være fordi den syntetiserte forbindelsen er ikke en effektiv kinase inhibitor. For å teste denne muligheten, renset vi rekombinant DDK og deretter målt IC
50 verdier av både XL413 og PHA-767491 på renset kinase. Vi co-uttrykte His6-SUMO-Cdc7 og Dbf4 i bakterieceller, og deretter renset komplekset som beskrevet i Materialer og Metoder. I korthet DDK ble bundet til en Ni-NTA-kolonne fulgt av eluering og fjerning av His6-SUMO tag. Ukodet DDK ble deretter fraksjonert over en SP Fast Flow-kolonne etterfulgt av separering på en S-200 gelfiltreringskolonne. Kinasebestemmelser ble utført med renset DDK (figur 4A) i nærvær av økende konsentrasjoner av hver inhibitor (figur 4, B og C). Både PHA-767491 og XL413 var effektive DDK hemmere
in vitro
som vist tidligere [16], [42], [49] med IC
50 verdier på 18,6 nM og 22,7 nM. Siden begge forbindelser er effektive DDK hemmere, de relative celle levedyktighet profiler indikerer at XL413 er mangelfull i opptrer på mål inne i cellen.
(A) Coommassie-farget gel viser 1 mikrogram renset DDK fra bakterieceller. (Γ) –
32P ATP DDK kinasebestemmelser i nærvær av økende konsentrasjoner av PHA-767491 (B) eller XL413 (C). Kinase aktiviteter representerer gjennomsnittet av fire uavhengige målinger +/- SD på forskjellige dager.
XL413 er defekt i hemme DDK avhengig MCM2 fosforylering i HCC1954 celler
Effektiv cellulært opptak av DDK hemmer skal kompromisse DDK aktivitet
in vivo
. Blant de mange målene for DDK er komponenter av den replikative Mcm2-7 helikase. Serine 53 av MCM2 subenhet er en godt karakterisert målområde for DDK mediert fosforylering [24]. Vi kvantifisert nivåer av fosforylering på dette nettstedet som et mål på DDK aktivitet
in vivo
. HCC1954 cellene ble inkubert i nærvær av 1 uM PHA-767 491, 2 uM PHA-767 491 eller 5 uM XL413. Cellene ble så høstet ved 0, 24, 48 og 72 timer etter medikament tillegg til å måle levedyktige celler og MCM2 fosforylering ved immunblotting.
2 uM PHA-767491 fullstendig opphevet MCM2 fosforylering av 24 timer i HCC1954 celler (figur 5A), tilsvarende med sin innvirkning på cellevekst og levedyktighet (figur 5B). I den samme cellelinje, 1 uM PHA-767491 resulterte i meget liten rest MCM2 fosforylering fra 24 til 72 timer, og var også effektiv til å inhibere celle-levedyktighet og celledød. I motsetning til dette ble XL413 ikke inhiberer MCM2 fosforyleringen i 24 timer, selv ved en høyere konsentrasjon av 5 uM (figur 5A), og det var bare en beskjeden reduksjon i MCM2 fosforylering i 72 timer. Denne effekten ble også sett i celleviabilitet assay, hvor XL413 behandlede celler vokste bare litt dårligere enn de bæremiddelbehandlede celler (Figur 5B).
(A) immunoblot som viser MCM2 fosforylering i HCC1954 celler eller (C) Colo -205 celler i nærvær av DMSO, PHA-767 491, eller XL413. (B) Celleproliferasjon profil HCC1954 celler eller (D) Colo-205-celler i nærvær av DMSO, PHA-767 491, eller XL413. De celleviabilitet dataene representerer gjennomsnittet av minst to målinger +/- SD og var svært reproduserbare på forskjellige dager.
Da begge forbindelser var effektive inhibitorer i Colo-205-celler, undersøkte vi MCM2 fosforylering i disse cellene etter legemiddeltilsetningen. Igjen, 5 uM PHA-767491 fullstendig opphevet MCM2 fosforylering av 24 timer, og var svært effektive i å indusere celledød (figur 5, C og D). Imidlertid, i motsetning til i HCC1954 celler, XL413 var en meget effektiv inhibitor av DDK aktivitet i Colo-205-celler. 5 uM av XL413 fullstendig opphevet MCM2 fosforylering ved 24 timer, og var også like effektiv som PHA-767491 å indusere celledød (figur 5, C og D). Disse resultater viser at de to DDK inhibitorer oppviser meget forskjellige profiler i cellelinjer som til tross for at begge forbindelser er meget effektive kinaseinhibitorer
in vitro
. Våre data tyder på at XL413 ikke tas opp effektivt i mange cellelinjer eller metaboliseres raskt eller modifisert til en inaktiv form.
Skjerm å bestemme kryssreaktivitet kjente kinase hemmere med DDK
For å identifisere ytterligere kjemiske strukturer som er i stand til å inhibere DDK, testet vi et panel av ~400 kinaseinhibitorer mot renset DDK i en termisk stabilitet skiftanalyse (TSA) [50]. I denne analysen ble inhibitorforbindelser inkubert med renset DDK og deretter screenet med en økende temperaturgradient for å bestemme det punkt hvor de denaturere (i forhold til DDK alene) ved å følge fluorescens forandring av fargestoffet SYPRO Orange, som binder seg til hydrofobe overflater på utfoldet proteiner. Inhibitor-forbindelser som binder innenfor DDK ATP-bindende lomme er antatt å stabilisere kinase, og AT
m verdier (se Materialer og Metoder) av 2 ° C eller høyere anses signifikante treff. Eksperimentelle resultater av 400 sammensatte skjermen er oppført i Figur S2 i File S1. Vi identifiserte 12 forbindelser som forårsaket betydelige temperatur turnus:. 11 forbindelser økte T
m, og en forbindelse (Genistein) reduserte T
m (tabell S1 i File S1)
For å estimere affinitet av hver forbindelse for DDK vi målt AT
m verdier for disse 12 forbindelser på tvers av en 200-fold spekter av inhibitor konsentrasjoner og sammenlignet disse verdiene til PHA-767491 (en bestemt DDK hemmer), staurosporin (et bredt spekter protein kinase inhibitor ), og DMSO som vehikkelkontroll. Dataene vist i figur 6 representerer et gjennomsnitt av tre uavhengige målinger. Forbindelsen genistein, som er en EGFR-inhibitor, var uvanlig at det økte AT
m ved lavere konsentrasjoner inhibitor og deretter redusert AT
m ved 5, 10 og 20 uM konsentrasjoner. Den første skjermen ble gjennomført med 20 mikrometer hemmer og forklarer hvorfor genistein ble scoret som redusere T
m. Kanskje denne forbindelsen binder til DDK ATP bindende lommen, men ved høyere konsentrasjoner forstyrrer Cdc7-Dbf4 bindende. Hver av de andre 11 forbindelser har positive At
ms. Undersøkelse av det sammensatte titreringer viser at tre-inhibitorer hadde sammenlignbare profiler til PHA-767 491 ved at de induserte en AT
m ~ 2 eller mer som begynner ved en 1 pM konsentrasjon: en Rho-kinase inhibitor (Rockout), en proteinkinase R (PKR) inhibitor, og en Chk1 kinase inhibitor (SB218078). Fire ytterligere forbindelser, den JAK3 inhibitoren VI, PI3-Ka-inhibitor VIII, UCN-01 og K-252a ga en 3-ganger eller høyere AT
m ved 5, 10 og 20 uM-konsentrasjoner.
økende konsentrasjoner av 12 treff forbindelser oppdaget i en 400 sammensatt skjerm (tabell S1 i File S1) ble screenet mot renset DDK hjelp av TSA. PHA-767491 (DDK spesifikk inhibitor), staurosporin (bredt spektrum kinase inhibitor) og DMSO er vist som kontroller. Dataene representerer gjennomsnittet av triplikate målinger +/- SEM.
Strukturene av de beste forbindelser i TSA skjerm er vist i figur 7, og viser et bredt spekter av strukturelle klasser. K-252a er naturlig forekommende alkaloid som er beslektet med staurosporin som inhiberer et bredt spekter av proteinkinaser blant serin /treonin-kinaser og tyrosin-kinaser av trk-familien [51], [52]. Så, er inkluderingen av K-252a i denne listen (som staurosporin) kanskje ikke overraskende. Siden det er svært sannsynlig at hemmere vi gjenvunnet i TSA skjermen stabil DDK av deres evne til å binde i ATP-bindende lommen og hemme DDK, utførte vi kinase analyser ved hjelp av de seks øverste forbindelser. Kinase analyser avslørte at de er faktisk DDK hemmere (Figur S3 i File S1). Den Chk1 (SB218078) og PKR hemmere var de beste forbindelsene
in vitro Hotell og hemmet DDK med IC
50-årene av 19,3 nM og 67,5 nM (figur 8A og Figur S3 i File S1). Interessant, At
M profiler av de Chk1 og PKR hemmere ser påfallende like PHA-767491, øke muligheten for at disse forbindelsene hemme DDK i cellene. Selv om SB218078 er avledet fra staurosporin, er en potent inhibitor av Chk1 [53]. Strukturene av de andre topp hits, PKR hemmer og Rockout, ikke er utledet fra staurosporin og også forskjellig fra kjente DDK hemmere (figur 1).
strukturer av de 7 øverste forbindelser fra TSA hemmer titreringer er vises sammen med PHA-767491 og XL413 strukturer for sammenligning (se tekst og tabell S1 i File S1 for ytterligere detaljer). Tre forbindelser er avledet fra staurosporin (nederste rad), men de gjenværende fire forbindelser som faller inn i forskjellige strukturelle klasser.
IC
50 Verdiene for PKR inhibitor (vist i figur 7) ble bestemt mot renset DDK (A) og HCC1954-celler (B). (C) caspase 3/7 analyser som viser at apoptose ble sterkt indusert ved 24 timer etter PKR inhibitor tillegg, og dette ble eliminert etter pan-caspase inhibitor z-VAD. PKR-inhibitor fører til en tilsvarende reduksjon i levedyktighet på HCC1954 celler til PHA-767491 over tid (D) og inhiberer også MCM2 fosforylering i celler, en kjent DDK mål (E). Målingene i panelene A-D representerer gjennomsnitt av minst to målinger +/- SD og var svært reproduserbare.
Vi testet om PKR og Chk1 hemmere vil endre cellevekst og hemme MCM2 fosforylering i den HCC1954 brystkreftcellelinje, noe som ville være et sterkt bevis på at de inhiberer DDK i celler. Økende mengder av den PKR inhibitor ble inkubert med HCC1954 celler i løpet av 72 timer, noe som resulterte i en stor reduksjon i antallet levedyktige celler i forhold til bærerkontroll (figur 8B, IC
50 1,7 uM).
