Abstract
Tissue lokalisering av genuttrykk er stadig viktigere for nøyaktig tolkning av store datasett fra uttrykk og mutasjonsanalyser. For dette formål har vi (1) som er utviklet en robust og skalerbar fremgangsmåte for generering av mRNA hybridiseringsprober, noe som gir mer enn 95% first-pass-suksessraten i sonden generasjon til ethvert humant mål-gen og (2) tatt i bruk en automatisert fargeprosedyre for analyser av formalinfiksert parafin-embedded vev og vev mikromatriser.
in situ
mRNA og protein uttrykk mønstre for gener med kjente samt ukjente vev uttrykk mønstre ble analysert i normale og maligne vev for å vurdere prosedyre spesifisitet og om
in situ
hybridisering kan brukes for å validere nye antistoffer. Vi viser samsvar mellom
in situ
transkripsjon og protein uttrykk mønstre av kjente sykdomslære biomarkører
KRT17
,
CHGA
,
MKI67
,
PECAM1 Hotell og
VIL1
, og gir uavhengig validering for nye antistoffer til biomarkører
BRD1
,
EZH2
,
JUP Hotell og
SATB2
. Denne studien gir grunnlag for omfattende
in situ
genet sett eller transkriptomet analyser av menneskelige normale og tumorvev
Citation. Kiflemariam S, Andersson S, Asplund A, Pontén F, Sjöblom T (2012) Scalable
In Situ
Hybridisering på Tissue Arrays for validering av Novel Kreft og vevsspesifikke biomarkers. PLoS ONE 7 (3): e32927. doi: 10,1371 /journal.pone.0032927
Redaktør: Rakesh K. Srivastava, The University of Kansas Medical Center, USA
mottatt: 19 september 2011; Godkjent: 05.02.2012; Publisert: 08.03.2012
Copyright: © 2012 Kiflemariam et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet med tilskudd fra det svenske Cancer Foundation [11 0186] og Beijer Foundation til TS, og fra Knut og Alice Wallenberg-stiftelsen [2002,0087] til FP. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Nøyaktig og bestemt vev lokalisering av genuttrykk er instrumental for riktig tolkning av transkriptom data fra komplekse vev som pasient svulster. Den raske oppbyggingen av exome mutasjons data fra svulster gir også nye mulige terapeutiske mål, og det er derfor viktig å undersøke vev genuttrykk å forutsi effekter og bivirkninger av nye kreftbehandlingen. Spesifisitet validering av diagnostiske og terapeutiske antistoffer er et annet program der
in situ
genuttrykk analyser kan bidra viktig kunnskap. For å gjøre optimal bruk av slik
in situ
genuttrykk analyser i kreft biologi, man trenger (1) metoder for lettvinte og effektiv produksjon av sonder til enhver genet mål, og (2) automatisert og robuste prosedyrer for farging av formalinfiksert parafin-embedded (FFPE) vev og microarray (TMA).
i situ hybridisering (ISH) teknikker ansette merket RNA-prober for å analysere uttrykk og lokalisering av spesifikke mRNA transkripter i vev på celletype oppløsning . Slike sonder blir typisk generert av
in vitro
transkripsjon fra plasmid eller RT-PCR-produktene, i nærvær av en hapten konjugert base så som digoksigenin-UTP. Etter hybridisering, blir de bundne prober detektert ved kromogene anti-hapten-immunohistokjemi. Mens frosne vevssnitt er mest brukt i mRNA ISH, kan arkiv FFPE- vev og microarray også benyttes [1]. Som mRNA ISH er teknisk vanskelig og omfatter mange eksperimentelle trinn, har flere forskjellige automasjons formater blitt utviklet. Den Tecan GenePaint systemet er et åpent robot-system som med hell har blitt brukt til å kartlegge mus transkriptomet i frosne vev [2], [3]. I korthet blir de Prehybridisering, hybridiserings- og signaldeteksjonsreaksjoner utføres i et gjennomstrømnings-kammer hvor en automatisert løsningsmiddelsystem gir ulike løsninger i parallell. Dette systemet sammen med oppdagelsen teknologien muliggjør en daglig gjennomgang av opptil to hundre lysbilder [4]. Proteome omfattende innsats har allerede demonstrert muligheten for storskala FFPE farging [5], [6]. Samkjøre protein og mRNA uttrykk vil gi en uavhengig validering verktøy for både immunhistokjemi (IHC) og ISH, og muliggjøre oppdagelsen av falske positiver av begge metodene.
For å få en fleksibel måte å analysere vev uttrykk for store gensettene i FFPE microarray, vi skapt en enkel og skalerbar PCR-basert prosedyre for generering av mRNA-prober til enhver target-genet i den samme cDNA biblioteket og videreutviklet et automatisk fargings system, hvor 48 gener kan bli behandlet i 48 vev eller TMA i en enkelt løp. Vi deretter validert spesifisitet og skalerbarhet av denne tilnærmingen ved parallell ISH og IHC rettet mot kjente biomarkører i patologi. Til slutt viser vi spesifisitet av antistoffer mot nye vev-spesifikke eller kreft biomarkører som bruker
in situ
hybridisering.
Resultater
Teknologi optimalisering
Sytten gener ble valgt til å representere veletablerte patologi biomarkører eller nye vevsspesifikke eller kreft biomarkører oppdaget innen human Protein Atlas-prosjektet [5]. Disse inkluderte bromodomain inneholder en (
BRD1
), chromogranin-A (
CHGA
), histon-lysin N-metyltransferase (
EZH2
), familie med sekvenslikhet 174 medlem B (
FAM174B
), glutamat decarboxylase 1 (
GAD1
), janus kinase 3 (
JAK3
), krysset plakoglobin (
JUP
), keratin 17 (
KRT17
), v-ja-en Yamaguchi sarkom viral relatert onkogen homolog (
LYN
), MIX1 homeobox-lignende en (
MIXL1
), antigen ki- 67 (
MKI67
), fosfodiesterase 6A (
PDE6A
), plate endotelceller adhesjonsmolekyl 1 (
PECAM1
), protein tyrosin fosfatase type C (
PTPRC
), spesielt AT-rik sekvens-bindende protein 2 (
SATB2
), villin1 (
VIL1
) og sink finger protein 473 (
ZNF473
). Ønskede PCR produktene og RNA-prober ble oppnådd for alle genene (Figur S1).
Vi neste fastslått om RNA probe lengde påvirker følsomhet eller spesifisitet av ISH signaler ved hjelp av to ulike tilnærminger. I den første tilnærmingen, RNA prober for
CHGA Hotell og
KRT17
ble fragmentert i to eksemplarer ved hjelp av alkaliske og metall ion-katalysert metoder for å undersøke om kortere probe lengden vil gi en høyere signal på grunn av bedre vevspenetrasjon. Begge protokoller ble tilpasset for bruk med DIG-UTP-merkede RNA-prober. Ingen signifikant forskjell i signal kan bli sett mellom fragmenterte og ufragmentert prober ved evaluering farging i normal tykktarm, nyre, lever, milt og mandel (data ikke vist). Den andre tilnærmingen var å undersøke om lengre sonder vil ha en innvirkning på ISH signal. Tre forskjellige prober målretting
PDGFRB plakater (platelet-derived growth factor receptor beta) med lengder på 500 bp, 1000 bp og 1500 bp ble generert. Ingen signifikant forskjell i signal mellom sondelengdene kunne ses ved evaluering av farging i nyre glomeruli, men bakgrunnen ble økt til 1000 bp og 1500 bp-prober når en sammenligner sense og antisense-RNA-prober (data ikke vist) [7].
Fastsettelse av GenePaint system for menneskelig vev arrays
for å legge til rette for en storstilt tilnærming, optimalisering av proteinase K-konsentrasjon ble utført. Tre gener med ulike uttrykk nivåer,
PDGFRB, KRT17 Hotell og beta aktin (
ACTB
), ble valgt og evaluert på en vev microarray med normal kolon, nyre, lever, milt og mandel. Konsentrasjonene som ble testet var 2,5, 5, 10, 20, 40, 60, 80 og 100 ug /ml. For
ACTB
en konsentrasjon på 40 mg /ml var tilstrekkelig til å gi klare og tydelige signaler uten å påvirke vev morfologi. For
KRT17 Hotell og
PDGFRB
, en proteinase K-konsentrasjon på 60 mikrogram /ml var optimalt når man sammenligner alle de forskjellige vev på tabellen, og ble derfor valgt for videre eksperimenter. For å visualisere gener uttrykkes ved lave nivåer, ble dobbelt sykluser av tyramide basert signalforsterkning innført. Videre har betydningen av ferske vevssnitt er konstatert siden svak eller ingen signal ble sett på vevssnitt eldre enn 3 uker (data ikke vist).
Validering av ISH flekker på vev arrays
sammenhengende vevssnitt ble farget med sans probe ISH, antisense probe ISH og immunhistokjemi for å sammenligne genuttrykket på mRNA og protein nivå. For en undergruppe av de analyserte genene (
CHGA
,
KRT17
,
LYN
,
MKI67
,
PDE6A
,
PECAM1
,
PTPRC Hotell og
VIL1
), immunhistokjemi-baserte protein uttrykk mønstre er godt kjent og etablert. Disse målene ble anvendt for å sammenligne ekspresjon av proteinet, og de tilsvarende transkripsjoner for validering av skalerbare ISH prosedyre. Den mellomliggende filamentprotein KRT17 var, som ventet, sterkt uttrykt i et bredt utvalg av differensierte epitelceller, som demonstrert ved farging av mandel (Figur 1, A-C og fig S3) og i bronkier (figur S3). CHGA, en markør for nevroendokrine differensiering, viste sterk farging i nevroendokrine celler i tarmen (Figur 1, D-F), i pankreatiske øyer og endokrine organer som parathyroid (figur S3). Den godt karakterisert spredning markør Ki-67 uttrykkes i G1, S, G2 og M fasene av cellesyklusen, og ofte brukt for å vurdere prolifererende celler i tumorer. Prolifererende celler i bunnen av normale colonic krypter (figur 1, G-I), anal vulva og i tonsiller (figur S3) er vist. ISH signal for Ki-67 er lokalisert til spesifikke områder i kjernen stemmer overens med data fra mus [8]. PECAM1 ble uttrykt i endotelceller i de fleste organer, eksemplifisert ved rikt vaskularisert placenta (figur 1, J-L), endometrium (pre menopause) og lymfeknute (figur S3). VIL1 er et protein uttrykt i børste grensen av epitel og som sådan sterkt uttrykt i nyretubulene og kjertelceller i gastrointestinalkanalen, så som i tykktarm (Figur 1, M-O), appendix og tolvfingertarmen (fig S3). Videre, for
CHGA
,
PECAM1 Hotell og
VIL1
, to uavhengige RNA probe par (Tabell S1) ble brukt for kryssvalidering av sonde spesifisitet. Vevet og cellulær fordeling mønster av uttrykket for både mRNA og protein som var tilsvarende for disse fem genene, noe som bekrefter sensitiviteten og spesifisiteten av automatiserte in situ hybridisering på FFPE TMA. For PDE6A, IHC viste flekker i alveolene, skjelettmuskulatur, bronkie og celler i nyrene glomeruli. mRNA og protein korrelasjon ble bare sett i to tilfeller av skjelettmuskulatur. Etablerte antistoffer for LYN og PTPRC viste tydelig membran og cytoplasmatisk farge i lymfevev og kjertelceller i mage-tarmkanalen, og selektiv cytoplasmatisk farge i lymfoid vev, henholdsvis. Ingen korrelasjon ble sett mellom protein og mRNA uttrykk (figur S5). For
PTPRC
, mangel på ISH farging ble kryss validert med to uavhengige RNA probe par (Tabell S1).
ISH signalene blir sett på som blå /lilla flekker med kjerner kontra i metyl grønn, mens IHC signaler er i brun med hematoksylin counterstain.
A-C
: Keratin 17 (
KRT17
) i mandel,
D-F
: Kromogranin A (
CHGA
) i tykktarmen,
G-i
: Ki-67 (
MKI67
) i tykktarmen,
J-L
: Blodplate endotelceller adhesjonsmolekyl 1 (
PECAM1
) i placenta
M-O
: Villin-en (
VIL1
) i tykktarmen. Tissue matriser ble hybridisert med forstand kontroll sonder (A, D, G, J, M), antisense-prober (B, E, H, K, N), eller immunfarget med antistoffer (C, F, I, L, O) målretting respektive karakterutskrifter eller proteinprodukter. Alle bildene ble hentet fra lysbilder skannet med en 40 × objektiv.
Validering av nye antistoff biomarkører ved ISH på vev arrays
antistoff-avledet uttrykk i Human Protein Atlas-prosjektet foreslåtte enten en vev-spesifikk uttrykk eller klinisk nytteverdi i kreftdiagnostikk eller terapi for romanen antatte biomarkører
BRD1
,
EZH2
,
FAM174B
,
GAD1
JAK3
,
JUP
,
MIXL1
,
SATB2 Hotell og
ZNF473
. Derfor analyse av deres
in situ
mRNA og protein uttrykk i normalt vev kan gi validering av antistoff spesifisitet. BRD1 er kjent av immunhistokjemi til uttrykk i Purkinje og nerveceller i CNS, celler i seminiferus kanaler i testikkel, kjertelceller i prostata, binyrene og vedlegg, og makrofager i lungene, noe som ble bekreftet av ISH (Figur 2, A-C og Figur S4). EZH2 er en potensiell kreft biomarkør som overekspresjon av kjerneprotein er sett i en rekke av aggressive kreftformer, inkludert brystkreft, prostatakreft og glioblastoma multiforme [9]. Genekspresjon ble funnet på både transkripsjon (cytoplasmatisk farging) og protein (nukleær farging) i kjertelceller i tillegget (figur 2, D-F), tolvfingertarmen og eggleder (figur S4), celler i seminiferus kanaler i testikkel og muskelceller i hjerte muskler. JUP ble foreslått av IHC å være en vev-spesifikk biomarkør uttrykt i adnexal og epidermale celler i huden, noe som ble bekreftet ved ISH (figur 2, G-I) og i squamous epitelceller i mandel (figur S4). SATB2 er en roman biomarkør for tykktarmskreft [10], hvor genuttrykk profilering har vist sammenslutning av transkripsjonen downregulation med metastaser og dårlig prognose [11]. Antistoffer mot SATB2 viste nukleær farging i kjertelceller i nedre gastrointestinaltraktus, inkludert tykk krypten celler (figur 2, L). Samtidig rekke ISH bekreftet SATB2 transkripsjon uttrykk i cytoplasma begrenset til epitelet av tillegget, kolon (figur 2, J-K) og endetarm (figur S4), men ikke andre organer. For validering av disse fire nye biomarkører, ble to uavhengige RNA probe par som brukes for hvert gen (tabell S1). GAD1 viste lignende ISH og IHC-farging i Purkinje-celler og celler i den molekylære lag av lillehjernen, men ingen korrelasjon ble observert i andre vev. Spesifisiteten av de nye antistoffer mot
FAM174B
,
JAK3
,
MIXL1 Hotell og
ZNF473
kunne ikke bekreftes av ISH (figur S5). For
JAK3
, mangel på ISH farging ble kryss validert med to uavhengige RNA probe par, men for
FAM174B
,
MIXL1 Hotell og
ZNF473
, bare en sonde par kan være utformet på grunn av enten for korte proteinkodende regioner eller for høy homologi med andre gener (Tabell S1).
ISH signalene blir sett på som blå /lilla flekker med kjerner kontra i metyl grønn, mens IHC signalene er i brun med hematoksylin counterstain.
A-C
: Bromodomain inneholder en (
BRD1
) i binyrene,
D-F
: Histone-lysin N-metyltransferase (
EZH2
) i vedlegg (nukleær og cytoplasma farging for protein og mRNA, henholdsvis),
G-i
: Junction plakoglobin (
JUP
) i huden,
J-L
: Spesial AT-rik sekvens-bindende protein 2 (
SATB2
) i tykktarmen (nukleær og cytoplasma farging for henholdsvis protein og mRNA,). Tissue matriser ble hybridisert med forstand kontroll sonder (A, D, G, J), antisense-prober (B, E, H, K), eller immunfarget med antistoffer (C, F, I, L) rettet mot de respektive samtalelogger eller proteinproduktene . Alle bildene ble hentet fra lysbilder skannet med en 40 × objektiv.
Parallelle analyser av SATB2 protein og transkripsjon uttrykk på FFPE- kolorektal kreft arrays
Protein og mRNA uttrykk for SATB2 ble vurdert i kolorektal kreft ved hjelp av en rekke omfatter 60 primære svulster i duplikat. Stempler ble utført basert på en tre-karakterskala. Ett par ikke inneholdt tumorvevet, og av de resterende 59 prøver, 44 viste fullstendig samsvar mellom IHC og ISH ekspresjon i kjertelceller (figur 3). Tolv viste semi samstemmighet som farging ble observert, men med ulik intensitet, mens 3 prøver viste ingen sammenheng. ble observert Avtale mellom protein og mRNA uttrykk mønster i totalt 56 prøver (Cohens kappa test, κ = 0,68).
ISH signalene blir sett på som blå /lilla flekker med kjerner kontra i metyl grønn, mens IHC signaler er i brun med hematoksylin counterstain. Tissue matriser ble hybridisert med forstand kontroll probe (A, D, G, J), antisense-probe (B, E, H, K) eller immunfarget med antistoff (C, F, I, L). Alle bildene ble hentet fra lysbilder skannet med en 40 × objektiv.
Diskusjoner
Skalering ISH tilnærminger til genet sett eller exome dekkende analyser krever rørledninger for sonde syntese, hybridisering, analyse og merknader. Mens mye grunnarbeidet er utført innenfor rammen av store muse transkriptom studier på frosne vev, modifikasjoner er nødvendig for vellykket og reproduserbar ISH i FFPE- materialer. For facile sonde syntese, konkluderer vi med at forsiktige informatikk kombinert med bruk av en samlet menneskelig cDNA bibliotek (MegaMan) innebærer en høy første-pass suksessrate i sonde mal generasjon. Denne cDNA-bibliotek omfatter mRNA fra humane vev 32 og 34 humane cancercellelinjer sikrer en god representasjon av transkripter med forskjellige ekspresjonsnivåer og spleisevarianter. I parallelle prosjekter har denne metoden med hell blitt brukt til å generere en total på 700 prober med en første-pass suksessrate på mer enn 95% (data ikke vist) .Essential faktorer for vellykket farging som er forskjellig fra tidligere publiserte fremgangsmåter under anvendelse av frosne vev var bruk av ferskt kåret vev, ettersom svak eller ingen farging ble observert for eldre FFPE vevssnitt muligens på grunn av oksydasjon av RNA på den eksponerte overflate eller utilfredsstillende fikse tilstander som påvirker RNA-kvalitet, en høyere konsentrasjon av proteinase K, og to sykluser av tyramide biotin basert signalforsterkning. Selv om sistnevnte kan gi litt høyere bakgrunnsnivå, er det i vår erfaring en praktisk måte å øke signalintensitet.
spesifisitet og sensitivitet av ISH ble grundig evaluert av farging av påfølgende seksjoner fra samme TMA omfatter ~ 40 normale typer vev i menneskekroppen. ISH og IHC flekker mønstre av
KRT17
,
CHGA
,
MKI67
,
PECAM1 Hotell og
VIL1
var identiske på tvers av vev typer, er et utvalg av representative prøver vist i Figur 1 og Figur S3, og dermed gi sterk validering av ISH tilnærming. Denne høye graden av samsvar er i samsvar med tidligere observasjoner fra mus transkriptom prosjekter. Men til en etterlengtet forbedring muliggjør effektiv dataminering av ISH og IHC er et standardisert ontologi for annotering av menneskelig vev, i analogi til EMAP musen anatomi ontologi [3].
Antistoff sensitivitet og spesifisitet er en viktig bekymring i immunhistokjemi, spesielt i store prosjekter hvor flere antistoffer blir produsert mot mål med ukjente uttrykk mønstre. Spesifisitet validering av antistoffer til diagnostisk karakter kan utføres ved å oppnå høyt lignende fargingsmønster med et antistoff dannet mot et forskjellig epitop på det samme antigen [6], tap av signal i knock-out mus eller annet modellorganisme, eller svært lignende fargemønster med
in situ
hybridisering. Vi her demonstrere gjennomførbarheten av den sistnevnte fremgangsmåte ved organisme skala i den menneskelige, som TMA omfatter praktisk talt alle normale vev kan analyseres i en enkelt eksperiment. Vi var i stand til å verifisere spesifisitet av nye antistoffer til
BRD1
,
EZH2
,
JUP Hotell og
SATB2
, med to uavhengige RNA probe par, bekrefter at ISH kan gi selvstendig spesifisitet validering. Et utvalg av representative prøver er vist i figur 2 og S4. I parallelle forsøk, har vi ikke kunnet bekrefte spesifisiteten av de nye antistoffer mot
FAM174B
,
JAK3
,
MIXL1 Hotell og
ZNF473 plakater (figur S5) . Den semi-sammenheng mellom mRNA og protein uttrykk for
GAD1 Hotell og
PDE6A
kan skyldes enten antistoffspesifisiteten eller forskjeller i transkripsjons og translasjonsforskning prosesser. Mangelen på sammenheng mellom mRNA og protein uttrykk for
LYN Hotell og
PTPRC
kan skyldes biologiske og tekniske årsaker. Antistoffene for
LYN Hotell og
PTPRC
er rettet mot alle kjente isoformer av proteiner og RNA probe par er lokalisert i områder som er til stede i alle kjente transkripsjoner. Også for PTPRC ble to uavhengige RNA probe par brukt, viser mangel på ISH flekker mellom inter TMA gjentak. Vi mener derfor at mangelen på korrelasjon mellom mRNA og protein ekspresjon er mest sannsynlig på grunn av biologiske grunner, for eksempel post-transkripsjonell, translasjonell og post-translasjonelle modifikasjoner som påvirker nivået av mRNA og protein. Dessuten kunne mRNA forfall og protein halveringstid ha en innvirkning på mRNA og protein korrelasjon. Andre kilder til avvik mellom IHC og ISH kan være mangel på sensitivitet eller spesifisitet i enten en av fremgangsmåtene; dette gjør tolkningen av samstemmige fargemønstre som støttende av antistoff spesifisitet og uharmoniske mønstre som mangel på spesifisitet. I store innsats, bør antistoffer med konkordant ISH fargemønstre bli prioritert for videre analyser i motsetning til antistoffer med uharmoniske eller mangler ISH farging.
SATB2
, en kjernefysisk matrise-assosiert transkripsjonsfaktor og et medlem av familien av spesielle aT-rike bindende proteiner, har nylig blitt vist å bli uttrykt i normale celler i den nedre fordøyelseskanalen og i kreftceller av tykk- opprinnelse. På grunn av den meget spesifikke atomuttrykksmønster i normale og maligne celler i mage-tarmkanalen, ble SATB2 protein ekspresjon foreslått som et klinisk nyttig diagnostisk biomarkør for kolorektal kreft, er den tredje vanligste diagnosen kreft i verden [10]. Cohens Kappa test ble utført for å bestemme avtalen mellom IHC og ISH flekker, noe som viser god inter-rater reliabilitet. Den skalerbare teknologi presenteres her gjør det også mulig gen sett uttrykk analyser i menneskelig vev arrays. Vi ser for oss at tyrosin kinome, tyrosin phosphatome, andre gener i kreft stier, sammen med en rekke nye kandidat kreftgener avledet fra exome og genomsekvense utgjør prime mål for storskala
in situ
hybridisering basert karakterisering. Vi foreslår at omfattende og systematisk kartlegging av uttrykket
in situ
i normale og maligne menneskelig vev på celletype oppløsning vil gi verdifull kunnskap, spesielt i kreft narkotika utvikling som resultatene kan hjelpe til å forutsi effekter, veilede reposisjonering av tilgjengelig målrettet narkotika, og bidra til å forutsi respons på legemidler som hemmer flere ulike molekylære mål. Det gir også den tekniske grunnlaget for karakteruttrykk kartlegging av menneskelige protein-kodende gener, og potensielt også andre RNA arter, i systema hel-genom tilnærminger.
Materialer og metoder
Etikk uttalelse
bruk av HPA vev arrays i denne studien er dekket av HPA etisk tillatelse (UPN Uppsala 2002/577, 2005/338) og etisk tillatelse til etterforskerne (UPN Uppsala 2007/116). Identiteten til oppstilt vevsprøver er ikke kjent for etterforskere, vil heller ikke være utslipp til den offentlige sfæren.
Probe generasjon
Sonden generasjon prosedyren er skissert i Figur S2. Vi utviklet en intern programvare som velger transkripsjon regioner egnet for hybridisering probe design i gener av interesse ved å minimere homologi med utskrifter av andre gener i menneske RefSeq transkriptomet, slik at sonde sekvenser er tilstede i RefSeq transkripsjoner av genet av interesse , og med regioner å span ekson grenser. To uavhengige PCR-primersett for amplifisering av 500-600 nt produkter ble samlet for hvert gen ved hjelp av Primer3 [12]. En T7-promoter-sekvensen (5′-GCGTAATACGACTCACTATAGGG-3 «) ble innlemmet i 5»-enden av forover eller revers primer, henholdsvis, for å generere den forstand eller antisense riboprobe mal. Alle primerpar som brukes i sonden generasjon er oppsummert i tabell S1.
Stratagene største MegaMan human transkriptomet bibliotek, en samling av cDNA laget ved hjelp av mRNA fra humane vev 32 og 34 humane cancercellelinjer, ble anvendt for PCR (www. genomics.agilent.com). Hver reaksjon inneholdt 2 ul 10 × PCR buffer (166 mM (NH
4)
2SO
4, 670 mM Tris pH 8,8, 100 mM 2-merkaptoetanol, 67 mM MgCl
2), 2 ul dNTP (10 mM, GE Healthcare, Uppsala, Sverige), 1,2 ul DMSO (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA), 0,4 ul forover primer (50 uM, Sigma-Aldrich), 0,4 pl revers primer (50 um, Sigma-Aldrich), 0,2 pl Taq polymerase (5 U /mL, Invitrogen, Carlsbad, CA, USA), 1 ul MegaMan menneskelig transkriptomet bibliotek (160 ng /mL, (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA)) og MilliQ vann til et volum på 20 ul. Landings PCR-betingelser inkludert annealing temperaturer i området fra 64 ° C til 57 ° C; 96 ° C i 2 minutter; 3 sykluser med 96 ° C i 10 s, 64 ° C i 10 s og 70 ° C i 30 s; 3 sykluser med 96 ° C i 10 s, 61 ° C i 10 s og 70 ° C i 30 s; 3 sykluser med 96 ° C i 10 s, 58 ° C i 10 s og 70 ° C i 30 s; 41 sykluser med 96 ° C i 10 s, 57 ° C i 10 s og 70 ° C i 30 s, og en endelig forlengelse i 5 minutter ved 70 ° C. PCR-produktene ble kjørt på en 1,25% agarosegel for produktstørrelse bekreftelse. Sense og antisense riboprober merket med digoksygenin ble samlet ved
in vitro
transkripsjon av PCR-produkter med DIG RNA merking blanding (Roche, Rotkreuz, Sveits) i et totalt reaksjonsvolum på 5 ul. Ett mikrogram av hvert RNA-probe ble kjørt på en 6% TBE-urea gel (Invitrogen) for bekreftelse størrelse. Aksjer ble gjort ved å fortynne RNA-prober med MilliQ vann til 200 ng /mL og lagret i -80 ° C. Probe arbeidsløsninger av 20 ng /ul ble laget fra stamløsninger og lagres i -20 ° C.
RNA-prober ble fragmentert ved hjelp av to forskjellige metoder. For alkalisk katalysert fragmentering, noe som gir fragmenter som strekker 50-150 bp, ble RNA-prober spaltet med 0,2 M natriumkarbonatbuffer (pH 10,2) ved 60 ° C. Inkubasjonstiden er beregnet ved t = L
0-L
f /
k
L
0L
f, hvor t er tid i minutter inkubering, L
0 og L
f er første og siste lengder av sonden i kb, og
k
er hastighetskonstanten for hydrolyse (ca. 0,11 kb
med -1 min
1). Reaksjonene ble stanset ved tilsetning av natriumacetat (pH 4,7) og prøvene ble utfelt med etanol [13]. Ett mikrogram av hvert RNA-probe ble kjørt på en 6% TBE-gel for Urea størrelse bekreftelse. For metall ion-katalysert fragmentering, noe som gir fragmenter mellom 60-200 bp, ble RNA-prober inkubert med 100 mM sinkklorid i 100 mM Tris-HCl (pH 7) ved 70 ° C i 15 min. Reaksjonene ble stoppet med 0,5 M EDTA (pH 8) [14]. Ett mikrogram av hvert RNA-probe ble kjørt på en 6% TBE-gel for Urea størrelse bekreftelse.
Vevpreparering
Vevet matriser som ble brukt var standard matriser som benyttes for immunhistokjemi i Humant protein Atlas prosjekt (www.proteinatlas.org). Disse matriser omfatter triplikate 1 mm kjerner av 48 forskjellige typer av ikke-ondartede humane vev [15] og duplikat 1 mm kjerner av primær kolorektal kreft [10]. Microarray med FFPE- tumor og normalt vev ble seksjonert til 6 pm og montert på Superfrost Plus objektglass.
In situ hybridisering
vev seksjoner ble avvokset i xylen, etterfulgt av hydrering i en gradert etanol serien (100%, 95% og 80%, 3 min i hver). Hybridiseringen ble automatisert ved bruk av Tecan GenePaint (Tecan Ag, Männedorf, Sveits) i det vesentlige som beskrevet [2], [4], [16]. Alle prosedyrer ble utført ved romtemperatur med mindre annet er angitt. I korthet ble endogen peroksidaseaktivitet blokkert i 0,7% H
2o
2 i metanol, fulgt av en deproteinisering i 0,2 M HCl og fordøyelse med 60 pg /ml proteinase K (Roche). Vevssnittene ble pre-hybridisert i hybridiseringsbuffer (Ambion, Foster City, CA, USA) uten sonde i 30 minutter og deretter inkubert med 200 ng /ml digoksigenin-merkede riboprobe i 4 timer ved 64 ° C. Etter hybridisering, ble vevssnitt vasket i 5 x saltvann-natriumcitrat (SSC), 50% formamid og 0,1 x SSC. For å detektere bundet probe, ble et anti-digoksigenin antistoff (150 U /ml, Roche) konjugert til pepperrot peroksydase tilsettes. Etter fem vaskinger i blokkeringsbuffer, ble en tyramide biotin forsterkningstrinn utføres for å øke in situ deteksjonsfølsomheten (Perkin Eimer, Waltham, MA, USA). Det avsatte biotin ble påvist med alkalisk fosfatase-konjugert neutravidin (2 mg /ml, ThermoScientific, Waltham, MA, USA), som spalter det kromogene substrat nitro tetrazoliumsalter (NBT) 5-brom-4-klor-3-indolylfosfat (BCIP ) for å frembringe et blå /fiolett bunnfall på stedet av hybridisering. Etter 30 min utvikling tidsrom, ble den kromogene reaksjonen stoppet ved inkubering av vevssnittene i en buffer inneholdende EDTA, fulgt av fiksering i 4% PFA. Kjerner ble kontra med 2% metyl grønn og lysbildene var dehydrert i graderte alkoholer og montert i en plastbasert medium.
Immunohistochemistry
Kort, lysbilder ble deparaffinized i xylen, hydrert i gradert alkoholer og sperret for endogen peroksidase i 0,3% hydrogenperoksid fortynnet i 95% etanol. For antigen henting, en decloaking kammer (Biocare Medical, Walnut Creek, CA, USA) ble brukt. Objektglass ble neddykket og kokt i citratbuffer, pH 6 (Lab Vision, Värmdö, Sverige) i 4 min ved 125 ° C og deretter tillatt å avkjøle til 90 ° C. Automatisert IHC ble utført hovedsakelig som beskrevet [17], ved hjelp av et Autostainer 480 instrument (Lab Vision). Vevssnitt ble inkubert med primære antistoffer (Tabell S2) og et dekstran polymer visualiseringssystem (Ultra LP HRP polymer, Lab Vision) i 30 minutter hver ved romtemperatur, og snittene ble utviklet i 10 minutter ved hjelp av diaminobenzidin (Lab Vision) som kromogen. Alle inkubasjoner ble etterfulgt av en skylling i vaskebuffer (Lab Vision). Lysbilder ble kontra i Mayers hematoksylin (Histolab, Göteborg, Sverige) og dekselet gled hjelp Pertex (Histolab) som monteringsmedium.
