Abstract
glycolytic responsen hypoksiske celler er i hovedsak mediert av hypoksi induserbar faktor alfa (HIF-1α), men selv i nærvær av rikelig oksygen svulster vanligvis viser høy forekomst av glykolyse. Høyere nivåer av HIF-1α i tumorer er forbundet med en dårligere prognose og oppregulering av markører for epitel mesenkymale overgang (EMT) på grunn av HIF-1α handlinger. Vi har nylig vist at EMT skjer innen CD44
høy kreftstamcelle (CSC) fraksjon og at epitel og EMT cscs er preget av høy og lav ESA uttrykk, henholdsvis. Vi her viser at hypoksi induserer en markant forskyvning av CSC fraksjonen mot EMT fører til endrede celle morfologi, økt andel CD44
høy /ESA
lave celler, genekspresjonsmønster typisk for EMT, og forbedret Sphere dannende evne. Størrelsen på EMT fraksjoner tilbake for å kontrollere nivåer i normoxia indikerer en reversibel prosess. Overraskende, men selv under betingelser normoksisk en brøkdel av EMT cscs var tilstede og opprettholdes høye nivåer av HIF-1α, tilsynelatende på grunn av virkninger av cytokiner så som TNFa. Funksjonelt er dette EMT CSC fraksjonen viste redusert mitokondrie masse og membranpotensialet, som forbrukes mye mindre oksygen pr celle, og produserte markert reduserte nivåer av reaktive oksygenarter (ROS). Disse forskjellene i mønstrene av oksygen metabolisme av sub-fraksjoner av tumorceller gi en forklaring på den generelle terapeutiske motstanden cscs og for enda bedre beskyttelse av EMT cscs. De har også identifisere mulige mekanismer for manipulering av cscs
Citation. Gammon L, Biddle A, Heywood HK, Johannessen AC, Mackenzie IC (2013) Under Sett med kreftstamceller Skiller Egen i deres mønstre av oksygen metabolisme . PLoS ONE 8 (4): e62493. doi: 10,1371 /journal.pone.0062493
Redaktør: Yao Liang Tang, University of Cincinnati, USA
mottatt: 20 oktober 2012; Godkjent: 22 mars 2013; Publisert: 30 april 2013
Copyright: © 2013 Gammon et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet med tilskudd fra Fanconi Anemi Research Foundation, NC3Rs, Barts og The London Charity, og den norske Medical Research Council. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Tumorer er meget glykolytisk selv i nærvær av rikelig oksygen, den såkalte «Warburg-effekten» [1], [2]. Hypoksi induserbar faktor en alfa (HIF-1α) er den viktigste faktoren som regulerer celle hypoksiske svar [3]. Ved høye oksygennivå, er HIF-1α ubiquitinmolekyler og målrettet for nedbrytning mens ved lavere oksygennivå degradering er hemmet og HIF-1α translocates til kjernen hvor det dimerises med hypoksi induserbar faktor 1 beta (HIF-1β) og binder seg til hypoksi svar elementer (hres) av målgener som hjelper cellular tilpasning til hypoksi [4]. Overekspresjon av HIF-1α forekommer i en lang rekke av primære og metastatiske cancere [5], og er ansvarlig for en rekke tumor-relaterte egenskaper, inkludert en reduksjon av reaktive oksygenarter [6], økt radio-motstand [7] – [ ,,,0],9], og beskyttelse av celler fra legemiddelindusert apoptose [10] og senescence [11].
Tumor invasjon og metastasering har blitt stadig mer assosiert med kreft stamceller (cscs), en delmengde av kreftceller som er i stand til selvfornyelse, har tumor-initiering evne, og er motstandsdyktig overfor terapi [12], [13]. Både lokal tumorinvasjon og metastase til fjerne områder krever trekkende egenskaper ervervet gjennom epiteliale til mesenchymal overgang (EMT) av cscs [14] der epiteliale egenskaper er tapt og epitel-proteiner, slik som E-cadherin er nedregulert og av mesenchymale proteiner som vimentin og vri oppregulert [15]. Induksjon av EMT i brystcellelinjer resultater i cellene anskaffe markøren fenotype typisk for bryst cscs, større bevegelighet, og motstand mot terapeutiske midler [16], [17].
I HNSCC og flere andre karsinomer, under populasjoner av cscs har høy ekspresjon av CD44 [18] – [21]. Vi har nylig vist at det i cellelinjer avledet fra orale og hudkreft, oppstår EMT innenfor CD44
høy CSC fraksjon som resulterer i to CSC fenotyper, en som er epithelial og viser høy ekspresjon av epitelial spesifikt antigen (ESA), og en annen som har EMT egenskaper og lav uttrykk for ESA [22]. Cscs kan bytte mellom epitel og EMT fenotyper og begge fraksjoner initiere svulster etter
in vivo
murine transplantasjon [22]. Som flere studier har nå direkte knyttet hypoksi og høy HIF-1α til EMT [23] – [26], ønsket vi å vite om medfødte metabolske forskjeller knyttet til oksygen utnyttelse eksistere mellom epitel og EMT CSC fenotyper. Vi viser at lavt oksygennivå reversibelt øke størrelsen på EMT fraksjoner innen HNSCC cellelinjer og at sammenlignet med epithelial cscs (Epi CSC), EMT cscs har høyere nivåer av hypoksisk respons protein HIF-1α, selv under normoksisk forhold. Det er også store forskjeller i metabolismen av denne undergruppe med høyere nivåer av HIF-1α uttrykk i EMT cscs samkjøre med oppregulering av glykolytiske gener, en markert reduksjon i oksygenforbruk, redusert mitokondrie masse og membranpotensiale, og redusert produksjon av reaktive oksygen arter (ROS).
Materialer og metoder
Cell Kultur og hypoksisk Induction
HNSCC cellelinjer ble dyrket som beskrevet tidligere [19]. Med unntak av H357 [27], alle cellelinjer (CA1, Luc4, CaLH2, CaLH3) og normale orale keratinocytter (NOK2 NOK3) ble utledet i vårt laboratorium. Vev ble samlet inn med skriftlig informert samtykke etter en protokoll (Oral Cancer, 04 /Q0601 /53) godkjent av NE London The City etikkomiteen. Hypoksisk induksjon involvert dyrking celler i en InVivo1000 hypoksisk kammer (Ruskinn biovitenskap, Wales, UK) på 0,2% eller 2% O
2 med 5% CO
2. HIF-1α stabilisering anvendt 1 mM Dimethyloxalylglycine (DMOG) (Sigma) og inhibering 3- (5′-hydroksy-2′-furyl) -1-benzylindazole (YC-1) (Sigma) ved 10 uM eller 50 uM. For sfære formasjon assay ble platene belagt med poly-HEMA (Sigma) (12 mg /ml i 95% etanol) for å hemme festing av celler platet med 1000 celler /brønn i FAD medium med tilsetning av 1% methlycellose (Sigma). TNFa-behandlede celler ble dyrket i 6 eller 24 timer med 10 ng /ml rekombinant TNFa (R D systemer Cat # 210-TA-010).
Western blotting
Western blotting ble utført som tidligere beskrevet [28]. Protein kvantifisering anvendes en Bradford-analyse og antistoffer og fortynninger var som følger; HIF-1α – Mus 1:1000 Cat # 610958 BD, HIF-2α – Rabbit -1:500 Cat # ab20654 Abcam, β-Actin – Mus 1:10,000 Cat # ab8226 Abcam, GAPDH – Rabbit 1:10,000 Cat # ab9485 Abcam , PDK1- Mouse 1:1000 Cat # ab110025 Abcam, SOD2- Rabbit 1:5000 Cat # ab13533 Abcam, VHL -. Rabbit -1:1000 Cat # ab28434 Abcam, og TNFR1- Rabbit -1:1000 Cat # ab19139
real Time q-PCR
RNA ble ekstrahert som beskrevet tidligere [22], revers transkribert til cDNA utføres ved hjelp Hevet III første trådsyntese SuperMix (Invitrogen). cDNA ble normalisert mot referanse genet 28S-RNA. QPCR ble kjørt i en ABI7500 real-time PCR system som bruker strøm SYBR grønn mix (Applied Biosystems). Se saksdokumenter fil (Hjelpemiddel Informasjon S1) for forhold og fulle primer sekvenser.
flowcytometri
Celler ble analysert på en Beckton Dickenson (BD) LSR II og fluorescens-aktivert celle sortering (FACS ) ble utført på en BD Facs Aria. Dyrkede celler ble løsnet ved hjelp av Accutase (PAA), resuspendert i PBS ved 1 x 10
6 celler /ml og inkubert med antistoffer mot CD44 (klon G44-26, BD Biosciences) og ESA (klon HEA-125, Miltenyi Biotec) på 1:100 i 15 minutter. Cellene ble vasket en gang før re-suspendering i fersk PBS med DAPI (Sigma) på 200 ng /ml for å utelukke døde celler.
Oksygen og ROS Målinger
Den oksygenforbruk av fraksjoner cellelinje ble målt i 96-brønners plater oksygen biosensor (BD Biosciences, Oxford, UK Cat # 353830) ved å bruke protokollen tilpasset av Heywood et al [29], for kvantitative målinger. ROS farging ble utført på sorterte levende cellefraksjoner som bruker CellROX ™ (Invitrogen) ved 5 mM sammen med Hoechst 33342 på 20 ug /ml i 30 minutter som i henhold til produsentens instruksjoner. Kvantifisering ble oppnådd ved flowcytometrisk analyse av celler trippel farget for ESA, CD44 og CellROX ™.
Laktat og glukose Analyser
Laktat ble bestemt som tidligere rapportert, med 1 × 10
5 cellene resuspendert i 100 mL av medium (fenol rød gratis) og inkuberes i 8 timer. Laktat ble beregnet ved sammenligning med en standardkurve for laktat (Sigma L1750) i området 0-10 mM. Glukosekonsentrasjonen ble bestemt ved bruk av en glukosekoloanalysesett (Abcam, ab65333). Laktat gjæring fraksjonen ble beregnet ved sammenligning av utvist laktat med det teoretiske maksimum beregnet for glukose brukes.
MITOKONDRIELLE Analyser
Mitokondrie massen ble vurdert ved hjelp MitoTracker Grønn ™ (Invitrogen) i henhold til produsentens instruksjoner. Kulturer ble dyrket fra klonal tetthet, løsrevet fra fatet. og inkubert i 15 minutter ved 37 ° C med 50 nM MitoTracker (grønn) før vask og analyse. For indre membran mitokondrielle potensial (IMMP) cellesuspensjoner ble lastet med dil
1C (40 nM) (Invitrogen) og inkubert ved 37 ° C i 15 minutter før vasking en gang og re-suspendering i fersk PBS. Middelverdier for EMT og ikke-EMT CSC fraksjonene ble uttrykt som brøkdeler av verdiene for de tilsvarende foreldrepopulasjoner.
Cell Cycle Analysis
For cellesyklus analyser, cellesuspensjoner ble løst i 70 % etanol, vasket en gang i PBS og inkubert i DAPI (1 pg /ml) (Sigma) i 20 minutter sammen med antistoffer mot CD44 og ESA.
Statistical Analysis
Alle forsøk ble gjentatt en minst 3 ganger, og sammenligninger mellom verdier ble utført ved å bruke en to-halet paret t-test, med mindre annet er angitt. Feilfelt rapporteres som ± SEM.
Resultater
Langsiktig Hypoksi Fremmer en EMT Phenotype og Øker en undergruppe Preget av Redusert ESA
For å vurdere cellulære hypoksiske responser til senket oksygenkonsentrasjoner, 3 HNSSC cellelinjer (CA1, H357 og Luc4) ble dyrket i enten normoksisk (~ 20% O
2) eller hypoksisk (2% eller 0,2%) nivåer av oksygen før fremstilling av proteinlysatene for å vurdere HIF-1α stabilisering. Alle cellelinjer svarte på hypoksi med øket HIF-1α protein (fig. 1). For å bestemme effektene av hypoksi på størrelsen av EMT sub-populasjoner [22], ble cellene dyrket i henhold til hypoksi i opp til 21 dager og undersøkt for morfologiske endringer. Langtidskulturer (14-21 dager) viste en markert reduksjon i antallet celler som danner kohesive kolonier og en økning i antall av fibroblast-lignende celler (Fig. 2A). For å fastslå om dette morfologisk endring representert utvikling av en EMT befolkning ble cellene analysert av flowcytometri for CD44
høy /ESA
lav EMT fenotype tidligere identifisert [22]. For alle cellelinjer, langsiktig hypoksi ga opphav til en stor økning i CD44
høy /ESA
fraksjoner lave celle (Fig. 2B, Fig. 2C). Økning i EMT var mindre på 2% enn 0,2% oksygen. Den prolylhydroxylase inhibitor, DMOG, resulterte i stabilisering av HIF-1α, og også en viss stabilisering av HIF-2α (fig. 2D). Dette var forbundet med en økning i celler med en EMT-aktig, utseende og CD44
høy /ESA
lav-fenotype (Fig. 2D). For å finne ut om den er reversibel EMT ved fjerning fra hypoksi ble cellene dyrket under 0,2% oksygen i 21 dager tilbake til normoksisk forhold og vurderes av flowcytometri 7 dagers mellomrom. I alle linjer, størrelsen på CD44
høy /ESA
lav EMT brøkdel redusert over tid og etter 21 dager hadde returnert tilbake til nivåer av kontrollkulturer (Fig. 2E).
Western blot av proteinlysatene av CA1, H357 og Luc4 cellelinjer etter kultur i henhold normoxia (N), 2% og 0,2% oksygen
A.; fase kontrast av CA1, H357 og Luc4 celler dyrkes under normoksisk og 0,2% hypoksiske dyrkningsforhold for 21 dager (innfellinger: høyere forstørrelse av EMT-lignende celler). B; cytometriske analyser som indikerer en forskyvning i farging for CD44 (y-aksen) og ESA (x-aksen) av cellene som følge av hypoksi. C; analyse av økningen i EMT som følge av hypoksi. D; vekst av CA1 cellelinje i 21 dager med 1 mm DMOG resultater i morfologiske endringer (øverst), tilsvarende endringer i CD44 og ESA flekker (i midten), stabilisering HIF-1α, men liten endring i HIF-2α (nederst til venstre), og en øke i EMT fraksjon (nederst til høyre). E; tidsavhengig reduksjon i størrelsen av hypoksi-indusert EMT fraksjoner etter retur til normoksisk forhold.
Hypoksi induserer en cellepopulasjon med EMT-relaterte genuttrykksmønster og Økt Sphere Forming Evne
for å avgjøre om det utvidede CD44
høy /ESA
lav brøkdel indusert av hypoksi hadde genekspresjonsmønster typisk for EMT, subpopulasjoner av CA1 celler ble FACS sortert før RNA ekstraksjon. Sammenlignet med ESA
høy /CD44
høy (Epi CSC) fraksjon, CD44
høy /ESA
lav (EMT) fraksjoner viste, som tidligere rapportert [22], større uttrykk for EMT- relaterte gener Twist og vimentin og redusert uttrykk av E-cadherin (fig. 3A). Sfære dannende analyser, som er blitt anvendt som surrogat analyser for cscs [30], ble gjennomført for å bestemme om økningen i EMT indusert ved hypoksi økt antall celler med denne stamcelle egenskap. For alle cellelinjer, ufraksjonerte populasjoner av celler opprettholdt i hypoksiske betingelser i 21 dager dannet et større antall kuler enn celler dyrket i henhold til normoksisk betingelser (Fig 3B og amp;. 3C). Den HIF-1α inhibitor YC-en redusert basale nivåer av HIF-1α i henhold normoksisk betingelser (Fig 3D.) Og redusert av sfære forming evne (figur 3E.)
A.; fold endring i genekspresjon av EMT markører for CD44
høy /ESA
lave celler i forhold til CD44
høy /ESA
høye celler. B; representative prøver av sfære forming kulturer etter 21 dager med vekst i normoksisk og hypoksiske forhold. C; økning i sfæren formasjon etter hypoksisk kultur. D; reduksjon i basalnivåer HIF-1α i normoksisk kulturer av H357 etter tilsetning av YC-1. E; reduksjon i normoksiske sfære dannelsen følgende tillegg av YC-1 (venstre) og fasemikroskopi (til høyre) av kontroll og YC-1 (10 mm) behandlet sfære kulturer.
EMT underfraksjoner har økt HIF -1α og oppregulering av Anaerob metabolske gener
Under normoksisk forhold, kreft cellelinjer, som sine svulster opprinnelsesland, vanligvis viser en økt andel av energi fra glykolytiske prosesser sammen med høyere nivåer av HIF-1α [ ,,,0],5]. Normoksisk kulturer av HNSCC cellelinjer viste høyere basale nivåer av HIF-1α enn kr (fig. 4A). Den videre økningen i EMT celler indusert av hypoksi antydet at HIF-1α uttrykk kan variere mellom CSC underfraksjoner. EMT og Epi CSC fraksjoner ble derfor sortert fra CA1 og Luc4 cellelinjer for sammenligning med sine fraksjonerte befolkninger. Sammenlignet med Epi cscs eller foreldrepopulasjoner, EMT celler viste høyere nivåer av HIF-1α mens HIF-2α var høyere i Epi CSC fraksjonen (fig. 4B). Da de høyere nivåer av HIF-1α i EMT fraksjoner kan fremstilles ved enten redusert nedbrytning eller økt produksjon av proteinet, vurderte vi Von Hippel-Lindau protein (pVHL) som er rettet mot HIF-1α for proteasomal degradering. Men ingen forskjell ble funnet mellom fraksjonene for pVHL protein nivåer (fig 4C). Undersøke HIF-1α produksjon innenfor EMT brøkdel fant vi at budskapet for HIF-1α ble forhøyet (fig. 4D) som tyder på at økt produksjon i stedet for redusert nedbrytning fører til forhøyede nivåer sett i EMT celler. Produksjon av HIF-1α henhold til normoksisk betingelser økes som reaksjon på det inflammatoriske cytokin TNFa, [31] og dette cytokinet er også en potent induser av EMT [32]. For å vurdere effektene av TNFa på HIF-1α i vårt linjer cellelinjer i henhold til normoksisk betingelser ble cellene dyrket med TNFa etter 6 eller 24 timer. Ved begge tidspunkter, og i begge linjene som ble testet, forhøyede nivåer av HIF-1α ble observert (fig. 4E). Vi deretter undersøkt om Epi og EMT underfraksjoner svarte forskjellig til TNFa og funnet at høyere baseline nivåer av HIF-1α stede i EMT fraksjoner ble reist enda lenger ved TNFa (Fig 4F). Ingen virkning på den Epi CSC subpopulasjon ble sett noe som indikerer en selektiv effekt på EMT fraksjon, kanskje på grunn av de høyere mengder av TNFa-reseptor 1 (TNFR1) uttrykt ved disse cellene
A.; sammenligning av western blotting av normoksiske uttrykk for HIF-1α i kroner og HNSCC cellelinjer. B; HIF-1α og HIF-2α uttrykk i sorterte foreldre, EMT CSC og Epi CSC fraksjoner av CA1 og Luc4 celle linjer under normoxia. C; western blot for pVHL nivåer i sorterte fraksjoner av CA1-cellelinjen. D; PCR evaluering av HIF-1α uttrykt som EMT CSC nivåer i forhold til Epi CSC nivåer for CA1 cellelinje. E; responsen av HIF-1α nivåer av CA1 og Luc4 linjer til behandling med 10 ng /ml TNFa til 6 eller 24 timer under normoksisk betingelser. F; western blot for for HIF-1α og TNFR1 i sub fraksjoner av CA1 cellelinje følgende TNFa behandling. G; PCR evaluering av glykolytiske gener mål uttrykkes som EMT CSC nivåer i forhold til Epi CSC nivåer i CA1-cellelinjen. H; representant fase mikroskopiske bilder av Epi og EMT celler (til venstre) og sammenligning av fremover scatter for EMT og Epi CSC fraksjoner (til høyre).
For å vurdere om de høyere HIF-1α nivåer stede innenfor EMT cellene under normoksisk forhold korrelerte med økt uttrykk av HIF-1 nedstrømsgener, ble 3 glykolytiske mål undersøkt. Hexokinase II (Hex2), pyruvat dehydrogenase kinase 1 (PDK1), og Laktat dehydrogenase A (LDHA), ble alle funnet økt i EMT brøkdel i forhold til Epi CSC fraksjonen (fig. 4G). Som PDK1 er rapportert å påvirke andelen av glukose anvendes for fermenteringen til laktat vi undersøkt hvorvidt den observerte økning i HIF-1α og dens mål glykolytiske gener som korrelerer med endring i glukosemetabolismen og produksjonen av laktat. (Fig. S1 A) Ingen forskjeller ble sett i PDK1 protein nivåer mellom fraksjoner og undersøkelse av glukose forbruk og laktat produksjon avdekket en tilsvarende andel av glukose anaerobt metaboliseres for hver fraksjon, uavhengig av HIF-1α uttrykk (Fig S1B . C). Men det totale energibehovet kan være relatert til cellestørrelse og EMT cscs ble funnet å være mindre enn Epi cscs, en observasjon bekreftet av fremover scatter analyse (Fig. 4H).
oksygenforbruk er sterkt redusert i normoksisk EMT Cells og er assosiert med Altered Cell Cycle, Reduksjon i ROS, og mITOKONDRIELLE endringer
hypoksisk oppregulering av PDK1 av HIF1 påvirker mitokondrienes funksjon, oksygen metabolisme og ROS produksjon [6], [33]. For å vurdere hvorvidt den økte nivåer av HIF-1α stede i normoksisk EMT fraksjoner korrelerer med HIF-1α funksjoner i hypoksiske fraksjoner, sortert sub-fraksjoner av normoksisk kulturer ble analysert for oksygenforbruk. I løpet av den første timen, og vedvarer under hele analysen (fig. 5A), er forbruket av oksygen ved EMT fraksjoner av både CA1 og Luc4 cellelinjer var omtrent 25% mindre enn enten den Epi CSC fraksjoner eller foreldre populasjoner.
A; relative oksygenforbruk av EMT og Epi CSC fraksjoner sammenlignet med foreldrelinjen for den første timen (topp paneler) og for CA1 over 2 timer (nedenfor). B; Immunofluorescent bilder som sammenligner ROS-nivåer i EMT og Epi cscs kontra med Hoechst. C; flowcytometrisk analyse av gjennomsnitts ROS-nivåer av EMT og Epi cscs i forhold til foreldre celler. D; PCR fold forskjeller for SOD2 mellom EMT og Epi cscs. E; western blot for HIF-1α og SOD2 for de 3 under fraksjoner av CA1 cellelinje. F; mener mitokondrie masse av EMT og Epi cscs i forhold til foreldre celler. G; sammenligning av IMMP av EMT og Epi cscs i forhold til foreldre celler. H; cellesyklus profiler for EMT og Epi CSC fraksjoner av de 3 cellelinjer.
For å fastslå om redusert oksygenforbruk korrelert med redusert ROS-nivåer av EMT celler, levende EMT og Epi CSC celler ble sammenlignet med ROS markør CellRox ™ Deep Red Reagens. Mye mindre farging for denne markøren ble sett for EMT celler (fig. 5B) og cytometri kvantifisering av ROS i celler trippel farget for ESA, CD44 og CellRox ™ bekreftet mindre ROS i EMT CSC befolkningen (Fig. 5C). QPCR (Fig. 5D). Western blotting (figur 5E) viste at ROS-passiveringsmidlet superoksyddismutase 2 (SOD2) å være sterkt uttrykt i EMT cscs.
oksidativ fosforylering oppstår i mitokondriene, ble det antatt at endrede oksygenforbruk kan være relatert til endret mitokondriell stater i CSC subpopulasjoner. Forskjeller i total mitokondriemasse mellom celleunderpopulasjoner ble derfor vurdert av trippel-farging for ESA, CD44 og MitoTracker Grønn ™. For alle cellelinjer, EMT fraksjoner viste signifikant mindre mitokondriell masse (~ 10%) enn foreldre befolkning og en slående 40% reduksjon i forhold til Epi CSC befolkningen (fig. 5F). Som en markør for functon, ble indre mitokondriemembranen potensial (IMMP) vurdert ved lasting celler med Dil
1C (5). Dette viste en lavere IMMP (~ 10%) for EMT fraksjoner enn foreldrepopulasjoner og et enda lavere nivå sammenlignet med Epi cscs (fig. 5G). Vurdering av cellesyklus forskjeller mellom cellefraksjoner indikerte at Epi cscs hadde en tendens til å akkumuleres i G2, som tidligere vist [18], mens de fleste av EMT-celler var tilstede i G1 (fig. 5H).
diskusjon
Vi har nylig beskrevet heterogenitet i CSC sub-befolkningen [22] og at mens flertallet av cscs har et CD44
høy /ESA
høy celleoverflaten fenotype og uttrykke epiteliale markører, et variabelt størrelse brøkdel av cscs har gjennomgått EMT. Både Epi og EMT CSC populasjoner er selvfornyende
in vitro Hotell og er svulst initiere hvis transplantert
in vivo plakater (25). Men EMT cscs er motstandsdyktig mot anoikis og har større evne til å vokse i suspensjon som tumor sfærer, en egenskap som gir en surrogat analysen for denne pasientgruppen. Vurderes enten morfologisk eller som CD44
høy /ESA
lave celler, den lille EMT brøkdel vanligvis til stede i celle linjer under normoksisk vilkår øker sterkt i respons på hypoksi eller etter stabilisering av HIF-1α protein, endres i samsvar med tidligere rapporter [23] – [26]. Dette forstørret befolkningen viser en genuttrykk profil typisk for EMT og har forbedret sfære dannende evne. Etter akselerert degradering av HIF-1α er det en reduksjon i sfære formasjon. Samlet utgjør disse funnene tyder på at HIF-1α har en funksjonell rolle i å fremkalle og vedlikeholde CSC EMT fenotype.
HIF-1α er anerkjent for å drive cellene mot en metabolsk fenotype med redusert oksidativ metabolisme og økt laktat produksjon, mediert delvis av oppreguleringen av PDK-1 [6], [33]. Under normoksisk forhold, finner vi en ca 50% høyere rate av syntese av HIF-1α i EMT brøkdel og at dette korrelert med høyere proteinnivå. Tilsvarende nivåer av protein pVHL foreslått noen endring i frekvensen av nedbrytning, og vi vil derfor konkludere med at det høyere nivå av HIF-1α innenfor EMT opprettholdes ved økt produksjon. EMT er rapportert å være indusert av TGF-β1, interleukiner og inflammatoriske cytokiner slik som TNFa, som også er blitt rapportert å øke produksjonen av HIF-1α [31]. Vi har bekreftet lignende svar på våre cellelinjer og viser også at EMT celler reagerer selektivt til TNFa ved å øke nivået av HIF-1α. Dette impliserer viktigere virkninger av tumoren microenviroment i skiftende og opprettholde EMT fenotype og derfor progresjon og invasjon av tumorer.
HIF-1α produksjon har også blitt foreslått på grunn av en mate-forward sløyfe med PDK-1 [ ,,,0],34]. Men selv om vi fant økt melding for PDK-1 i EMT CSC sub-populasjon vi fant ingen endring i protein nivåer. Heller ingen forskjell ble funnet mellom de epiteliale og EMT fraksjoner i andelen av glukose metaboliseres til laktat som var omtrent 60% for alle underpopulasjoner, en prosentandel lik den som er rapportert av Warburg over 80 år siden, [1]. Imidlertid proporsjonal med EMT cscs størrelse, mengden av glukose bruk ville bli høyere, og dette danner sammen med markert reduksjon i oksygenforbruk, antyder en redusert avhengighet av oksidativ fosforylering med EMT-celler er mindre metabolsk aktive enn Epi cscs. Cellesyklus forandringer fant er også tyde på en mer hvile EMT-fenotype som er tidligere vist for EMT celler i HNSCC-linjer [35].
Under hypoksi, HIF1 som virker gjennom PDK1 [6] fører til en reduksjon i mitokondriell oksygenforbruk [33] og redusert produksjon av ROS. Over-uttrykk for PDK1 korrelerer også med dårlig prognose [36]. Høyere ekspresjonsnivåene av HIF-1α og PDK1 ble funnet i normoksiske CSC EMT befolkning ledsaget av en reduksjon i oksygenforbruk og lavere ROS-nivå, endres tilsvarende de som er rapportert for celler under hypoksiske betingelser. De høye nivåene av SOD2 i EMT cscs vil også fungere å inaktivere slike ROS som kan bli produsert. Papandreou og medarbeidere [33], undersøke ufraksjonerte svulstpopulasjonene, oppdaget ingen strukturelle endringer i mitokondriene. Men analysere forskjeller mellom CSC sub-fraksjoner viste en reduksjon i mitokondriell masse i EMT cscs sammen med en lavere relativ IMMP som peker til redusert mitokondriefunksjonen. Zhang et al [37] har rapportert undertrykkende virkninger av HIF1 på mitokondrie biogenese gjennom undertrykkelse av transkripsjon ved C-Myc [38], [39], og vi har tidligere rapportert nedregulering av C-Myc i normoksiske EMT sub-populasjon [ ,,,0],22]. PCR-analyser (data ikke vist) indikerer også nedregulering av C-Myc innenfor de forstørrede hypoksiske EMT fraksjoner.
cscs har flere unike egenskaper som skiller dem fra mesteparten av den differensierende cellepopulasjon [12], [18 ], [30] og nyere publikasjoner har knyttet oppkjøp av stamcelleegenskaper med EMT. For eksempel, induksjon av EMT i en ikke-tumorigen brystcellelinje ved behandling med TGF-β1 fører til kjøp av CD44
høy /CD24
lav celleoverflaten fenotype typisk for bryst cscs som har tumor-initiering og tumor -sphere forming evner [16]. Strålebehandling er mye brukt til behandling av HNSCC og lave nivåer av oksygen og cellulær ROS, sammen med høyere nivåer av antioksidanter, er kritiske mediatorer av redusert celledreping ved bestråling [12]. Lavt oksygennivå er assosiert med strålebehandling svikt [40], og det er derfor av spesiell klinisk interesse at hypoksisk induksjon av cscs inn i EMT fenotype vil øke enda mer generell motstand mot ulike terapeutiske modaliteter vist av cscs [17]. Foreliggende data utvider disse funnene, først ved å støtte nærvær, som tidligere rapportert [22], av to stamcelle fenotyper og for det andre, ved å vise flere andre egenskaper av EMT CSC fenotype som er sannsynlig å bli assosiert med øket terapeutisk motstand. De metabolske egenskaper av EMT CSC fraksjonen, og dens økning i størrelse i hypoksi, er derfor sannsynlig å opptre for å forbedre strålingsmotstand. Videre kan tregere cellesyklusen og mitokondrie reduksjon i EMT cscs også ha implikasjoner for apoptotiske respons på både stråling og anti-kreft narkotika. Det ser ut til at terapeutisk eliminering av mindre metabolsk aktiv EMT befolkningen vil kreve målrettet behandling og at modellene av EMT induksjon, gjennom både hypoksi og cytokiner kan gi en viktig plattform for utvikling av slike behandlinger.
Hjelpemiddel Informasjon
Figur S1.
Sub brøkdel glukose utnyttelse. EN; western blot for PDK1 nivåer av underfraksjoner. B; glukose bruk (til venstre), laktat utvist (i midten) og prosent av glukose metaboliseres til laktat (til høyre) i CA1 cellelinje og C; i Luc4 cellelinje
doi:. 10,1371 /journal.pone.0062493.s001 plakater (TIF)
Støtte Informasjon S1.
qPCR betingelser og Primere
doi:. 10,1371 /journal.pone.0062493.s002 plakater (DOC)
Takk
Vi takker Dr Gary Warnes for sin teknisk assistanse og dr Daniela Elena Costea for hennes kritiske innspill i studien design.
