Abstract
Glioblastoma (GBM) er en aggressiv, ondartet hjernesvulst vanligvis resulterer i at pasienten dør innen ett år etter diagnose; og de som overlever utover dette punktet vanligvis med tumorresidiv innen to år (5-års overlevelse er 5%). Den genetiske heterogenitet av GBM har gjort molekylær karakterisering av disse svulstene et område av stor interesse og har ført til identifisering av molekylære undergrupper i GBM. Tilgjengeligheten av sekvense plattformer som er både rask og økonomisk kan fremme adopsjon av svulst sekvensering i det kliniske miljøet, som potensielt kan føre til identifisering av klinisk handlings genetiske mål. I denne pilotstudien, som består av triplet prøver av normal blod, primærtumor, og tilbakevendende tumorprøver fra tre pasienter; vi sammenlignet evne Illumina hele exome sekvensering (ExomeSeq) og Ion AmpliSeq Comprehensive Cancer Panel (CCP) for å identifisere somatiske varianter i pasient paret primære og tilbakevendtumorprøver. Tretten gener ble funnet til båtplass varianter, de fleste som var eksklusivt til ExomeSeq data. Overraskende, ble bare to varianter identifisert av begge plattformene og de var plassert i
PTCH1 Hotell og
NF1
gener. Selv om foreløpig i naturen, understreker dette arbeidet store forskjeller i variant identifikasjon i data som genereres fra de to plattformene. Andre studier med større utvalg størrelser for å utforske videre forskjellene mellom disse teknologiene, og for å forbedre vår forståelse av den kliniske nytten av panel baserte plattformer i genomisk profilering av hjernesvulster
Citation. Virk SM, Gibson RM, kinoner-Mateu ME, Barnholtz-Sloan JS (2015) Identifisering av varianter i primære og tilbakevend Glioblastoma Ved hjelp av en kreftspesifikk Gene Panel og Whole Exome Sequencing. PLoS ONE 10 (5): e0124178. doi: 10,1371 /journal.pone.0124178
Academic Redaktør: Javier S. Castresana, Universitetet i Navarra, SPANIA
mottatt: 07.02.2015; Godkjent: 19 februar 2015; Publisert: 07.05.2015
Copyright: © 2015 Virk et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet: Illumina hele exome sekvensering av data er tilgjengelig fra Kreft Genome Atlas: https://tcga-data.nci.nih.gov/tcga. TCGA IDer som brukes i denne analysen var: TCGA-0957 (UH1), TCGA-1389 (UH2), TCGA-4065 (UH3). For å sikre etterlevelse av retningslinjer for beskyttelse av data fra forsøkspersoner, er tilgjengelig fra forfatterne på forespørsel og fra Ohio hjernesvulst Nevro-onkologi Disease teamleder Dr. Andrew Sloan Ion AmpliSeq data: [email protected] .
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av National Institutes of Health (www.nih.gov) 5R25CA094186 SMV, National Institutes of Health HHSN261201000057C og NIH /NCI 2P30 CA043703-23 JSB
konkurrerende interesser: forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Glioblastoma (GBM) er den hyppigst forekommende primær hjernesvulst hos voksne [1].. Selv betraktet som en sjelden kreft, med en insidensrate på 2 til 3 tilfeller per 100.000 mennesker i USA, bidrar denne svulsten uforholdsmessig til kreft sykelighet og dødelighet [1, 2]. Dagens standard behandling for GBM pasienter er kirurgisk reseksjon av primærtumor fulgt av adjuvant strålebehandling og kjemoterapi (dvs. «Stupp» protocol) [3]; imidlertid, på tross av aggressiv behandling, GBM går igjen i mange pasienter i løpet av to år [4]. På grunn av denne høye sannsynligheten for tilbakefall, er det viktig at vi får en bedre forståelse av de genetiske og molekylære endringer som skjer etter primær svulst reseksjon og behandling. Denne informasjonen kan være viktig for utviklingen av nye behandlinger med potensial til å øke overlevelsen av GBM pasienter.
De genetiske forskjeller mellom primære og tilbakevendende svulster har ennå ikke fullt preget, som har begrenset utviklingen av effektive målrettede terapi for å bekjempe tilbakevendende GBM [5]. Mutasjoner i spesifikke gener har vist seg å være utbredt i GBM tilfeller [6, 7]. På grunn av kjente inter- og intra- individuell heterogenitet i GBM [8, 9], betydelig innsats har blitt gjort for å ikke bare identifisere individuelt muterte gener, men å utvikle klassifiseringsordninger for å karakterisere svulstene med molekylær subtype [10, 11]. Det endelige målet er å bruke svulst klassifisering som en molekylær diagnostisk verktøy eller en prognostisk indikator på total overlevelse, til slutt fører til oppdagelsen av nye behandlingsstrategier.
Deep (neste generasjon) sekvense revolusjonerer vår forståelse av somatiske endringene som skjer i kreft genomet. Studier som sammenligner flere tumortyper er å belyse både forholdet mellom genetiske mutasjoner og krefttype, samt feilregulert reaksjonsveier som er felles på tvers av kreft eller spesifikke for undergruppe av krefttyper [12-14]. Selv om Illumina (Illumina, San Diego, California) dypt sekvense plattformen er den nåværende lederen i klinisk kreftforskning [15], andre teknologier som Ion Torrent (Life Technologies, Carlsbad, California) [16] er egnet for bredere screeningmetoder basert på redusert sekvense tid og kostnad per prøve [17]. I denne studien evaluerte vi muligheten av Ion AmpliSeq Comprehensive Cancer Panel (Life Technologies, Carlsbad, California) for å identifisere varianter i tre eksemplarer prøver (matchet blod, primære og tilbakevendende svulster) fra tre GBM pasienter og sammenlignet resultatene til hele exome sekvense data innhentet ved hjelp av Illumina plattform fra Kreft Genome Atlas (TCGA) prosjektet [18].
Materialer og Metoder
Studie pasienter og utvalgets behandling
GBM pasienter ble prospektivt rekruttert som en del av den pågående Ohio hjernesvulst Study (OBTS), en prospektiv studie av primær godartet og ondartet hjernesvulst pasienter fra de fire store akademiske sentre i delstaten Ohio. Skriftlig samtykke ble mottatt fra alle pasienter under innrullering i OBTS, som skjedde før prøven samlingen. Alle mennesker protokoller og prosedyrer ble godkjent av Institutional Review Board ved University Hospitals sak Medical Center, Cleveland, Ohio. Forbehandling blodprøver sammen med primære og tilbakevendende snap-frosset tumorvev (triplet prøver) ble samlet inn fra tre voksne pasienter. Figur 1 gir en oversikt over fremgangsmåter brukt i denne studien. Vevene ble frosset innen 15 til 30 minutter etter reseksjon. Prøver og klinisk informasjon ble samlet og arkivert i henhold til retningslinjer fastsatt av The Cancer Genome Atlas [18] og tumor renhet ble åpnet av histologisk vurdering av styre sertifisert nevropatologen. To seksjoner ble tatt fra hver pasientprøve (3 prøver /pasient X 2) og en samling av triplet prøver fra alle tre pasienter ble sekvensert på hver av de to sekvenseringsplattformene.
Sekvensering for AmpliSeq CCP prøvene ble gjort bruker Ion 318 Chip og hele exome sekvensering ble utført ved hjelp av Genome Analyzer II eller HiSeq 2000, begge fra Illumina.
blod ble trukket inn PAXgene DNA rør og DNA hentet ved hjelp PAXgene Blood DNA kit (Qiagen , Valencia, CA). Total DNA ble isolert fra de hurtigfrosset hjernetumorprøver ved bruk av Maxwell 16 DNA Purification kit (Promega, Madison, WI). DNA ble kvantifisert ved hjelp av Nanodrop ND-100 (Thermo Scientific, Waltham, MA) og qubit 2,0 fluorometer (Life Technologies, Carlsbad, California). Pasient-paret triplet DNA-prøver fra tre pasienter ble sekvensert ved hjelp av (i) hele exome sekvense på Illumina GA-IIX eller HiSeq 2000 [ExomeSeq] (Fig 1) som en del av The Cancer Genome Atlas-prosjektet som beskrevet i [18] og ( ii) Ion AmpliSeq Comprehensive Cancer Panel (Ion AmpliSeq CCP, Life Technologies). For dette ble fire amplicon bassenger per prøve som dekker 409 gener involvert i kreft kvantifisert (2100 Bioanalyzer DNA 7500, Agilent Technologies), utarbeidet og beriket for sekvensering på Ion Sphere Partikler (ISP) ved hjelp av Ion OneTouch 200 Mal Kit v2 (Life Technologies ) i Ion OneTouch ™ 2 System (Life Technologies). Malbasert ISPer ble kvantifisert (qubit 2.0, Life Technologies) og lastet inn i en Ion 318 Chip (Life Technologies) som skal sekvensert på Ion PGM hjelp av Ion PGM Sequencing 200 Kit v2 (Life Technologies). Den gjennomsnittlige lasteeffektivitet i Ion Torrent PGM var 88% i alle ni Ion 318 chips med et gjennomsnitt på 5,9 millioner leser per prøve. Individuelle prøver, fordelt på 5,8 millioner kartlagt sekvens leser, med en gjennomsnittlig leser lengde på 109 basepar. Den gjennomsnittlige target dekning i Ion Torrent PGM var 315x og 377x for blod- og kreftprøver, henholdsvis. I tilfellet med den TCGA Illumina hele exome sekvensering, den gjennomsnittlige target-dekning var 121x og 138x for blod og tumorprøver, respektivt. Signalbehandling og basen kall sekvens data generert fra Ion Torrent PGM ble utført med Torrent Analysis Suite versjon 3.4.2. Høy kvalitet lyder (en kvalitetsscore 20) fra FASTQ filer generert fra Ion Torrent PGM Server ble trimmet av adapter, strekkode, og primer sekvenser før justering til det menneskelige genom montering 19 (Hg19) sekvens
data Processing og Variant Identifikasjon
Før variant analysen ble FASTQ filer generert fra begge plattformer utsatt for flere forbehandlingsteknikker trinn. FASTQ filer ble justert til Human Genome Reference Consortium bygge 37 (Hg19) ved hjelp av Burroughs-Wheeler Alignment algoritme som implementeres i BWA programvarepakken v.0.7.2, noe som resulterer i produksjon av BAM-filer av justert leser. Etter genom justering ble Genome Analysis Toolkit v.3.2.2 brukes til å omstille leser rundt innsetting /slettinger og rekalibrere basen kvalitetspoeng for både ExomeSeq og AmpliSeq data. Den ExomeSeq leser ble utsatt for duplikat merking og fjerning før omstillingen og base rekalibrering trinn. BAM filene ble sortert i koordinere orden og BAM indeksfilene ble generert ved hjelp av Picard v.1.119. Variant kall ble utført i aligned leser sammen med pasientprøver, dvs. blod (normal) versus primær eller tilbakevendende svulstvev, ved hjelp MuTect v.1.1.4 [19] sammen med DbSNP 138. Varianter ble merket med ANNOVAR v.111214 (http : //www.openbioinformatics.org/annovar/) og lese justeringer ble visualisert ved hjelp av IGV v2.3.2 (https://www.broadinstitute.org/igv/). Variant analysen ble begrenset til varianter som forekommer i exome regioner.
Resultater
Pasient demografi og behandling
Blant de tre pasientene som inngår denne studien, gjennomsnittsalderen var 45 år, og gjennomsnittlig total overlevelse var 441 dager (tabell 1). Alle unntatt én pasient var mannlige og alle var hvite (en pasient også selv identifisert som spanske). Hver pasient mottok den samme behandling, som besto av total reseksjon, etterfulgt av adjuvant temozolomid og ekstern strålebehandling. I tillegg har alle pasienter gjennomgikk en ny operasjon på gjentakelse. Renheten av primærtumorprøver var større enn i tilbakevendende tumorprøver, alt fra 80-90% til 65-75%, henholdsvis (tabell 1).
varianter identifisert av både ExomeSeq og AmpliSeq CCP
Siden hele exome sekvenseringsteknologi har kapasitet til å dekke alle kodende gener i genomet, mens en hvilken som helst panel basert metode vil være begrenset til et delsett av det kodende genom, for å gjøre den mest hensiktsmessige sammenligningen mellom de to teknologiene vi begrenset analyse til 409 gener som inngår i AmpliSeq panelet. I tillegg, siden vi var mest interessert i varianter innen koding regioner, vi også fokusert på analyse av varianter innenfor bare eksoner. Varianter ble identifisert i 13 (3%) av 409 gener som analyseres i denne studien. Flertallet av varianter ble funnet i ExomeSeq data og bare to genvarianter ble delt mellom de to plattformene (Fig 2).
Gener som inneholder varianter og de tilhørende sekvense plattformene vises. De fleste variantene var assosiert med ExomeSeq data, og det var totalt 409 gener på AmpliSeq KKP.
Variantene funnet av begge plattformene var i genene
PTCH1 plakater (lappet 1) og
NF1 plakater (neurofibromin 1). Detaljert analyse av
PTCH1
variant avdekket tilsvarende dekning av det muterte base (figur 3A) i både AmpliSeq og ExomeSeq data på 26 og 24 leser, henholdsvis; og den AmpliSeq panel hadde en lavere prosentandel (23% mot 38%) av lyder som inneholder den alternative basen. Den andre delte varianten ble funnet i
NF1
genet (Fig 3B) og i dette tilfellet de to plattformene skilte seg sterkt når det gjelder lese dekning av det muterte basen. I ExomeSeq data, var det 38 leser dekker varianten base og 18 (47%) inneholdt den variant; mens 360 står i AmpliSeq data dekkes basisen og 20% (71 leser) inneholdt varianten.
NF1
var også en av de fire variantene identifisert i en tilbakevendende tumorprøve
(A) Se vises spenn chr9:. 98,209,620-98,209,640 av
PTCH1
; variant base er G til A mutasjon som ligger på bunnen 98209634 i primærtumor av pasient UH1. (B) Se vises spenn chr17: 29,585,500-29,585,530 av
NF1
; variant er G til A mutasjon som ligger på bunnen 29585518 i tilbakevendende svulst i pasientens UH3. Varianten base ligger mellom de to vertikale linjer som krysser leser.
varianter identifisert av ExomeSeq men ikke av AmpliSeq CCP
Det var totalt 10 varianter i åtte gener visstnok inkludert i AmpliSeq CCP som bare ble identifisert ved ExomeSeq tilnærming. To av disse genene var
PTEN plakater (fosfatase og tensin homolog) og
TP53 plakater (tumor protein p53), som begge ble funnet i de primære og tilbakevendende svulster i pasientens UH3. Begge disse genene er ofte mutert i GBM og mange andre kreftformer. I den primære tumor, exonet som inneholder det muterte basen i
PTEN
ble allment dekket av ExomeSeq leser og det muterte basen ble dekket med 26 leser, 65% av de som inneholdt variant; imidlertid den samme ekson var bare delvis dekket av leser fra AmpliSeq CCP (figur 4A) og ingen av disse er dekket det muterte basen. Tilsvarende er en mutasjon i
TP53
genet ble dekket av 98 ExomeSeq leser, 53% inneholdt variant base, mens ingen AmpliSeq CCP leser dekket denne regionen av ekson (fig 4B). Analyse av lese dekning av
PTEN
og
TP53
i den tilbakevendende tumor i pasientens UH3 funnet en økning i antall leser dekker variant basen i forhold til den primære svulsten for begge genene ved 68 og 121, respektivt. Når det gjelder andelen av lyder som dekker bunnen som ble også mutert, var det en reduksjon for
PTEN
til 40% og for
TP53
, andelen var praktisk talt den samme som i primærtumor på 54%. I tillegg AmpliSeq data for residiv av tumor produsert en eneste lese dekker mutert base i
TP53
, dette leste også inneholdt variant.
AmpliSeq data ikke ga noen leser dekker variant base i
PTEN
; Men en enkelt lese ikke vist i den grafiske gjorde dekke variant base i
TP53
i residiv av tumor. Data fra primærsvulster vises. (A) Se vises spenn chr10: 89,653,700-89,653,900 av
PTEN
; variant er T til G mutasjon som ligger på bunnen 89653783. (B) Utsikt fra
TP53
viser regionen chr17: 7,578,400-7,578,600; variant er G til A mutasjon som ligger på bunnen 7.578.475. Plasseringen av varianten basen er angitt med den vertikale linjen krysset leser.
PIK3CG plakater (phosphatidylinositol-4,5-bisfosfat 3-kinase, katalytisk subenhet gamma) genet var den eneste genet funnet å være mutert i mer enn en pasient, spesielt for dette genet inneholdt to forskjellige varianter, og en av hver var tilstede i de primære svulster i både UH1 og UH3 individer (tabell 2). Interessant, ble to varianter identifisert i
LLP product: (LIM domene som inneholder foretrukne trans partner i lipom) gen, både i primærtumor av pasient UH2 (tabell 2). Disse to varianter ble plassert i tilstøtende baser. Undersøkelse av alle AmpliSeq KKP gener som finnes varianter bare i ExomeSeq data avslørte
LLP
genet for å ha størst dekning med 1388 og 1403 leser dekker første og andre variant, henholdsvis. I begge tilfeller, leser 80% av ble mutert.
varianter utelukkende identifisert av AmpliSeq CCP
I motsetning til de variantene som er unike for de ExomeSeq data, tre varianter i tre forskjellige gener ble identifisert ved AmpliSeq CCP, men ikke av hele exome sekvensering (figur 2 og tabell 2). Alle tre varianter ble påvist i primære svulster i to pasienter (UH1 UH2), spesielt i
DPYD plakater (dihydropyrimidin dehydrogenase),
MCL1 plakater (v-myc myelocytomatosis viral onkogen homolog 1, lungekarsinom avledet [avian]), og
TNK2 plakater (tyrosin kinase, ikke-reseptor, 2) gener. Ingen av de tre variantene som er unike for AmpliSeq CCP ble utpekt som «dekket» av MuTect programvare, noe som indikerer mindre enn 80% strøm til å oppdage disse variantene på 0,3 allel brøkdel.
Diskusjoner
Deep sekvense metoder har revolusjonert mange biologiske og biomedisinske felt med kreft, spesielt diagnostikk og behandlingsstrategier, å være en av de mest påvirket [20, 21]. Stor innsats har blitt plassert på å sekvensere hele genomet eller hele exomes å identifisere kritiske kreft mutasjoner som kunne kjøre personliggjorte og målrettet terapi [22]. Dessverre, selv om adgang til dype sekvense teknologier har øket betraktelig i løpet av de siste årene, er fortsatt relativt høye kostnaden for sekvensering og kompleksiteten av analysen har ført til utvikling av mer kostbare instrumenter og metoder, sammen med den forenkling av antall gener i bli analysert. Den Ion AmpliSeq KKP ble utviklet for å sekvensere hele exon dekning av 409 gener involvert i kreft, det vil si over 50% av Wellcome Trust Sanger Institute Cancer Gene Census (https://cancer.sanger.ac.uk/cosmic/census ). I denne pilotstudien har vi brukt AmpliSeq CCP til sekvens matchet blod, primær og tilbakevendende svulster fra tre GBM pasienter og sammenlignet resultatene til hele exome sekvense data innhentet ved hjelp av Illumina plattform fra Kreft Genome Atlas (TCGA) prosjekt.
Samlet få gener ble funnet å inneholde varianter i denne studien (13 gener) og blant dem, bare to varianter ble sammen identifiseres av de to sekvenseringsfremgangsmåter (ExomeSeq og AmpliSeq CCP). En variant i
PTCH1
genet ble identifisert i den primære svulsten fra pasient UH1. Denne tumor suppressor genet funksjoner i Hedgehog signalveien og har vært show å være mutert i pediatrisk medulloblastoma [23]. Den andre varianten var innenfor genet
NF1 plakater (også en tumor suppressor), som koder for det neurofibromin 1-proteinet og er et hyppig muterte genet i GBM [18]. Disse to variantene var de eneste to som omfattes av MuTect programvare, noe som effektivt gjør
PTCH1 Hotell og
NF1
de mest presist identifiserte varianter i AmpliSeq KKP data.
Det var også lite overlapping av variantene mellom de enkelte pasient og tumortyper. Den eneste genet identifisert som variant i mer enn én pasient var
PIK3CG
, som ble mutert i primære svulster fra pasienter UH1 UH3. Dette genet inneholdt forskjellige varianter i de to tumorer og var bare til stede i ExomeSeq dataene. Genene
PTEN Hotell og
TP53
inneholdt de eneste genvarianter identifisert i både primære og tilbakevendende svulster i samme pasient, UH3. Selv om begge genene er blant dem ofte mutert i GBM, disse variantene var også eksklusivt til ExomeSeq data. Ytterligere inspeksjon av de justeringer ved variant basene avslørte bare delvis dekning av den variant som inneholder eksoner av den AmpliSeq leser, som er en sannsynlig bidragsyter til en variant ikke å bli oppdaget av dette panelet.
Det ble antatt at det ikke ville være forskjeller i de variantene som er identifisert fra ExomeSeq og AmpliSeq CCP data. I et forsøk på å begrense disse forskjellene, begrenset vi analysen til kun å gjelde gener som var på genet over AmpliSeq KKP. De forskjellige teknologiske metoder for sekvensering av en hel exome versus sekvensering av en fokusert undergruppe av kreft-relaterte gener, kan sannsynligvis resultere i å finne færre muterte gener ved å bruke mer fokusert tilnærming, som observert i denne studien. Et annet punkt å være oppmerksom på er at intra-tumor heterogenitet er karakteristisk for mange kreftformer, inkludert GBM. Analysen rapportert her ble gjort ved hjelp av to forskjellige stykker fra hver pasient svulst og våre observerte avvik i variant identifikasjon kan stamme fra den iboende intra-tumor heterogenitet i GBM.
Denne analysen gir bevis for at genene
PTCH1 Hotell og
NF1
kan påvises med sikkerhet i pasientprøver, og at mangel på bred ekson dekning kan påvirke variant deteksjon i disse regionene. Genene som inngår i AmpliSeq CCP ble valgt til å være representativt for et bredt utvalg av krefttyper og gen paneler mer spesifikke for hjernen og hjernesvulster kan forbedre variant deteksjon i GBM. Selv om noen få studier har evaluert bruk dype sekvensebaserte paneler for rask kreft genotyping [23, 24], vår pilotstudie viser potensialet for Ion AmpliSeq CCP å bidra til påvisning av mutasjoner i både grunnforskning og klinisk kreftforskning. Videre studier, med et større antall prøver vil hjelpe oss til å forstå forskjellene observert mellom de to metoder og legge til vår nåværende forståelse av mutasjoner som driver progresjon og tilbakefall i GBM.
Takk
forfatterne ønsker å takke de pasientene som deltok i Kreft Genome Atlas (TCGA) prosjektet og Andrew E. Sloan, MD, for hans støtte til universitetssykehusene hjernesvulst biobank. Resultatene er publisert her er helt eller delvis basert på Kreft Genome Atlas prosjekt etablert av NCI og NHGRI. Ytterligere informasjon om TCGA finner du her: https://cancergenome.nih.gov/
.
