Abstract
Cancer stamceller (CSC) eller kreft stamcelleliknende celler (CSC-LCS ) har blitt identifisert i mange ondartede svulster. Cscs er foreslått å være relatert til medikamentresistens, tumorresidiv, og metastase og er betraktet som et nytt mål for behandling av kreft; men det er bare noen få rapporter om cscs eller CSC-LCS i nyrecellekreft (RCC). Ulike tilnærminger har blitt rapportert for CSC identifikasjon, men det finnes ingen universelle markører for CSC. Vi brukte to ulike tilnærminger, tradisjonelle side befolkningen (SP) tilnærming, og den enzymatiske (aldehyd dehydrogenase 1 (ALDH1)) tilnærming for å identifisere CSC-LC befolkningen i to RCC cellelinjer, ACHN og KRC /Y. Vi fant ut at ACHN og KRC /Y inneholde 1,4% og 1,7% SP celler, henholdsvis. ACHN SP celler viste en høyere sfære dannende evne, narkotika motstand, og en noe høyere tumorigen evne i NOD /SCID-mus enn ikke-SP (NSP) celler, noe som tyder på at celler med CSC-LC eiendommene, i ACHN SP celler. KRC /Y SP og NSP celler viste ingen forskjell i slike egenskaper. ALDH1 aktivitet analyse viste at SP ACHN-celler uttrykte et høyere aktivitetsnivå enn NSP-celler (SP vs. NSP: 32,7% mot 14,6%). Analyse av ALDH1-positive ACHN-celler viste at de har en høyere sfære dannende evne, selvfornyelse evne, tumorgenisitet og uttrykker høye nivåer av mRNA-CSC-LC egenskapsrelaterte gener (for eksempel, ABC transportør gener, selv-replikasjonsgener, anti- apoptose gener, og så videre) enn ALDH1-negative celler. Medikamentell behandling eller eksponering for hypoksisk tilstand indusert en 2- til 3-ganger økning i antall ALDH1-positive celler. I konklusjonen, tyder resultatene på at den ALDH1-positive cellepopulasjon i stedet SP cellene vise CSC-LC egenskaper i en RCC cellelinje, ACHN
Citation. Ueda K, Ogasawara S, Akiba J, Nakayama M, Todoroki K, Ueda K, et al. (2013) aldehyd dehydrogenase en Identifiserer Celler med Cancer Stem Cell-lignende egenskaper i et menneskelig nyrecellekarsinom Cell Line. PLoS ONE 8 (10): e75463. doi: 10,1371 /journal.pone.0075463
Redaktør: Masaharu Seno, Okayama University, Japan
mottatt: 25 mars 2013; Akseptert: 14. august 2013, Publisert: 08.10.2013
Copyright: © 2013 Ueda et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Forfatterne har ingen finansiering eller støtte til rapporten
konkurrerende interesser:. forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Nyrecellekarsinom (RCC) er en av de. vanligste kreftformen i urogenitalsystem, sto for 116,500 dødsfall i 2008 i henhold til Verdens helseorganisasjon [1]. Forekomsten av RCC har vært jevnt økende de siste 30 årene [2]. Videre, fordi metastatisk RCC er notorisk motstandsdyktig mot de fleste konvensjonelle behandlinger, for eksempel cellegift og strålebehandling, er prognosen for pasienter med RCC dårlig som en tredjedel av pasienter som allerede har metastatisk sykdom ved første diagnosen og 30-40% av dem å utvikle fjern metastaser etter reseksjon av primærtumor [3]. I de senere årene har de molekylære målrettet terapi som er utviklet vist betydelige objektive responser [4] – [6], og de er nå anerkjent som dagens standardbehandling av metastatisk RCC. Imidlertid er effektiviteten av disse molekylære mål-terapi utilstrekkelig.
De to dominerende modellene av karsinogenese er den stokastiske modellen (klonal utvikling) og den hierarkiske organisering av tumor (cancer stamcelle (CSC)) modell. I henhold til den tradisjonelle klonal evolusjon modell, er tumordannelse konsekvensen av å akkumulere tilfeldige genetiske hendelser i normale differensierte celler, mens den CSC-modellen postulerer at en enkelt CSC gir opphav til en hierarkisk organisering innenfor en svulst [7], [8]. Nyere studier tyder på at cscs kan være ansvarlig for tumordannelse og bidra til noen individer motstand mot kreft terapi, noe som resulterte i kreft tilbakefall og metastase [9], [10]. Derfor er det antatt at identifisering og karakterisering av CSC eller kreft stamcelle-liknende celle (CSC-LC) kan bidra vesentlig til utviklingen av effektive terapier. Bussolati et al. identifisert en befolkning på CD105 positiv tumor initiere celler i RCC, og gjennomgått litteratur om rollen til stamceller i menneske RCC [11], [12]. Kim et al. rapportert at uttrykket av stamcellemarkører, OCT4 og CD133, kan tjene, henholdsvis som en fattig og gunstig prognostisk markør i papillær RCC [13]. I tillegg foreslo de at uttrykket av CD133 er et gunstig prognostisk markør i klarcellet RCC [14].
Det er mange rapporter om at CSC-LCS av noen solide tumorer er tilstede i side befolkningen (SP) celler [15], [16], men det er bare noen få rapporter om rollen til SP celler i menneskets RCC [17], [18]. SP-celler ble opprinnelig identifisert i strømningscytometrisk analyse ved deres evne til dyseutstrømningen vital DNA-fargestoff, Hoechst 33342, noe som resulterer i Hoechst-negative SP-celler og Hoechst-positive ikke-SP (NSP) celler. Tidligere studier av kreft i vitro og primære tumorer in vivo har vist at SP celler er unikt i stand til å generere både SP og NSP cellepopulasjoner, viser eiendommer i samsvar med stamceller eller CSC. SP-celler uttrykker høye nivåer av ATP-bindende kassett (ABC) transporter familiemedlemmer, særlig ABCG2, og oppviser flere kjemoterapeutisk legemiddelresistens enn NSP celler i cellelinjer avledet fra noen humane maligne faste tumorer, slik som brystkreft, lungekreft, eggstokk-kreft og plateepitelkreft [19] – [21]
Nylig har det blitt rapportert at aldehyd dehydrogenase 1 (ALDH1) er ansvarlig for oksidasjon av retinol til retinsyre og spiller sentrale roller i embryonal utvikling og homeostase. i flere organer [22]. Enkelte forskere har rapportert at høy uttrykk for ALDH1 var assosiert med resistens og dårlig prognose, og at ALDH1 er en CSC markør [23], [24]. Ozbek et al. rapportert at ALDH1 uttrykk var korrelert med tumor karakter i RCC [25], men de biologiske funksjonene i ALDH1-positive celler i RCC er fortsatt i stor grad ukjent.
I denne studien har vi isolert SP celler fra to human RCC celle linjer og systematisk undersøkt CSC egenskapene til SP celler og ALDH1-positive celler, og forholdet mellom SP celler og ALDH1-positive celler.
Materialer og metoder
Cellelinjer linjer~~POS=HEADCOMP og dyr
Vi brukte to RCC-cellelinjer: en avledet fra ondartet pleural effusjon hos en pasient med RCC (ACHN) og den annen er avledet fra primære lesjon av en pasient med RCC (KRC /Y). Disse 2 RCC cellelinjer har høy proliferativ og kolonidannende evner
in vitro Hotell og besitter høy tumorgenisiteten i selv nakne mus
in vivo
. ACHN ble kjøpt fra American Type Culture Collection. KRC /Y ble etablert i vårt laboratorium [26]. Kulturmedium for ACHN besto av modifiserte Eagles medium (EMEM) (Gibco, BRL /Life Technologies Inc., Gaithersburg, MD, USA). Kulturmedium for KRC /Y besto av Dulbeccos modifiserte medium (DMEM) (Nissui Seiyaku Co., Tokyo, Japan) supplert med varme-inaktivert (56 ° C, 30 min), 5% føtalt bovint serum (FBS, Bioserum, VIC, Australia ), 100 U /ml penicillin og 100 ug streptomycin (Gibco BRL /Livet Technologies Inc.). Celler ble dyrket i en atmosfære av 5% CO
2 i luft ved 37 ° C. Kvinne non-obese diabetic /alvorlig kombinert immunsvikt (NOD /SCID) mus (5 uker gamle) ble kjøpt (Clea Japan, Inc., Osaka, Japan), og holder til i laminær-flow skap under patogenfrie forhold. Alle prosedyrer ble godkjent av etikk Review Committee for forsøk med dyr av Kurume University School of Medicine.
Uttrykk av CSC Markører i RCC cellelinjer
Vi analyserte uttrykk for den antatte CSC markører ABCG2, CD90, CD105, CD133 og epitelial celleadhesjonsmolekyl (EpCAM) i ACHN og KRC /Y. Celler ble inkubert i mørke ved 4 ° C i 30 minutter med fluorescens-konjugert monoklonale antistoffer, omfattende fluoresceinisotiocyanat (FITC) -konjugert mus anti-human CD90-antistoff (5E10, BD Biosciences, San Jose, CA, USA) og muse anti human CD105 antistoff (MEM-226, EXBIO, Praha, Tsjekkia) og fysoerytrin (PE) konjugert CD133 /2 antistoffer (293C3, Miltenyi Biotec, Bergisch-Gladbach, Tyskland) og anti-EpCAM antistoff (EBA-en, BD Biosciences ). Celler med mus anti-BCRP monoklonalt antistoff (ABCG2) (BXP-21, Chemicon, Temecula, CA, USA) ble inkubert i 30 minutter og ytterligere inkubert i mørke ved 4 ° C i 30 minutter med FITC-konjugert geit anti-mus Ig (FITC-GAM) (BD Biosciences). Cellene ble vasket, resuspendert og analysert på et FACScan (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ, USA).
SP Cell Identifisering og CSC Marker uttrykk i SP og NSP Cells
dyrkede celler med 80 % samløpet ble frittliggende med accutase (Innovative Cell Technologies, Inc., San Diego, USA) og suspendert på 1 × 10
6 celler /ml i fosfat-bufret saltvann (PBS) supplert med 2% FBS og deretter inkubert med Hoechest 33342 fargestoff alene (5 mikrogram /ml for ACHN og 10 ug /ml for KRC /Y) (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) eller med 20 ug /ml reserpin (Sigma-Aldrich) ved 37 ° C i 60 min. Prøvene ble vasket, sentrifugert og resuspendert i 2 ml kald PBS supplert med 2% FBS, deretter 1 ug /ml propidiumjodid (PI) (BD Biosciences) ble tilsatt, og cellene ble filtrert gjennom en 40 um celle sil (BD Biosciences). Strømningscytometrisk analyse ble utført som tidligere beskrevet [27]. Reserpin blir konvensjonelt anvendt som et styrende parameter for å bestemme grensen mellom SP og NSP celler. Analyser ble utført med en FACSAria II (BD Biosciences). Uttrykket av CD90 og EpCAM i ACHN, og at av CD105 og EpCAM i KRC /Y, i SP og NSP celler ble ytterligere undersøkt. Celler ble farget ved hjelp av fremgangsmåten beskrevet ovenfor.
cellevekstanalyse av SP og NSP celler
En total på 2000 SP-celler og NSP-celler ble sådd ut i 96-brønners plater og dyrket i en CO
2 inkubator. Cellene ble høstet ved 24, 48, 72, 96, 120 eller 144 timer, og proliferasjonen ble undersøkt i kolorimetriske assays ved å bruke 3- (4,5-dimetyltiazol-2-yl-yl -) – 2,5-difenyl-tetrazolium-bromid (MTT ) cellevekst analysesett (Chemicon, Temecula, CA, USA) som beskrevet andre steder [28].
Colony Forming analyse av SP og NSP Cells
Den myke agar forankringsuavhengig klonogene vekst analysen var utført. I korthet, 2 x 10
4 celler ble suspendert i 2 ml EMEM eller DMEM inneholdende 0,36% bløt agar (Gibco BRL /Life Technologies Inc.) og 10% FBS i en 35 mm skål. Cellesuspensjonen ble deretter overlagt på et presolidified 0,72% vanskelig agar. Mediet inneholdende 0,36% myk agar ble supplert gang i uken. Kolonier ( 10 celler) som oppsto innen 3 uker ble presentert som clonogenicity. Fem retter ble undersøkt for hver celletype og blindt telles under mikroskop (× 200) på alle områder.
Sphere Dannelse analyse av SP og NSP Cells
Isolert SP og NSP celler fra to -cellelinjer (4000 celler /skål) ble dyrket i serumfritt medium, inkludert 10 ng /ml epidermal vekstfaktor (EGF) (Sankojunyaku, Tokyo, Japan) og 20 ng /ml basisk fibroblast vekstfaktor (bFGF) (Sankojunyaku) ved anvendelse av ultra -low-feste 6-brønners plater (Corning Inc., Corning, NY, USA) i 1 uke, hvoretter sfære dannelsen ble vurdert ved å telle antall sfærer ( 3-celler). henhold mikroskop (x 200)
Drug Resistance Analyse
Isolert SP og NSP celler ble plantet på 2000 celler per brønn i 96-brønners plater, og effekten av multikinasehemmer inhibitor Sorafenib (2 mm) (Cell Signaling Technology. Inc. , Danvers, MA, USA) og IFNα (4000 IU /ml) (OIF, Otsuka Pharma Co., Ltd., Tokyo, Japan) ble undersøkt. Resistens ble bestemt etter behandling i 72, 96 eller 144 timer ved MTT-analyse.
tumorigenitet Analyser av SP og NSP Cells in vivo
For å utforske tumorigent kapasitet, SP og NSP celler (1, 10 eller 100 x 10
3) ble isolert fra de to RCC-cellelinjer som er lagt inn i 100 ul medium, og hver for seg injisert inn i det subkutane plass i flanken av fem uker gamle hunnkjønns NOD /SCID-mus i henhold til anestesi. Svulst kapasiteten ble dømt 8 uker etter injeksjonen.
cDNA Utarbeidelse og kvantitativ real-time RT-PCR for Gene Expression analyse
Etter SP og NSP celler i ACHN og KRC /Y ble isolert, total RNA ble ekstrahert ved hjelp av en RNeasy Plus Micro Kit (Qiagen, Valencia, CA, USA), og komplementær DNA (cDNA) ble syntetisert ved å bruke Reverse Transcription System (Promega, Madison, WI, USA) i henhold til produsentens instruksjoner. Kvantitativ real-time RT-PCR (QRT-PCR) ble utført for å undersøke uttrykk for CSC-LC eiendomsrelaterte gener (for eksempel ABC transporter gener (ABCB1 og ABCG2), self-replikering gener (BMI1 og c-MYC), anti-apoptose-gener (BCL2 og CFLAR), hypoksi-relaterte gener (hypoksi induserbar faktor 1α (HIF1α) og vaskulær endotelial vekstfaktor-A (VEGFA)), og epiteliale-mesenchymale overgang (EMT) -relaterte gener (sneglen og Twist) ) med en ABI PRISM 7500 (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). Genuttrykk analyser og primer og sonde mikser ble brukt for ABCB1, ABCG2, ALDH1A1, BMI1, c-MYC, BCL2, CFLAR, HIF1α, VEGFA, sneglen, Twist, og β-aktin (analyse IDer (Hs 00184500_m1, Hs00184979_ml, Hs00946916_m1, Hs00180411_ml, Hs00153408_ml, Hs00608023_m1, Hs00153439_m1, Hs00153153_ml, Hs00900055_ml, Hs00195591_m1, Hs01675818_s1, og Hs99999903_m1, henholdsvis; Applied Biosystems), og termiske syklusbetingelser var som følger: initial inkubering ved 95 ° C i 10 min, deretter 40 sykluser vekselvis i sin tur med 95 ° C i 10 s, 60 ° C i 20 s, og 72 ° C i 15 s, og deretter holdt ved 72 ° C i 10 min.
Sammenlignende gen-ekspresjon analyse ble utført ved hjelp av to
(- ΔΔCt) metoder med normalisering til nivået av intern kontroll genet, β-actin
ALDH1 Expression i SP og NSP celler og celler under Patologiske forhold
ALDH1 uttrykk ble undersøkt i. prøver fremstilt fra SP og NSP-celler, medikamentbehandlede celler, og celler dyrket under hypoksiske forhold. i korthet, SP og NSP-celler ble isolert fra ACHN og KRC /Y-celler dyrket i 72 timer ved bruk av fremgangsmåten beskrevet ovenfor. Foreldre celler og isolerte SP og NSP celler ble brukt som eksempler. ACHN celler dyrket med EMEM som inneholder Sorafenib (1 mm) eller IFNα (4000 IE /m) for 48, 72 eller 96 timer og cellene dyrket under hypoksisk (1% O
2) betingelser for 48, 72 eller 96 timer var også brukt som prøver. Prøvene ble suspendert i ALDEFLUOR analysebuffer inneholdende ALDH substrat, BAAA (BODIPY-aminoacetaldehyd) (50 ug tørr-reagens), med eller uten 5 ul av den spesifikke ALDH inhibitoren diethylaminobenzaldehyde (DEAB 1,5 mM i 95% etanol stamløsning), som en negativ kontroll, og inkubert i 60 minutter ved 37 ° C (ALDEFLOUR KIT, stamceller teknologier, Vancouver, BC, Canada), og analysert ved hjelp av flowcytometri (FCM).
Biologiske Kjennetegn på ALDH1-positive og ALDH1- negative celler
Sphere-analysen ble utført i ACHN og KRC /Y celler. Tumorigenitet analysen og genuttrykk analysen ble utført for å undersøke biologiske funksjoner i ALDH1-positive og ALDH1-negative ACHN celler. For å sammenligne den selvfornyelse kapasitet mellom ALDH1-positive og ALDH1-negative ACHN-celler, undersøkte vi en kule-dannende egenskaper av tre etterfølgende seriepassasjer av enkelt-dissosiert celler ifølge fremgangsmåten til Lim et al. [29]. I korthet, etter dissosiering den første passasje kule med 0,25% trypsin, enkelt-dissosiert celler i ALDH1-positive og ALDH1-negative celler av ACHN ble sådd ut i 6-brønns plater. En uke senere ble antall kuler telles og den samme prosedyre ble gjentatt nok en gang. Tumorgenisitet assay og genekspresjon-analyse ble utført som beskrevet ovenfor med unntak av sammenlignings ved 1 x 10
3-celler ble ikke utført i tumorigenisitet analysen.
Statistical Analysis
Sammenligning av cellevekstanalyse ble utført ved hjelp av to-faktor faktoriell ANOVA, og de av kolonidannelse analysen, sfære-analysen, og stoffet motstand analysen ble utført ved hjelp av Student
t
-test. Den andre data sammenligninger ble utført ved anvendelse av Mann-Whitney U-test. En verdi på
P
0,05 ble betraktet som signifikant
Resultater
Uttrykk for CSC Markers
ACHN uttrykt CD90 (96,9%) og EpCAM (. 87,7%), men ekspresjon av CD105 (1,5%), CD133 (1,3%) og ABCG2 (0,9%) holdt seg på meget lave nivåer. På den annen side, uttrykt KRC /Y CD105 (28,9%) og EpCAM (93,0%), men ekspresjon av CD90 (1,7%), CD133 (1,7%), og ABCG2 (2,9%) var meget lav.
SP Cells analyse og uttrykk for CSC markører i SP og NSP Cells
SP cellefraksjoner i ACHN og KRC /Y var 1,4% og 1,7%, henholdsvis (fig. 1a). Deretter undersøkte vi uttrykket av CSC markører som CD90 og EpCAM i ACHN, og CD105 og EpCAM i KRC /Y, i SP og NSP celler. Det var ingen synlig forskjell i CD90 og EpCAM uttrykk mellom SP og NSP celler i ACHN. Selv om det ikke var noen forskjell i EpCAM uttrykk mellom SP og NSP celler i KRC /Y, CD105 ekspresjon i SP-celler (24,6%) var mye høyere enn i NSP celler (4,6%) (Fig. 1B).
(A) ACHN og KRC /Y ble merket med Hoechst 33342, og deretter analysert ved hjelp av FCM. De SP-celle priser i ACHN og KRC /Y-var 1,4% (A-a) og 1,7% (A-C), henholdsvis, noe som betydelig redusert i nærvær av reserpin (A-b, a-d). Forsøket ble gjentatt minst tre ganger for hver cellelinje og nesten identiske resultater ble oppnådd. En representant figur av våre eksperimenter er vist. (B) Det var ingen synlig forskjell i CD90 og EpCAM uttrykk mellom SP og NSP celler i ACHN. I KRC /Y-cellelinjen, selv om det ikke var noen forskjell i EpCAM ekspresjon, SP-celler uttrykte et høyere CD105-positive celle hastighet enn NSP-celler (SP vs NSP: 24,6% mot 4,6%). Eksperimentene ble gjentatt to ganger, og nesten identiske resultater ble oppnådd. En representant figur av våre eksperimenter er vist.
Biologiske funksjoner av SP og NSP Celler i ACHN og KRC /Y in vitro
Det var ingen signifikant forskjell i cellen proliferativ evne og clonogenicity mellom SP og NSP celler i ACHN. På den annen side, etter dyrking i 48 timer, SP-celler i KRC /Y hadde en signifikant høyere proliferativ evne enn NSP-celler (
P
0,0001) (Fig. 2A). Selv om SP-celler i KRC /Y hadde en signifikant høyere enn clonogenicity NSP-celler (
P
0,01) (Fig. 2B), var det ingen signifikant forskjell i sfære dannelsesevne mellom SP og NSP celler i KRC /Y. Omvendt, SP-celler i ACHN hadde en signifikant høyere sfære dannelsesevne enn NSP-celler (Fig. 2C). Etter 72, 96 eller 144 timer behandling med Sorafenib eller IFNα, ble følsomheten for hvert medikament vurderes med MTT-analysen. Det var ingen forskjell i følsomhet mellom SP-celler og celler NSP i KRC /Y mot Sorafenib eller IFNα behandling. Men SP celler i ACHN hadde en signifikant høyere IFNα motstand (
P
0,0001). (Fig. 2D)
(A) Vekstkurver av SP og NSP celler. SP celler i KRC /Y viste en høyere proliferativ evne i forhold til NSP celler (*
P
0,0001). (B) Den clonogenity øker betydelig hos SP celler i KRC /Y (*
P
0,01). (C) Sphere dannende evne var signifikant høyere i SP celler i ACHN (*
P
0,05). (D) Drug motstand fra SP og NSP celler behandlet med Sorafenib eller IFNα. SP celler i ACHN hadde høyere IFNα motstand (*
P
0,0001). Forsøkene ble gjentatt to ganger, og nesten identiske resultater ble oppnådd.
tumorigenicity Analyser in vivo i SP og NSP Cells
Både SP og NSP celler viste svulst forming evne i hver av de to RCC-cellelinjer. Forholdet av tumorgenisitet mellom SP og NSP celler i ACHN og KRC /Y var ikke signifikant forskjellig, men det tumorgenisiteten av SP-celler var litt høyere enn for NSP celler i ACHN (tabell 1).
analyse av CSC-LC Eiendom relaterte Gene Expression i SP og NSP Cells ved QRT-PCR
Det var ingen signifikante forskjeller i mRNA uttrykk av ABC transporter gener (ABCB1 og ABCG2), selv replikering gener (BMI- 1 og c-MYC), anti-apoptose gener (BCL2 og CFLAR), hypoksi relaterte gener (VEGFA og HIF1α), og EMT-relaterte gener (Snail og Twist) mellom SP og NSP celler i de 2 cellelinjer. SP celler i ACHN uttrykt et litt høyere nivå av ALDH1A1 mRNA enn NSP celler, men ingen åpenbar forskjell ble observert i KRC /Y (Fig. 3).
Det var ingen signifikante forskjeller i mRNA uttrykk av ABC transporter gener (ABCB1 og ABCG2), self-replikering gener (BMI-1 og c-myc), anti-apoptose gener (BCL2 og CFLAR), hypoksi relaterte gener (VEGFA og HIF1α), og EMT-relaterte gener (Snail og vri) mellom SP og NSP celler i de 2 cellelinjer. SP-celler i ACHN uttrykte et noe høyere nivå av ALDH1A1 mRNA enn NSP-celler, men ingen tilsynelatende forskjell ble observert i KRC /Y. Forsøket ble gjentatt minst fire ganger for hver cellelinje og nesten identiske resultater ble oppnådd.
ALDH1 Expression, og biologiske funksjoner av ALDH1-positive og ALDH1-negative RCC celler
den ALDH1-positive cellerate i KRC /Y celler var 6,5%. Det var ingen forskjell i ALDH1 uttrykk mellom SP og NSP celler. I ACHN celler, ALDH1-positive celle rente var 15,3%. Også antallet ALDH1-positive SP-celler (32,7%) var høyere enn den til NSP celler (14,6%) (fig. 4A). Cellevekst ble betydelig undertrykt i celler behandlet med Sorafenib eller IFNα og i celler eksponert for hypoksi, sammenlignet med (fig. 4B) kontrollceller. Når det gjelder ALDH1 uttrykk, det var ingen synlig forskjell i ALDH1-positive cellerater blant kontrollceller, celler behandlet med Sorafenib eller IFNα, og celler som er utsatt for hypoksisk tilstand i 48 timer. Imidlertid er andelen av ALDH1-positive celler øket kronologisk, spesielt i celler behandlet med Sorafenib eller utsettes for hypoksiske betingelser. Spesielt, etter eksponering for Sorafenib eller IFNα, eller hypoksi i 96 timer, de prosentandeler av ALDH1-positive celler var 40,0%, 19,2% og 37,1%, respektivt (figur 4C.).
(A) uttrykk for ALDH1 i SP celler og NSP celler i ACHN og KRC /Y. De ALDH1-positive celle priser i ACHN og KRC /Y var 15,3% og 6,5%, henholdsvis. (B) Sammenligning av cellevekst blant kontrollceller, celler behandlet med Sorafenib eller IFNα og celler utsatt for hypoksi i ACHN. Celleveksten ble målt ved 48, 72 eller 96 timer etter medikamentbehandling eller eksponering for hypoksi. Cellevekst etter behandling eller eksponering for hypoksi ble undertrykte betydelig sammenlignet med kontroll (*
P
0,005, **
P
0,0001 vs kontroll). (C) Prosent ALDH1-positive celler i celler behandlet med Sorafenib eller IFNα, eller cellene utsettes for hypoksi i 48, 72 eller 96 timer. Prosentandelen av ALDH1-positive celler i celler behandlet med Sorafenib eller IFNα, eller cellene utsettes for hypoksi i 96 timer var høyere sammenlignet med den normale tilstand. Eksperimentene ble gjentatt to ganger, og nesten identiske resultater ble oppnådd. En representant figur av våre eksperimenter er vist. (D) Sphere dannelsesevne mellom ALDH1-positive celler og ALDH1-negative celler. Den sfære dannelse av ALDH1-positive celler i ACHN og KRC /Y var høyere enn for ALDH1-negative celler. Eksperimentene ble gjentatt to ganger, og nesten identiske resultater ble oppnådd.
sfære dannende evne ALDH1-positive celler i både ACHN og KRC /Y var høyere enn for ALDH1-negative celler. Videre ALDH1-positive celler i ACHN generert betydelig større kulestørrelser enn ALDH1-negative celler (fig. 4D). Vi fant også at single-dissosiert sfære celler belagt med en tetthet på 4000 celler per brønn ga opphav til sekundære og tertiære sfærer innen 1 uke etter såing. Selv om antallet sfærer ble vist å redusere i det andre og tredje passasjer i forhold til den første passasje, ble sfæren dannende evne ALDH1-positive celler i ACHN opprettholdes under det andre og tredje passasjer. På den annen side, ALDH1-negative celler dannet noen sekundære sfærer (Fig. 5).
sfære dannende evne ALDH1-positive celler i ACHN ble opprettholdt i løpet av andre og tredje passasjer (*
P
. 0,0001)
Svulstdannelse dannelse~~POS=HEADCOMP ble observert i tre av fem og fem av fem mus injisert med 10 × 10
3 og 100 × 10
3 ALDH1- positive celler, henholdsvis, etter 8 uker. Men ALDH1-negative celleinjeksjon utviklet ingen synlige svulster i alle mus på denne tiden (tabell 2).
QRT-PCR i ALDH1-positive og ALDH1-negative ACHN Cells
Vi utførte QRT-PCR-analyse for å sammenligne CSC-LC eiendomsrelaterte genuttrykk i ALDH1-positive og ALDH1-negative ACHN celler. ALDH1-positive celler som uttrykte betydelig høyere nivåer av mRNA i alle genene bortsett fra snegle enn ALDH1-negative celler. Nivåene av økningen var som følger: ABCB1, 4,9-fold; ABCG2, 2,5 ganger, ALDH1A1, 4,8 ganger; BCL2, 5,0 ganger; CFLAR, 4,1 ganger; BMI-en, 3,9 ganger; c-MYC, 3,9 ganger; HIF1α, 3,4 ganger; VEGFA, 2,7 ganger; Twist, 4,0 ganger (fig. 6).
ALDH1-positive celler viste signifikant høyere mRNA uttrykk for ALDH1A1, transportørrelaterte gener (ABCB1 og ABCG2), self-replikering gener (BMI-1 og c- MYC), anti-apoptose gener (BCL2 og CFLAR), hypoksi relaterte gener (HIF1α og VEGFA) og EMT-relaterte gener (Twist) enn ALDH1-negative celler i ACHN. Det var imidlertid ingen signifikant forskjell i mRNA-ekspresjonen av snegle mellom ALDH1-positive og ALDH1-negative celler. Forsøkene ble gjentatt minst fire ganger, og nesten identiske resultater ble oppnådd.
diskusjon
Siden den CSC konseptet ble foreslått for å forklare den heterogeniteten av tumorceller, cscs eller CSC- LCS har blitt identifisert i mange typer kreft. Generelt cscs besitte både selvfornyelse og differensiering evner slik at CSC til delvis gjenskape den cellulære heterogenitet av foreldre svulst. En rekke studier har rapportert at den manglende evne til konvensjonell terapi for å forebygge tilbakefall eller metastaser er på grunn av tilstedeværelsen av små delmengder av resistente celler, nemlig cscs [8], [30]. De siste årene har SP teknikken har blitt en av de mest brukte metodene for å isolere CSC-LCS. Siden den detaljerte farging og målemetoden for Goodell et al. ble først introdusert, har mange forskere rapporterte at SP-celler er en undergruppe av celler med høyere klasse malignitet, og CSC-LCS egenskaper [15], [16], [31]. Med hensyn til RCC, Addla et al. rapportert at SP celler sto for 4-6% av total kreftceller. Men de cellulære egenskapene til SP-celler er ikke godt forstått [17].
I foreliggende studie har vi funnet at SP-fraksjoner i ACHN og KRC /Y-var 1,4% og 1,7%, respektivt. Det var ingen forskjell mellom KRC /Y-SP og NSP-celler i tumordannelse, sfære dannende evne, eller i motstand mot Sorafenib eller IFNα, som konvensjonelt anvendes for å behandle avansert RCC. Disse funnene tyder på at KRC /Y SP cellene mangler egenskapene til cscs-LCS. I kontrast, mens det var ingen signifikante forskjeller mellom ACHN SP og NSP celler i in vitro cellevekst eller koloni formasjon analyser, gjorde SP cellene vise en høyere sfære dannende evne, høyere IFNα motstand og høyere tumorigenicity i NOD /SCID mus enn NSP celler , tyder på celler med CSC-LC eiendommene, i ACHN SP celler. I dag er SP tilnærming er den mest brukte metoden for å identifisere CSC markører, men mange forskere fortsatt spørsmål ved forholdet mellom SP celler og cscs [32] – [34]. I tillegg Ibrahim et al. studert forholdet mellom Hoechst farging konsentrasjon og inkubasjonstid og rapporterte at Hoechst flekker konsentrasjonen hadde en effekt på celleskade [35]. I foreliggende undersøkelse, for å identifisere SP-celler i ACHN og KRC /Y benyttet vi Hoechst farging ved en konsentrasjon på 5 ug /ml og 10 ug /ml, respektivt. Hoechst farging blir generelt utført ved en konsentrasjon på 5 pg /mL, men i den foreliggende undersøkelse vi brukte en høyere konsentrasjon i KRC /Y-celler [36]. Dermed kan vi ikke helt utelukke muligheten for at mobilnettet skader på grunn av Hoechst farging var ansvarlig for forskjellen i biologiske egenskaper observert mellom KRC /Y celler in vivo og in vitro i vår nåværende studie.
Bussolati et al. tidligere rapportert i en human RCC cellelinje som CD105-positive celler representerte en cellegruppe med høy clonogenicity og høy tumorigenicity; Men vår nåværende studie fant at mens KRC /Y SP cellene inneholdt omtrent fem ganger så mange CD105-positive celler som KRC /Y NSP celler, var det ingen forskjeller i CSC-LC egenskaper mellom KRC /Y SP og NSP celler. I tillegg ble CD105 ekspresjon funnet i noen få celler i ACHN. Dermed vår nåværende resultater konflikt med funnene i Bussolati et al., Og antyder muligheten for at CD105 ikke kan være en universell CSC markør i RCC.
Mange nyere studier har rapportert at SP cellene viser en høyere uttrykk for ABC transportører, særlig ABCG2, enn NSP celler i mange faste tumorer og cellelinjer, og at dette kan spille en rolle i medikament-utløps og medikamentresistens. Uttrykket av legemiddeltransportører via ABCG2 er en viktig markør i identifisering og analyse av SP celler [19], [20], [31], [37]. I foreliggende studie, ble det observert noen forskjell i ABCG2 ekspresjon på mRNA-nivå mellom SP og NSP-celler i en av de to RCC-cellelinjer som ble studert. Men de siste årene har flere studier har rapportert at SP celler uttrykker andre transportører som ABCB1 og ABCB5, i tillegg til ABCG2 [38], [39]. Derfor kan dette resultatet skyldes ekspresjonen av de andre transportører i SP-celler, eller det kan skyldes at funksjonene til ABCB1 og ABCG2 ikke ble reflektert av mRNA-ekspresjon av disse genene. Dette punktet må bli ytterligere undersøkt.
neste, for å studere andre CSC markører, utførte vi en Aldefluor assay. ALDH1 enzymatisk aktivitet har blitt anerkjent i de siste årene som en generell markør for både normale stamceller og cscs [40], [41]. ALDH1-positive celler har CSC-LC-egenskaper, slik som evnen til selv-replikasjon og for å danne svulster, slik at en rekke forskere har brukt ALDH1 enzymatisk aktivitet som et CSC markør i mange forskjellige typer kreft, inkludert lungekreft, lever, bukspyttkjertel , prostata, blære, bryst og malignt melanom [42] – [46]. Det har også blitt rapportert i bryst og flere andre kreftformer som høy ALDH1 ekspresjon er nært assosiert med dårlig prognose klinisk [23]. Nylig har sfære formasjons analysene vært mye brukt for å vurdere selvfornyelse kapasitet på CSC-LCS.
