Abstract
XMRV, eller xenotropisk murine leukemi virus (MLV) -relaterte virus, er en roman gammaretrovirus opprinnelig identifisert i studier som analyserte vev fra pasienter med prostatakreft i 2006 og blod fra pasienter med kronisk utmattelsessyndrom ( CFS) i 2009. Men et stort antall påfølgende studier har ikke vist en sammenheng mellom XMRV infeksjon og CFS eller prostatakreft. Tvert imot, tyder nyere bevis på at XMRV er en forurensning som stammer fra rekombinasjon av to muse endogene retrovirus i løpet av aging av en prostata tumor xenograft (CWR22) i mus, genererer laboratorie-avledede cellelinjer som er XMRV-infisert. For å bekrefte eller avkrefte en sammenheng mellom XMRV og prostatakreft, analyserte vi prostata kreft vev og plasma fra et prospektivt samlet kohort av 39 pasienter samt arkiv RNA og prostatavevet fra den opprinnelige studie fra 2006. Til tross for omfattende microarray, PCR, FISH, og serologisk testing, ble XMRV ikke påvist i noen av de nylig innsamlede prøver eller i arkiv vev, selv om arkiv RNA forble XMRV-positive. Spesielt, arkiv VP62 prostatavev, fra hvilken prototypen XMRV stammen ble avledet, testet negativt for XMRV på re-analyse. Analyse av virale genomiske og humane mitokondrie-sekvenser viste at alle tidligere karakteriserte XMRV stammer er identiske, og at arkiv RNA var blitt forurenset av en XMRV-infisert cellelinje laboratorium. Disse funnene indikerer ingen sammenheng mellom XMRV og prostatakreft, og understreker den konklusjon at XMRV er ikke en naturlig ervervet menneske-smitte
Citation. Lee D, Das Gupta J, Gaughan C, Steffen jeg, Tang N, Luk KC, et al. (2012) grundig undersøkelse av person og Prospektivt samlet prøver avslører ingen bevis for XMRV infeksjon i prostata kreft. PLoS ONE 7 (9): e44954. doi: 10,1371 /journal.pone.0044954
Redaktør: Gilda Tachedjian, Burnet Institute, Australia
mottatt: 02.06.2012; Akseptert: 10. august 2012; Publisert: 18.09.2012
Copyright: © Lee et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Forfatterne ønsker å takke for støtte fra NIH /NCI CA103943 (R. Silverman), samt Charlotte Geyer Foundation, maltz Family Foundation, og Abbott Laboratories (til R. Silverman og E. Klein). G. Simmons er støttet av tilskuddet 1R21HL109761 fra National Heart, Lung, and Blood Institute (NHLBI). J. DeRisi støttes av Howard Hughes Medical Institute. C. Chiu støttes av NIH tilskudd R56-AI08952 og R01-HL105704, samt en Abbott Viral Discovery Award. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:. JDG, EK, JD, RS, KL, XQ og JH inngår som oppfinnere på ett eller flere av følgende publiserte XMRV-relaterte patentsøknader som inkluderer enten Cleveland Clinic, Abbott Laboratories, eller begge Cleveland Clinic og Abbott Laboratories som redere: Internasjonalt publikasjons tall WO2011 /002932; WO2011 /002936; WO2010 /075414; WO2006 /110589; WO2012 /024518 og WO2012 /024513. Abbott er den eneste mottaker som utstedte US patent 8,183,349 vedrørende XMRV. NT, KL, XQ, GS og JH er ansatte i Abbott Laboratories. DG er ansatt i Novartis Institutes for Biomedical Research. Disse potensielle konkurrerende interesser endrer ikke forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikk på deling av data og materialer.
Innledning
I 2006 sekvenser som tilsvarer en roman gammaretrovirus heter xenotropisk murine leukemi virus -relaterte virus (XMRV) ble identifisert i vev fra pasienter med prostatakreft etter radikal prostatektomi [1]. Oppdagelsen av XMRV ble utført ved å bruke en bredspektret mikromatriseanalyse (ViroChip) designet for å oppdage alle kjente virus så vel som nye virus på basis av sekvenshomologi [1], [2], [3]. Resultatene fra denne studien avslørte også en sammenheng mellom tilstedeværelsen av XMRV, og pasienter som er kjent for å være homozygote for R462Q variant av RNase L, et gen som tidligere koblet til den arvelig prostatakreft en locus [4]. Mutasjoner i RNase L som svekker den apoptotiske respons på virusinfeksjon ble antatt å reflektere økt mottakelighet for infeksjoner ved XMRV og foreslo en potensiell rolle for viruset i kreftutvikling [5], [6], [7], [8]. Selv om den første studie rapporterte en kobling mellom RNase L-variant prostatakreft og XMRV infeksjon, de fleste, men ikke alle, har senere studier ikke klart å påvise en slik forening [9], [10], [11], [12]. Siden denne første oppdagelsen, XMRV og MLV-relaterte virus sekvenser som ligner polytropisk MLV (P-MLV) ble også funnet hos pasienter med kronisk utmattelsessyndrom (CFS) [13], [14].
Senere rapporter har kastet tvil om sammenhengen mellom XMRV med prostatakreft eller CFS, og faktisk om XMRV er også funnet hos mennesker (anmeldt i [15]). Videre, de virale sekvenser fra XMRV-positive pasienter som manglet nivå av genetisk variasjon forventet for retrovirale infeksjoner [1], [14], noe som tyder på at XMRV kan ha oppstått fra prøven forurensning og ikke sann viral infeksjon. Nesten alle oppfølgingsstudier ved bruk av spesifikke PCR har i stor grad klart å påvise XMRV i enten CFS eller prostatakreft kohorter [12], [16], [17], [18], [19], [20], [ ,,,0],21], [22], [23], [24], [25], [26], [27], [28], [29], [30], [31], [32], noe som resulterer i tilbaketrekkings av de første avisene som knytter XMRV og P-MLV med CFS [33], [34]. En 2009 studie uventet funnet at en vanlig laboratorie-cellelinje kalt 22Rv1, avledet fra CWR22 human prostatakreft xenotransplantat, produserte høye titere av XMRV [35]. Dette ble etterfulgt av en studie fra Garson,
et al.
Viser at identiske XMRV integrasjons steder ble delt mellom putatively infisert prostata tumorvev og et eksperimentelt infisert laboratorium cellelinje [36], [37], noe som ytterligere undergrave utsiktene til at XMRV er en ekte menneskelig patogen. Til slutt, en 2011 studie fra Paprotka,
et al.
Ga sterke bevis for at XMRV er en 22Rv1-avledet laboratorium forurensning som stammer fra rekombinasjon av to muse endogene retrovirus i løpet av serie passering av CWR22 i nakne mus [38]. Den siste demonstrasjonen som XMRV og relaterte virus er ikke til stede i det primære prostata svulstvev fra pasienten CWR22 gir ekstra støtte for denne hypotesen [39].
Gitt de kliniske og folkehelse implikasjonene av potensielle XMRV infeksjon hos mennesker , søkte vi å bekrefte eller avkrefte sammenhengen mellom XMRV og prostatakreft. Hittil har de fleste av de negative studiene er gjennomført i CFS og ikke i prostata kreft, og noen har spekulert i at den opprinnelige oppdagelsen av XMRV kan faktisk reflektere
bona fide
virusinfeksjon, men som senere studier var potensielt skjemt av mus genomisk forurensning og /eller utbredt sirkulasjon av positive kontroll plasmider som inneholder XMRV smittsomme molekylær kloning VP62 [40], [41], [42]. Vi presenterer her en grundig undersøkelse ved hjelp prøver tatt fra både en prospektiv kohort av 39 nye pasienter med prostatakreft og den opprinnelige 2006 Urisman
et al.
Studie der XMRV ble oppdaget [1]. Spesielt arkiv radikal prostatektomi vev fra pasienten VP62, som brukes til å generere den VP62 klon anvendes i nesten alle nedstrøms molekylære og cellulære studier av XMRV [43], som var tilgjengelig for analyse. ViroChip microarray, PCR, fluorescens
in situ
hybridisering (FISH), serologiske og dyp sekvense-analyser ble utført i 4 forskjellige laboratorier (Fig. 1). De samlede funnene er mest forenlig med XMRV-assosiert laboratorium forurensning av prostata kreft vev analysert i original 2006 Urisman,
et al.
Studere [1] og gi en klar forklaring på hvordan slik forurensning kan ha skjedd.
Fargede bokser viser til forskningslaboratorium der den beskrevne analyse ble utført. For å minimere risikoen for PCR fragment forurensning, ble blindet XMRV-spesifikk PCR-testing utført separat i 3 uavhengige laboratorier.
Resultater
XMRV ikke oppdaget i nytt innsamlet Prostate Cancer Prøver og arkiv VP62 Tissue ved mikromatriser Screening
ViroChip microarray [2], [3], [44], [45] ble benyttet for å undersøke RNA prøver isolert fra prostatakreft samlet inn prospektivt fra 39 personer, hvorav 16 personer ble genotypede som skjuler den R462Q RNase L-mutasjon (QQ), 10 personer var heterozygote tilfeller (RQ), og 13 var vill-type saker (RR). Testing ble utført for fullt ut blindet for derved å fjerne skjevhet. Person prostatavev som svarer til den tidligere XMRV-positive VP62 prøve (QQ) og avledet fra det samme vev blokk som brukes i det opprinnelige 2006 Urisman
et al.
Studere [1], videre referert til som VP62 (2012) , var også tilgjengelig for microarray screening. Hierarkisk gruppering med varmekartet analyse viste at de 39 svulster, så vel som den re-ekstrahert VP62 (2012) prøve var negative for XMRV (fig. 2, «2012»).
Prøvene ble analysert ved hjelp av ViroChip, en pan-viral DNA deteksjon microarray (x-aksen). Varmen Kartet viser en utvalgt klynge bestående av 96 gammaretrovirus sonder (y-akse) og som svarer til det samme område observert i undersøkelsen 2006 av Urisman,
et al product: [1]. Den røde fargen metning angir den normaliserte omfanget av hybridisering intensitet. Mikromatriser tilsvarende viktige prøvene er uthevet (piler). Bare prostatakreft prøvene VP35 og VP42 ble funnet å være konsekvent positivt for XMRV fra både totalt og polyA RNA [1].
XMRV ikke oppdaget i nytt innsamlet Prostate Cancer Prøver og arkiv VP62 vev ved Nucleic Acid testing (NAT)
Tre ulike forskningsinstitutter (Blood Systems Research Institute, Abbott Laboratories, og Cleveland Clinic) utført uavhengige PCR-basert NAT analyser for
gag, pol
, eller
env
gener av XMRV, henholdsvis. RNA fra prostata kreft vev som tilsvarer de 39 personer som er identifisert i den prospektive studien ble først hentet i en separat mus-fri, XMRV PCR fragment fritt laboratorium (University of California, San Francisco). Kodede RNA replikater ble deretter fordelt på en blindet måte til hver av de 3 laboratorier for XMRV NAT. Sensitivitet og spesifisitet ytelseskarakteristikker for hver av de 3 NAT analysene er blitt vurdert tidligere [25], [39], [46]. For alle 3 laboratorier, ingen av de 39 prøvene hadde påvisbare XMRV sekvenser (tabell 1). Negative resultater ble også oppnådd for arkiv VP62 (2012) prøve av alle tre XMRV
gag, pol, etter og
env
analyser. I kontrast, ble en positiv kontroll ved hjelp GADPH (BsrI eller Cleveland Clinic) og β-globulin (Abbott) hell forsterkes for hver prøve.
XMRV oppdaget i RNA Ekstrakter Tilsvarende Tidligere XMRV-positiv Prostate Cancer prøvene ved mikromatriser og NAT
Et begrenset antall totale eller polyadenylerte (poly A) RNA prøver (n = 21, tilsvarende 14 unike prøver) fra den opprinnelige 2006 studie av Urisman,
et al.
[1], 6 tidligere funnet å være XMRV-positive og 8 XMRV-negative, var tilgjengelig for uavhengige re-analyse. De 21 RNA prøver ble først analysert ved hjelp av ViroChip microarray. I samsvar med tidligere resultater [1], et positivt hybridiseringssignal utelukkende består av gammaretrovirus prober og som svarer til XMRV ble detektert bare i RNA ekstrakter fra de 6 tidligere XMRV-positive prøver og den 22Rv1 positiv kontroll (figur 2;. Tabell 2). Etter microarray analyse, som er tilgjengelig gjenværende materialet tilsvarer 17 totalt og /eller polyA RNA prøver (13 unike prøver) ble testet for XMRV ved
gag
RT-PCR. Alle PCR-resultater var i overensstemmelse med mikroarray data (tabell 2), og alle de positive PCR-resultater ble sekvensen bekreftet å være XMRV og ikke en annen variant MLV, med 98-99% identitet med den kanoniske 22Rv1 XMRV sekvensen (GenBank deponeringsnummer FN692043 ).
XMRV ikke oppdaget i nytt innsamlet Prostate Cancer Prøver og arkiv VP62 vev ved FISH
Fluorescence
i situ
hybridisering (FISH) ble brukt til å screene for tilstedeværelsen av XMRV genomiske sekvenser i formalinfikserte, parafininnstøpte (FFPE) vevssnitt fra VP62 (2012) og 19 nylig innsamlede svulster (en undergruppe av de 39 enkeltpersoner i den prospektive studien). Blant de 19 individer med tumorer ble analysert, ble 11 personer genotypede som skjuler den R462Q RNase L-mutasjon (QQ), 3 personer var heterozygote tilfeller (RQ), og fem var vill-type saker (RR). Alle prøvene var jevnt negativt med den XMRV-spesifikk probe (representative felt er vist på fig. 3, D og JL), selv om flekker fra XMRV-infiserte 22Rv1 celler var positive (fig. 3A), og en positiv indre styresignal som svarer til den centromeric region av kromosom 8 (CEP8) ble konsekvent observert (fig. 3, C, F og i). Dermed undersøkelse av FFPE- deler av FISH viste ingen tegn til XMRV infeksjon i prostata kreft vev, uavhengig av RNase L genotype.
En probe hybridisering blanding som inneholder XMRV-SO probe (full-lengde XMRV VP62) og CEP8- SA internkontroll-probe (komplementær til en centromeric region av humant kromosom 8) ble påført på hvert objektglass. (A) Et representativt bilde av XMRV-SO orange farging fra en celleblanding av DU145 (uinfiserte; negativ XMRV farging) og 22Rv1 (XMRV-infiserte; sterk positiv XMRV farging), som viser to positivt fargede celler. (B) DAPI atom farging. (C) CEP8-SA aqua flekker som illustrerer to og tre CEP8 aqua signaler per 22Rv1 og DU145 celle, henholdsvis; (D-F) Representative bilder av FFPE prostata kreft vevssnitt fra pasient VP62 (XMRV-SO, DAPI, og CEP8-SA, henholdsvis). Ingen XMRV-SO oransje farging observert. Den hvite rektangelet skisserer regionen forstørret i paneler G-I (G-I) En forstørret bilde av FFPE prostata kreft vevssnitt fra pasient VP62 (XMRV-SO, DAPI, og CEP8-SA, henholdsvis). På dette forstørrelse, er CEP8-SA aqua flekker klart synlig (panel jeg, hvite piler markere to representative CEP8 aqua-signaler). (J-L) Representative bilder som viser ingen XMRV-SO oransje flekker i FFPE- prostatakreft vevssnitt fra 3 representative pasienter (mellom prospektivt samlet kohort av 39 pasienter).
Ingen serologisk bevis på XMRV infeksjon i prostatakreftpasienter
de 39 plasmaprøver som tilsvarer de personer som er identifisert i den prospektive studien ble undersøkt for forekomst av antistoffer mot XMRV eller andre MLV. Ingen var reaktive mot p15E transmembranprotein, og bare to prøvene var svakt reaktive med gp70 kappeprotein (fig. 4). Men senere testing av de to gp70-reaktive prøver med en p30 analysen viste ingen påvisbare antistoffer mot p30 kapsid protein. Dermed disse dataene gir ingen serologisk bevis for XMRV eller andre MLV infeksjon hos disse pasientene.
Evaluering av 39 plasmaprøver fra pasienter med prostatakreft for tilstedeværelsen av antistoffer mot XMRV /MLV ved hjelp av rekombinant baserte XMRV p15E og gp70 chemiluminsescent mikropartikkelimmunanalyser (CMIAs) [70]. X-aksen representerer den CMIA signal uttrykt i enheter av naturlig log-transformerte signal forholdet av prøven til cutoff (log N S /CO); verdier større enn 0 blir ansett som positive. Signaler om de positive kontroller (PC1 og PC2) tilsvarende XMRV-infiserte macaque plasma og negativ kontroll (NC) som tilsvarer en normal blodgiver er uthevet i mørk grønn.
Full-lengde genomene til XMRV er til stede i RNA Utdrag fra tidligere positive Prostate Cancer Prøver
i den opprinnelige 2006 papir ved Urisman,
et al. product: [1], tre helaftens ~8.2 kb genomene til XMRV ble gjenvunnet ved spesifikk PCR og sekvensering av klonede PCR-fragmenter fra 3 forskjellige prostatakreft prøver (VP35, VP42, og VP62). For å karakterisere sine viral genomer i større dybde, analyserte vi RNA ekstrakter fra disse 3 prøver av objektiv neste generasjon, eller «dyp» sekvensering. Omtrent 14,6 til 18300000 tilfeldig hagle leser ble generert per prøve, og 4713, 34192 og 2131 leser ble kartlagt til XMRV genomer tilsvarer VP35, VP42, og VP62, henholdsvis (Fig. 5). Den kartlagte leser representerte dekning av hele genomet for hver av prøvene, med den dypeste dekning oppnås for VP42.
De novo
montering av 1 kb regioner i fravær av et referansegenom produsert sammenhengende sekvenser (contigs) som på linje med høyest likhet med XMRV genomer og ikke til relaterte MLVs (data ikke vist). Ingen leser svarende til mus mitokondriell eller intracisternal A-partikkel (IAP) sekvenser ble påvist i disse 3 prøver med dyp-sekvensering og spesifikke RT-PCR (data ikke vist). Disse resultatene tyder på at full-lengde XMRV genomet er til stede i alle 3 kliniske prøver, og argumenterer mot muligheten for blandet infeksjon med andre MLV-lignende retrovirus. Deep sekvensering av RNA ekstrakter fra reekstrahert arkiv VP62 (2012) vev ble også utført. Viktigere, mens RNA fra prøven VP62 ekstrahert i 2006 var positiv for XMRV, RNA ble ekstrahert fra det samme prostatavev i 2012 ble funnet å være negativ, ikke bare ved ViroChip og PCR (figur 2;. Tabell 1), men også ved dype sekvensering, uten XMRV sekvenser oppdaget av 4.000.000 dyp sekvensering leser (fig. 5).
RNA ekstrakter av 22Rv1 og LNCaP celler, prostata kreft vev fra 2006 Urisman,
et al.
studie [VP35, VP42, og VP62 (2006)], og re-ekstrahert vev fra VP62 prøven, VP62 (2012), ble analysert ved objektive dyp-sekvensering. Leser blir konvertert til den tidligere sekvensert XMRV genomet som tilsvarer hver av prøvene, med unntak av lyder fra LNCaP, som er kartlagt til 22Rv1-forbundet genom (Genbank tiltredelse antall FN692043). Dekningen (y-aksen) oppnådd ved hver posisjon langs ~8.2 kB XMRV genom (x-aksen) er plottet på en logaritmisk skala. Forkortelser: nt, nucleotide
Mangel på mangfold av XMRV avslørt av Deep Sekvense
I 2011 Paprotka,
et al
rapportert at XMRV sannsynlig oppsto gjennom.. rekombinasjon mellom 2 endogene murine retrovirus, PreXMRV-en og PreXMRV-2, under
in vivo
aging av menneske prostatakreft xenograft CWR-R1, noe som resulterer i etableringen av XMRV-infiserte 22Rv1 cellelinje [38]. Konsensus sekvens av 22Rv1-assosiert XMRV er nesten identisk med virale genomer isolert fra prostatakreft og CFS-pasienter, inkludert VP35 (13 uoverensstemmelser), VP42 (8 uoverensstemmelser), og VP62 (5 uoverensstemmelser). For å bestemme den nøyaktige forholdet mellom sekvenser av konsensus 22Rv1 genomet og 3 XMRV genomer utvinnes i det opprinnelige 2006 Urisman,
et al.
Studere [1], et enkeltnukleotidpolymorfi (SNP) analyse av nukleotid- forskjellene mellom 22Rv1 konsensussekvensen og de tidligere publiserte sekvenser av VP35, VP42, eller VP62 ble utført (fig. 6). SNP-analyse viser at den rapporterte variasjon i de publiserte genomer fra 2006 trolig skyldes feil introdusert i løpet av PCR eller sekvensering ved UCSF og ikke fra iboende fylogenetisk mangfold av XMRV [47]. Når disse feilene er korrigert på basis av overflødig dyp sekvense dekning, de endelige konsensussekvensene av VP35, VP42, og VP62 er identiske med hverandre og til den 22Rv1 konsensussekvensen, inkludert en tidligere beskrevet naturlig polymorfisme (A → G) i posisjon 790 [23], [38].
etter SNP analyser, single nucleotide forskjeller mellom sekvenser av 22Rv1-forbundet XMRV og XMRV genomer oppdaget i prostata kreft vev [VP35, VP42, og VP62 (2006)] ( røde slikkepinner) er korrigert av den dype sekvensedekningsdata (svarte Lollipop). Dybden av lese dekning oppnås ved nukleotid-posisjon svarende til hver SNP vises under x-aksen. Alt leser som dekker en gitt posisjon ga den samme (korrigert) nukleotid, noe som indikerer at tidligere nukleotidforskjeller i publiserte genomer [1] (røde slikkepinner) er på grunn av sekvenseringsfeil. En naturlig A → G polymorfisme i XMRV genomet [23], [38] er til stede i posisjon 790 (cyan lollipop). Merk at XMRV konsensus genomer forbundet med 22Rv1, LNCaP, og de tre XMRV-positive prostata kreft vev er identiske.
XMRV infeksjon av en 2003 LNCaP cellelinje avslørt av Deep Sekvense
unnlatelse av å oppdage XMRV i re-hentet arkivmateriale fra VP62 prøven og mangel på sekvens mangfold blant de XMRV VP35, VP42, og VP62 konsensus genomer hevet muligheten for forurensning av prostatakreft prøvene i 2006 Urisman,
et al.
studie av en laboratorie-avledet cellelinje, enten kjent for å være infisert med XMRV, slik som 22Rv1 [35], [38], eller i stand til å understøtte XMRV infeksjon og potensielt infisert, slik som LNCaP [43], [48]. Vi tenkte at forurensning fra XMRV-infiserte LNCaP celler ble mer sannsynlig gitt at laboratoriet ved Cleveland Clinic utfører de nukleinsyre ekstraksjoner i 2004 ble samtidig arbeider med LNCaP og hadde bare jobbet med 22Rv1 mer enn 2 år før. For å undersøke denne muligheten, ble prøver av 2003 LNCaP celler fra Cleveland Clinic laboratoriet og 2012 LNCaP celler fra UCSF Cell Culture Facility testet for XMRV ved
gag
RT-PCR (Fig. 1). LNCaP celler behandlet i laboratoriet fra 2003 var positive for XMRV, mens LNCaP celler fra 2012 var negative. XMRV-positive 2003 LNCaP-celler ble deretter ytterligere analysert ved objektive dyp-sekvensering. Fra totalt 10.896.742 rå dyp sekvensering leser, leser 40844 ble kartlagt til 22Rv1-assosiert XMRV genomet (Fig. 5, «LNCaP (fra 2003)»), og den resulterende konsensus forsamlingen ble funnet å være identisk med 22Rv1-forbundet XMRV (fig. 6, «LNCaP (fra 2003, konsensus)»).
Hel-Genome XMRV og mitokondrie SNP analyse Støtter sannsynligheten for kontaminering av prøver fra XMRV-infisert LNCaP cellelinje
for å karakterisere intra-stammen mangfoldet i LNCaP- og 22Rv1-forbundet XMRV genomer, en SNP analyse av sammensatte XMRV genomer på 471X og 540X gjennomsnittlig dekning, henholdsvis, ble utført. Varianter innenfor XMRV genomer ble funnet å være sjeldne, med bare 25 SNP’er detektert i LNCaP og 19 SNP’er detektert i 22Rv1 ved en frekvens cutoff på 3% (Figur 7A og B;. Tabeller S1 og S2). Interessant, de tre vanligste SNP varianter oppdages i LNCaP og 22Rv1-forbundet XMRV genomer, den nevnte A → G polymorfisme i posisjon 790, en A → G polymorfisme i posisjon 4264 og en C → G polymorfisme i posisjon 8112, kan også være funnet i VP35, VP42, og VP62 XMRV genomer, med unntak av at C → G polymorfisme ikke er observert i VP35 grunn av manglende sekvens dekning. Samlet sett flere SNPs fra LNCaP-forbundet XMRV enn fra 22Rv1-forbundet XMRV ble funnet å bli delt med prostata kreft XMRV genomer. I tillegg til varianten SNP frekvens på polymorfe 790 stilling, som strekker seg fra 13,6% til 16,4% for de prostatakreft XMRV genomer, ble mer sammenlignbar for den LNCaP-assosiert XMRV (18,3%) enn for den 22Rv1-assosiert XMRV (3,4% ) (fig. 6). Disse observasjonene lånte ekstra støtte for forutsetningen for prostatakreft vev forurensning av XMRV-infisert LNCaP, og ikke 22Rv1, celler.
SNP analyse av dyp sekvensering leser tilsvarer de XMRV genomene til 22Rv1 (A) og LNCaP ( B), så vel som mitokondrie genomene til disse to cellelinjer (C) ble utført. (A og B) SNP varianter innenfor XMRV genomet for 22Rv1 og LNCaP (x-aksen) er vist i synkende frekvens (y-aksen). Delt SNPs i XMRV genomer som tilsvarer 3 XMRV-positive prostatakreft prøver (VP35, VP42, VP62) og LNCaP (z-aksen) med en frekvens cutoff på 0,5% er plottet på grafen, med viktige SNPs uthevet i rødt. SNPs med variant frekvenser 0,5% er plottet som null; manglende verdier (tomme firkanter) refererer til SNP stillinger hvor dekningen er 10X. (C) SNP varianter innenfor den mitokondrielle genomet for 22Rv1 og LNCaP er vist (x-aksen), med frekvensen for hver 22Rv-1- /LNCaP-assosiert SNP i den generelle befolkning, som bestemt ved en populasjonsnivå human mitokondrie databasen [50], gitt i parentes. For hver prostata cancer-assosiert mitokondrielle genom (z-aksen), er minoritets SNP frekvens (y-akse) plottet mot cellelinje-assosiert SNP variant (x-aksen), ved hjelp av en grensefrekvensen på 3%. For hver mindretall SNP identifisert, er varianten frekvens og dekning på det tilsvarende nukleotid-posisjon som er vist. Minoritets SNPs med variant frekvenser 3% plottes som null; manglende verdier (tomme firkanter) refererer til SNP stillinger hvor dekningen er 30X. Merk at VP62 prøve aksjer en 146C mitokondrie SNP med LNCaP (stjerne).
For ytterligere å undersøke denne muligheten, vi neste søkte etter tegn på en direkte forurensing av prostatakreft prøvene av XMRV-infiserte LNCaP eller 22Rv1 ved hjelp av en mitokondrie RNA (mtRNA) profilering strategi. De ~16.5 kb mitokondrielle genomer av 22Rv1 og LNCaP ble samlet fra 555,977 og 171,418 mtRNA dyp sekvensering leser, henholdsvis. Det var 6 nukleotidforskjeller i LNCaP mitokondrie genome og 13 forskjeller i 22Rv1 mitokondrie genome i forhold til den menneskelige mitokondrie Cambridge Referanse Sekvens (CRS) (GenBank NC_012920) [49]. De mitokondrielle genomer fra VP35, VP42, og VP62 ble deretter satt sammen fra gjenvunnet mtRNA leser og skannet for tilstedeværelsen av minoritets SNPs som skulle tilsi tilstedeværelsen av spor forurensning fra LNCaP eller 22Rv1 cellelinje-forbundet mitokondrielle sekvenser (Fig. 7C). Ved hjelp av en cutoff på 3% for å definere et mindretall SNP, 6 av 6 SNPs i felles mellom de mitokondrielle genomer av VP42 og LNCaP og 5 av 6 SNPs i felles mellom VP35 og LNCaP ble oppdaget. Andre spredte minoritets SNPs ble funnet å være delt mellom de mitokondrielle genomer fra VP35, VP42, VP62, LNCaP og 22Rv1. Det er ingen SNP’er svarende til enten den LNCaP eller 22Rv1 mitokondriegenomet ble funnet i noen av de XMRV-negative prøver, inkludert arkiv VP62 (2012) prøve. Tilstedeværelsen av flere SNPs som er entydig VP35, VP42, eller VP62 (data ikke vist) bekrefter at prostatavevet RNA var til stede, og dermed at de delte minoritets SNPs var resultat av LNCaP og /eller 22Rv1 forurensning. Basert på andelene av SNP varianter i den menneskelige befolkning som estimert fra en populasjonsnivå mitokondriell database (mtDB) [50], er sannsynligheten for å dele alle 6 SNP’er felles mellom VP42 og LNCaP ved tilfeldige alene er anslått til mindre enn 0,00146 %.
Diskusjoner
i denne studien undersøkte vi den antatte sammenhengen mellom XMRV og prostatakreft ved hjelp av en kombinasjon av microarray, PCR, FISH, serologiske, og dypt sekvense tilnærminger. XMRV ble ikke påvist i et nytt sett av 39 prospektivt innsamlede prostatakreft (både med og uten RNase L mutasjoner) av PCR-analyser som utføres uavhengig i 3 forskjellige laboratorier eller ViroChip microarray. Videre XMRV ble ikke påvist i arkiv VP62 vev tidligere funnet å være XMRV-positive [1]. Disse negative funn ble støttet av unnlatelse av å oppdage XMRV sekvenser i 19 av de nylig innsamlede prostatakreft prøver og arkiv VP62 vev av fisk. I tillegg har vi klart å påvise antistoffresponser til XMRV i plasmaprøver fra 39 pasienter med prostatakreft, et funn som også ble observert nylig i en annen studie [51] Tatt sammen, de data som presenteres her tyder sterkt på at det ikke er noen sammenheng mellom XMRV infeksjon og prostatakreft, uavhengig av RNase L status.
i den opprinnelige 2006 studie av Urisman, et al. samt en 2010 studie av Arnold, et al. [1], [9], XMRV ble detektert i en liten andel av ikke-ondartede stromale celler av fisk. Det er uklart hvorfor XMRV ble oppdaget av fisk i disse tidligere studier, men ikke i den aktuelle studien, som omfattet re-analyse av arkiv VP62 vev. Her brukte vi en direkte-merket, full-lengde plasmid XMRV sonde med en høy etikett inkorporasjonsraten [52], som produserte en klar punktformet flekkmønster i 22Rv1 celler ved FISH (Fig. 3A). Av notatet, denne romanen probe designet var i stand til å oppdage humant papillomavirus (HPV) i livmorhalskreftceller som bærer en til to kopier av integrert HPV-16 per celle, så vel som i livmorhalskreft vevssnitt (data ikke vist). Dermed, hvis integrert XMRV var til stede i de undersøkte vev i denne studien, det burde ha blitt oppdaget av fisk. Det er sannsynlig at den lave hyppigheten av XMRV FISH-positive prostata celler observert i tidligere studier [1], [9] representerer ikke-spesifikke bindings gjenstander.
For å undersøke om oppdagelsen av XMRV kan ha resultert fra utilsiktet laboratorium forurensning, vi re-analysert tilgjengelige arkiv RNA ekstrakter fra prostatakreft prøver tatt fra den opprinnelige 2006 studie av Urisman,
et al product: [1]. Ved microarray og PCR-analyse, ble de tidligere funn om at en undergruppe av disse prøvene næret XMRV sekvenser replikert (figur 2;. Tabell 2). Videre objektiv dyp sekvensanalyse av 3 XMRV-positive prøver (VP35, VP42, og VP62), avslørte at hele virusgenomet var til stede (fig. 5). Unnlatelse av å oppdage mus mitokondrie eller IAP sekvenser i disse 3 prøvene støtter også påstanden om at disse prøvene havn XMRV og ikke relatert muse endogene gammaretroviruses.
Et av funnene kranglet mot laboratorie- forurensning som en mulig kilde til XMRV har vært graden av sekvensvariasjon observert mellom XMRV genomer, opp til 2% i
gag Hotell og
pol
fragmenter [1], [14]. Selv om rapportert mangfoldet er ekstremt lav for retrovirus generelt [53], enkelte retrovirus som HTLV-en kan vise sammenlign lave priser av naturlig sekvensvariasjon, med stammer i naturen som er 96-99% identisk [54]. Likevel SNP data generert fra dyp-sekvensering viser at konsensussekvensene av XMRV VP35, VP42, og VP62 genomer er i virkeligheten identiske med hverandre og til konsensus 22Rv1-assosiert XMRV stamme (fig. 6). Således tidligere rapporterte sekvens variasjon mellom forskjellige stammer i studien 2006 av Urisman,
et al.
[1] og antagelig i andre inkludert snø eller delvis sekvenserte genomer XMRV synes å skrive seg fra Taq-polymerase feil introdusert i løpet av PCR
