Abstract
Bakgrunn og Aim
Endret uttrykk for microRNAs (miRNAs) kjennetegnene mange krefttyper. Studiet av sammenslutninger av miRNA uttrykket profil og kreft fenotype kan bidra til å identifisere sammenhenger mellom deregulering av miRNA uttrykk og onkogene trasé.
Metoder
Expression profilering av 866 mennesker miRNAs i 19 kolorektal og 17 bukspyttkjertel kreft og i matchet tilstøtende normalt vev ble undersøkt. Klassisk paret t-test og tilfeldige skog analyser ble anvendt for å identifisere mirnas forbundet med vevs-spesifikke tumorer. Nettverksanalyse basert på en beregnings tilnærming til mine assosiasjoner mellom krefttyper og mirnas ble utført.
Resultater
fusjon mellom de to statistiske metoder som brukes for å krysse de mirnas forskjellig uttrykt i tykktarm og bukspyttkjertel kreft tillot identifisering av kreftspesifikke miRNA endringer. Ved miRNA-nettverksanalyse, ble vevsspesifikke mønstre av miRNA deregulering spores: kjøre mirnas var
MIR-195, MIR-1280, MIR-140-3p Hotell og
MIR-1246
i kolorektale svulster, og
MIR-103, MIR-23a Hotell og
Mir-15b
i bukspyttkjertel kreft.
Konklusjon
miRNA uttrykk profiler kan identifisere kreft -spesifikke signaturer og potensielt nyttige biomarkører for diagnostisering av vev-spesifikke kreftformer. miRNA-nettverksanalyse bidra til å identifisere endret miRNA regulatoriske nettverk som kan spille en rolle i tumor patogenesen
Citation. Piepoli A, Tavano F, Copetti M, Mazza T, Palumbo O, Panza A, et al. (2012) Mirna Expression Profiler Identifisere drivere i Kolorektal og bukspyttkjertel kreft. PLoS ONE 7 (3): e33663. doi: 10,1371 /journal.pone.0033663
Redaktør: Alfons Navarro, Universitetet i Barcelona, Spania
mottatt: 17 november 2011; Godkjent: 14 februar 2012; Publisert: 30 mars 2012
Copyright: © 2012 Piepoli et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av departementet for italienske helse gir RC0903GA51, RC1003GA52, RC1103GA47, RC0903CH47, RC1003CH50, RC1103CH46, RC1003BS14 og RC1102BS45 gjennom Research Unit of Gastroenterology, Research Unit of Surgery, og Enhet for biostatistikk; og Casa Sollievo della Sofferenza (IRCCS), San Giovanni Rotondo (FG), Italia. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
microRNAs (mirnas) er små ikke-protein-kodende RNA-molekyler som regulerer genekspresjon i hovedsak på nivå med proteinsyntese [1]. De representerer en evolusjonært konserverte system som kontrollerer viktige cellulære prosesser, som for eksempel utvikling, differensiering, proliferasjon, apoptose, og metabolismen [2]. Avvikende uttrykk for miRNAs kan oppstå fra sletting, mutasjon, og metylering av miRNA-koding gener, hvorav mange ligger på genomiske sårbare områder eller regioner ofte slettet eller forsterket i kreft [3]. Basert på disse premissene, har de vist seg å samhandle med potensielle onkogener eller tumor suppressors [4]. Mange mirnas uttrykkes i et vev-spesifikk måte, med profiler differensielt uttrykt i enten normale og neoplastiske vev, og i tumorer med forskjellige biologiske egenskaper. I tillegg er noen bevis tyder miRNA profiler for å tillate sikker identifikasjon av cellen opprinnelses av svulster [5].
Klassisk, differensial uttrykk for miRNAs har blitt evaluert enten som enkeltbidrag eller som prediktiv signatur [6 ], [7]. Imidlertid mye vitenskapelig arbeid er for tiden brukt til å klargjøre deres funksjon: de fleste mirnas kontroll minst en mRNA, og de fleste mRNA styres av mer enn en miRNA [8]. Kompleksiteten bak dette sofistikerte mekanismen kan delvis lindres av kunnskap om bevaring nivåer av hver miRNA. Faktisk, høy verne over store fylogenetiske avstander hjelper begrense utvalget av funksjoner som en miRNA kan spille for å regulere kontroll av arter utvikling og fysiologi.
I denne studien undersøkte vi uttrykk mønstre av mirnas i kolorektal (CRC) og kreft i bukspyttkjertelen (PC) med den hensikt å identifisere miRNA regulatoriske nettverk sannsynlig involvert i onkogene trasé ved å evaluere kreftspesifikke signaturer gjennom analyse av forholdet mellom miRNA uttrykket profil og kreft linjene.
Materialer og metoder
Prøver Utvalg og RNA Utvinning
Primær svulst og nærliggende ikke-tumor vev ble hentet fra to trenings kohorter av 19 CRC pasienter og 17 PC-pasienter, og fra to validerings kohorter av 14 CRC og 21 PC-pasienter .. studien ble utført med godkjenning av den vitenskapelige og Etikk komiteer i IRCCS «Casa Sollievo della Sofferenza» Institute, San Giovanni Rotondo, FG (Italia). Pasientene ga informert skriftlig samtykke i henhold til italiensk lov om personvern (sørge for beskyttelse av personopplysninger), så enkeltpersoner ikke kan identifiseres fra data eller bilder som er inkludert i denne publikasjonen, og godkjent av vitenskaps og Etikk komiteer i IRCCS » Casa Sollievo della Sofferenza «Institute. Alle kliniske undersøkelser har blitt utført i henhold til de prinsipper som er nedfelt i Helsinkideklarasjonen.
Pasient kliniske data, svulst plassering og iscenesettelse er vist i tabell S1. Vevsprøver ble flash-frosset i flytende nitrogen og lagret ved -80 ° C til nukleinsyrer ekstraksjon. Ca 150-200 mg ferskt frosset vev ble anvendt for å isolere total RNA med fenol-ekstraksjon (TRIzol Reagent, Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA, USA). RNA konsentrasjon og renhet ble kontrollert av Nano Drop Specthophotometer. Agilent 2100 Bioanalyzer ble brukt til å måle den mengde, integritet og renhet av små RNA og total-RNA, og kun ikke nedbrutt RNA, karakterisert ved en RNA integritet nummer 7 med ingen tegn til DNA-kontaminering ble behandlet
mirna. mikromatriser
miRNA uttrykket profilen ble bestemt ved hjelp GeneChip® miRNA Array (www.affymetrix.com). Denne rekken inneholder 46,228 sonder omfatter 7,815 sonde, blant annet kontroller, og dekker 71 organismer som menneske, mus, rotte og hund. Innholdet er hentet fra Sanger miRBase miRNA database v.11 (15 april 2008, https://microrna.sanger.ac.uk). Probe sett rettet mot menneske snoRNAs og scaRNAs er utledet fra snoRNABase (www.snorna.biotoul.fr/coordinates.php) og Ensembl (www.ensembl.org/biomart/martview~~number=plural) arkiver, Kort, 1,5 mikrogram total RNA ble merket bruker 3DNA Array Detection FlashTag ™ RNA Merking Kit (https://www.genisphere.com), i henhold til produsentens anbefalinger. Først ble poly (A) tailing utført ved 37 ° C i 15 min i et volum på 15 ml reaksjonsblanding som inneholdt 1 x reaksjonsbuffer, 1,5 ml MgCl2 [25 mM], 1 pl ATP miks fortynnet 1:500 og ett ul PAP enzym. For det andre ble flash Tag Ligering utføres ved romtemperatur i 30 min ved tilsetning av 4 pl 5X Flash Tag ringsblandingen Biotin og 2 pl T4-DNA-ligase i 15 ul reaksjonsblanding. For å stoppe reaksjonen ble 2,5 ul stoppløsning tilsatt. Prøvene ble hybridisert, vasket og skannet med Affymetrix Scanner.
Alle microarray data er MIAME kompatibel og rådata har blitt deponert i ArrayExpress (tiltredelse antall E-mtab-752 for tykktarmskreft miRNA uttrykk profiler og E- mtab-753 for bukspyttkjertelkreft miRNA uttrykk profiler).
Kvantitativ estimering av miRNA ved revers transkripsjon real-Time PCR-analyse
kvantitativ real-time polymerase chain reaction (qPCR) av miRNAs ble utført ved hjelp TaqMan mikroRNA analyse (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) med ABI-PRISM 7700 Sequence Detection System. En to-trinns-protokollen krever revers transkripsjon med en miRNA-spesifikke primer, etterfulgt av en real-time PCR med TaqMan prober. Analysene målrette bare modne mirnas, ikke deres forløpere. I korte trekk, reverstranskriptasehemmere reaksjoner inneholdt 10 ng av RNA prøver, 50 nM stemloop RT primer, 10X RT buffer, 0,25 mM hver av dNTP, 3,33 U /mL MultiScribe RT og 0,25 U /mL RNase inhibitor (alle kjøpt fra cDNA Arkiv kit Applied Biosystems) ble utført på sluttvolum på 15 pl og inkubert i termal cycler i 30 minutter ved 16 ° C, 30 min ved 42 ° C, 5 min ved 85 ° C og deretter holdt ved 4 ° C. Den 20 ul PCR-reaksjonsblanding inkludert 1,3 ul RT produkt (01:15 diluition), 10 mL av TaqMan 2X Universal PCR Master Mix (NoUmpErase UNG) og 1 mL av TaqMan 20X mikroRNA-analyse (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) . Reaksjonene ble inkubert i en 96-brønners optisk plate ved 95 ° C i 10 minutter, etterfulgt av 40 sykluser på 95 ° C i 15 sekunder og 60 ° C i 10 min. Alle analyser ble utført i tre eksemplarer.
Statistical Analysis
pasientenes individuelle karakteristika ble rapportert som gjennomsnitt ± standardavvik (SD) eller frekvenser og prosenter for kontinuerlige og kategoriske variabler, henholdsvis.
for hver av de to trenings kohortene, mikroRNA chip data ble normalisert ved hjelp av Robust Multi-matrise Average (RMA) algoritme [9]. For å identifisere forskjellig uttrykt mirnas mellom sammenkoblede normale og tumorvev ble to tilnærminger fulgt. For det første, en klassisk paret t-test kontrollerende for falsk funnrate (FDR) tillatt vurdering mirnas henhold til deres p-verdier. For det andre ble tilfeldig skog (RF) analyse [10] anvendes for å detektere mirnas med den beste evne i å diskriminere tumor fra sammenkoblede normale vev. En RF er en klassifikator som består av en samling av tre-strukturert classifiers. I henhold til denne teknikk, ble 100000 trær bygget for å klassifisere vev. Lærings sett brukes til å vokse hvert tre var en .632+ bootstrap sampling av observasjonene. Trær fikk lov til å vokse til sitt fulle størrelse uten beskjæring. Den beste splitten til hver node er valgt fra en tilfeldig subsett av miRNAs. Den venstre-out observasjoner (dvs. «ut av sekken» observasjoner) var da spådd å oppnå klassifiseringen feilrate av den anses treet. Prediktiv evne sorter ble vurdert å samle de eneste tre feilrater. Videre tilfeldig skogen rammeverket tillater oss å anslå betydningen av en variabel ved å se på hvor mye klassifiserings feilen øker når «ut av sekken» data for denne variabelen er permuted mens alle andre er uendret. Betydningen metrisk brukt var gjennomsnittlig reduksjon i Nøyaktighet (MDA). MDA er konstruert ved permutasjon verdiene for hver variabel av testsettet, innspilling prediksjon og sammenligne den med un-permuted testsett prediksjon av variabelen. Derfor er det økningen i andelen ganger i testsettet er feilklassifisert når variabelen er permuted. Vi fulgte Strobl et al. [11] for å unngå mulig skjevhet i variabelen valg: individuelle klasse trær ble bygget ved hjelp delsampling uten erstatning og vedta en betinget permutasjon ordningen [12]. Vi fikk en mirnas rangering i henhold til den variable betydning tiltaket. Til slutt ble de to miRNA rangeringer, en fra den klassiske analyse og en fra RF analyse, slått sammen for å få en liste over forskjellig uttrykt miRNAs. Sammenhenger mellom miRNA uttrykket ble estimert ved hjelp av Spearman koeffisient. En p-verdi 0,05 ble ansett for statistisk signifikans. Alle analyser ble utført ved hjelp av SAS versjonen 9.1 (SAS Institute, Cary, NC, USA) og R for tilfeldig skogen analyser (
randomForest
pakken).
kvantitativ real-time PCR (qPCR) assay ble brukt på eksterne validerings kohorter å bekrefte mikroRNA array-resultater, som ble vurdert ved hjelp av komparativ Threshold syklus (CT) metoden og standardterskelinnstillinger. Relative uttrykk for miRNA ble beregnet ved 2
-ΔΔCt formel [13] med U6 liten kjernefysiske RNA (RNU6B) som normalisering kontroll. Siden to
-ΔΔCt transformerte verdier ikke var normalfordelt, sammenligninger ble gjort ved hjelp av ikke-parametrisk Wilcoxon signert rank test for å vurdere den statistiske betydningen av opp- eller nedregulering. For qPCR valideringsanalyser, vurderte vi en prøvestørrelse på 14 forsøkspersoner for å tilveiebringe en 90% effekt (med en to-sidig alfa = 0,05) for å detektere en opp-regulering av minst to eller en nedregulering av høyst 0,5 av hver miRNA uttrykk i form av 2
-ΔΔCt bruke ikke-parametrisk Wilcoxon signert rank test og en som nullhypotesen.
Nettverk analyse
for hver av de to trenings kohorter en urettet og vektet nettverk ble bygget, der noder og kanter representerer henholdsvis (når signifikant), mirnas og deres sammenhenger. Dermed blir kantene ikke orientert ettersom korrelasjon er symmetrisk, og veid med Spearman koeffisient. Tykkelsen av kantene speil størrelsen av vektene. For å grave kritiske noder ut av begge CRC og PC-nettverk, lånte vi noen metoder fra samfunnsvitenskapene, og vurdert følgende
sentralitetsnivåer
tiltak:
grad
,
betweenness
og
clustering koeffisient product: [14], [15] for hvert nettverk. Endelig mirnas har blitt rangert tilsvarende.
Alle disse tiltakene (eller beregninger) er basert på telling av linker eller korteste baner. I detaljer, la oss definere en sti fra til, med et sett av noder, som en vekslende sekvens av noder og kanter, begynner med og slutter med, slik at hver kant forbinder sin foregående med sin lykkes toppunktet. Vi angi lengden av en bane som til å være summen av de inverse vekt av sine kanter. Tanken er at høyt korrelert mirnas minimere avstanden mellom nodene, eller fra et annet perspektiv, de nærmere to noder er jo mer de er korrelert. Derfor vi beregne avstanden mellom to noder og, skrevet, som minimumslengden på hvilken som helst bane tilkobling og inn. Per definisjon for hver.
Degree
sentralitet er basert på ideen om at viktige noder er de med flest bånd til andre noder i grafen. Det er ofte tolkes i forhold til den umiddelbare involvering av noder i forhold som er etablert gjennom nettverket. La være vekten av kanten, som forbinder knutepunktet med noden, graden sentralitet av en node er, med et sett av kanter, i henhold til hvilke jo høyere er graden verdien er, desto viktigere (globalt korrelert) er noden .
Betweenness
sentralitet måler innflytelse en node har over indirekte sammenheng mellom ikke nabonoder. Betweenness, i sin grunnleggende versjonen, er beregnet som andel av korteste stier mellom node parene som passerer gjennom noden av interesse. Dens matematisk uttrykk er, der er antall korteste stier fra til, og er antall korteste stier fra til som passerer gjennom et toppunkt. Ekser som oppstår på mange korteste stier mellom andre hjørnene har høyere betweenness, og deretter høyere relevans i indirekte sammenhenger.
Clustering koeffisient
er et mål på i hvilken grad noder i en graf har en tendens til å klynge sammen, eller i andre vilkår, kvantifiserer det noder på grunn av i hvilken grad deres naboer er å være en
klikken plakater (komplett graf) med det. Clustering koeffisienten til en node er da gitt ved andelen av koblinger mellom nodene innenfor sitt nabolag delt på antall linker som kan muligens eksisterer mellom dem. Konsist, er det uttrykt som hvor definerer umiddelbart koblet naboer satt av og. Dens «veid» formulering bygger på vektene av
trekanter
sentrert på noder i et nettverk. Den er definert av Horvath og Zhang [16] som der er vekten over kanten, og således produktet av vektene til de kanter som danner en lukket trekant av noder. Med start fra den lokale definisjonen av clustering koeffisienten, avdekker dets gjennomsnitt formulering av Schank og Wagner [17] for hele nettverket som forholdet mellom summen av produktene av de clustering koeffisienter og en generell vekt funksjon, og vekten funksjonen selv , nemlig der er den generelle funksjon vekt. Vekten funksjonen er vanligvis valgt blant de beregninger som bedre fanger topologien til nettverk under eksamen. En lavere
Gjennomsnittlig vektet Clustering Coefficient
mål indikerer en viktigere knutepunkt i forhold til nettverket robusthet.
Nettverk har blitt trukket og analysert av en tilpasset selvstendig verktøy skrevet i C # og bygget over biblioteket NodeXL 1.0.1.174 [18].
Resultater
Altered miRNA uttrykk hos pasienter med CRC og PC
Vi har sammenlignet miRNA profiler av 36 par solide tumorer og tilstøtende nontumorous vev i opplærings gruppene (19 CRC og 17 PC) ved hjelp av mikroRNA mikromatriser. Menneske mirnas (
har-speil
) og vev ble gruppert etter en hierarkisk clustering analyse (figur 1). Hver plottet sonde ble fargekodet for å likestille nivået av uttrykk for miRNA i forhold til sin median uttrykk nivå over hele vevsprøver satt (blå, lav, rød, høy). (Figur 1)
miRNA profiler av 36 paret vevsprøver fra 19 kolorektal kreft (oransje boks) og 17 bukspyttkjertelkreft (grønn boks) pasienter ble gruppert. De 36 parvise prøver er i rader (fargede søyler) og 866 mirnas er i kolonner. T, svulstvev; . N, tilstøtende normalt vev
forskjellig uttrykt miRNA i CRC og PC
For å identifisere mirnas forskjellig uttrykt i sammenkoblede normale og tumorvev ble to tilnærminger fulgt: en klassisk parvise t-test kontrollerende for falsk funnrate (FDR) og en RF analyse. Ved den første analyse ble 42 mirnas forskjellig uttrykt i CRC (tabell 1). Tjuefem av dem ble overuttrykt, med
HSA-miR1246
viser den høyeste fold-endringsverdien (12,0 ganger). I PC, ble 128 mirnas forskjellig uttrykt (se tabell S2). Spesielt av 34 mirnas med p 0,01, 30 viste høyere uttrykk nivåer i svulstvev, med
HSA-MIR-23a
viser den høyeste fold-endringsverdien (9,3 ganger), mens 4 flere mirnas ble nedregulert (tabell 2).
for å fastslå eventuell eksistens av orthologues i andre arter, og å bruke dem som intern metodekontroll, de menneskelige mirnas fant endret i to solide svulster ble sjekket inn 71 andre organismer i rekken: alle de regulert~~POS=HEADCOMP orthologues på menneske mirnas (fra nå av
har-speil
vil bli referert til som
speil
) viste en betydelig differensial uttrykk med lignende fold-endring i disse organismene (Tabell S3).
for å kontrollere riktigheten av RF, klassifiserings forestillinger i diskriminerende svulst fra normalt vev ble rapportert i flerdimensjonale skalering av de estimerte nærhetsmatrise tomter (figur 2) viser likheter og ulikheter i data. For hver tumor type, rekkene av de viktigste mirnas, ifølge MDA, ble avledet (figur 3, paneler A og B).
Nærhets matriser fra tilfeldig skogen analyse, der
x-
og
y-
aksene er flerdimensjonale skalering koordinater. Motiver med liknende miRNA uttrykk er representert ved punkter nær den ene til den andre, mens personer med ulike miRNA uttrykk er representert ved adskilte punkter. Rød = svulstvev, Black = tilstøtende normalt vev.
Mean Nedgang i Nøyaktighet (MDA) som et mål for miRNA betydning i å klassifisere tumorvev fra normale estimert ved tilfeldig skogen analyse. De første 42 viktigste mirnas i kolorektal kreft (panel A) og 50 mirnas i bukspyttkjertelkreft (panel B) er vist.
Sammenligning av miRNA signatur deteksjonsmetoder
Når resultatene med t-test og RF ble slått sammen, var en betydelig overlapping mellom mirnas oppdaget i enten CRC og PC vev funnet. Ved skjærer de mirnas med p 0,001 ved t-test-analyse (tabell 1) med de med høyest MDA ved RF-analyse (figur 3A), ble ekspresjonen av 24 mirnas signifikant endret i CRC (figur 4). Ved en lignende analytisk tilnærming (tabell S2, og figur 3B), ble 23 mirnas vesentlig endret i PC (figur 4).
For både vev en betydelig overlapping mellom oppdagede mirnas ble funnet av sammenslåing t-test og RF resultater. En gruppe på 24 miRNAs, hvis uttrykket ble betydelig endret i kolorektal tumorer, ble oppnådd kryssende listen over første 42 mirnas med beste p-verdier, fra t-test analyse, med de med høyest MDA, fra RF analyse. På samme måte ble 23 mirnas med endret uttrykk valgt i bukspyttkjertelen svulster. * P 0,001; § RF 4,3; ** P 0,05; # RF . 0,94
Som vist i figur 4, miRNA uttrykket var tungt vev bestemt; ja, de fleste mirnas med endret uttrykk i CRC ble ikke differentiallly uttrykt i bukspyttkjertelen tumorvevet. Den endrede uttrykk for bare to miRNA ble delt av CRC og PC:
MIR-145
dukket 2,2 ganger nedregulert (p 0,001) i CRC, og 5,7 ganger oppregulert (p 0,01) i PC, mens
MIR-1280
var 2,1 ganger oppregulert (p 0,001) og 2,3-ganger nedregulert (p 0,05) i det tidlige og senere kreftformer, henholdsvis (se tabell 1, Tabell 2 og Tabell S2).
miRNA korrelasjoner og kreft-Mir nettverk
det neste vi prøvde å bekrefte det innbyrdes forholdet av tidligere valgte mirnas uttrykt i enten CRC og PC vev ved hjelp av Spearman korrelasjonskoeffisient metode
for CRC, forskjellige
grader
av korrelasjon ble funnet for 24 mirnas stiller endret uttrykk.
MIR-106a
var ikke korrelert i det hele tatt, mens
MIR-195
utstilt flest bånd og ble tatt som en rotnoden med 9 kanter (
grad
15.86); ble påvist 8 lenkene for
MIR-28-3p product: (
grad
15.66), og 7 linkene for
MIR-1280
(
grad
13.79)
MIR-1246 plakater (
grad
13,05), og
MIR-140-3p product: (
grad
12.12) (Figur 5, panel A) . De sistnevnte 3 nodene ble også koblet sammen med
MIR-28-3p
, som viste en høy betweenness verdi. For dette siste tiltaket, ble den høyeste verdien observert for
MIR-1246
knutepunktet hvor mange korteste stier mellom andre hjørnene oppstå (tabell S4). En annen viktig node ble representert av
MIR-18a
med 6 relasjoner, tre av dem etablert med flere mirnas tilhører
miRNA 17-92a
klynge. Når vi målte graden av nodal clustering (c
lustering koeffisient
),
MIR-378, MIR-10b Hotell og
MIR-31
syntes å være en
cliqu
e med vertice i
MIR-28-3p
. Hvis du vil kontrollere robustheten til nettverket, beregnet vi
Gjennomsnittlig vektet clustering koeffisient
, og evaluert bidrag av en miRNA til den generelle kompakthet av nettverket. Lavest score ble observert for
MIR-1280, MIR-195 Hotell og
MIR-140-3p
som var de punktene av komplett graf (figur 5, panel A og tabell S4).
Grønne punkter skildre nodene som tilsvarer 24 mirnas av CRC nettverk og 23 mirnas av PC-nettverk. Kantene karakterisere signifikante sammenhenger, og at tykkelsen reflekterer Spearman korrelasjonskoeffisienter (blå og grønne kanter brukes til positive og negative korrelasjoner på henholdsvis). I CRC nettverk, som vist i panel A, m
iR-195, MIR-28-3p, MIR-1280, MIR-18a Hotell og
MIR-1246
utviser høyest
vektet
grad rang. Ingen korrelasjon er funnet for
MIR-106a
.
MiR-1246
har også den høyeste
betweenness
rang. I PC-nettverk, som vist i panel B,
MIR-103, MIR-23a Hotell og
Mir-15b
har høyest
grader Hotell og er alle knyttet til
MIR-199A-3p
samt til hverandre danner en fire noder
klikken
. I tillegg til fjerning av disse nodene bevirker den dypeste dråpe av den gjennomsnittlige clustering koeffisienten rang.
MiR-384
viser den høyeste betweenness sentralitet tiltaket.
Twenty av 23 mirnas med en betydelig deregulering i PC vev ble knyttet til andre punktene av nettverket av en rekke kanter varierende fra en til fem (
grad
: 8,88 til 1,92); for bare 3 mirnas (dvs.
MIR-30d *, MIR-1280 Hotell og
MIR-493 *
) ingen signifikant korrelasjon ble observert (
grad product:: 0), ( Figur 5, panel B). Spesielt ble det maksimale antall bånd funnet for
MIR-103 plakater (
grad
: 8,88),
MIR-23a product: (
grad
: 8,84) og
Mir-15b product: (
grad
: 8,38). Disse 3 hovednodene var alle knyttet til
MIR-199A-3p plakater (grad: 6,03) og disse fire miRNA dukket inter-krysset for å utgjøre en fire-node klikken. ble den høyeste betweenness sentrale mål for
MIR-384 plakater (
betweenness
: 0,31), funnet å være kritisk plassert i mellom (og dermed ansvarlig for mange) mellomdistanse sammenhenger. Vi bekreftet essentiality av de fire-node
klikken
ved å måle den generelle robustheten til nettverket (i form av stier redundans) etter å fjerne den. Vi beregnet på
Gjennomsnittlig vektet clustering koeffisient
for hele nettverket ved å fjerne i sin tur en node. Spesielt etter unntatt nodene i
klikken product: (
MIR-103, MIR-15b, MIR-199A-3p
og
MIR-23a
) de laveste gradene , nemlig 5,78, 5,85, 6,05 og 6,14 ble oppnådd, henholdsvis. Dette funnet peikt til disse nodene som funksjonelt relevant og som betydelig bestanddel av logikken i nettverket (Figur 5, panel B i tabell S4).
Validering qPCR
Blant betydelig deregulerte mirnas i microarray studien, 18 ble valgt ut for videre validering av kvantitativ real-time PCR (qPCR). Utvalg av disse mirnas var basert på to kriterier: resultatet av den tidligere beskrevne kryss analyse, og /eller deres engasjement i tykktarmen eller bukspyttkjertel tumorigenesis (i henhold til litteratur data). Kvantitativ PCR ble anvendt for å analysere endret ekspresjon av de valgte mirnas, så vel som for RNAU6 kontroll, i tumor og normalt vev tatt fra en ny valideringskullene av 14 pasienter med CRC og 21 PC-pasienter.
Sammenlignet med normalt vev med et uttrykk profil normalisert til 1, i tumorprøver av 14 CRC pasienter vi observert en signifikant oppregulering for 3 mirnas (
MIR-31, MIR-21 Hotell og
speil 708
), og under uttrykk i 7 andre (
MIR-145, MIR-139-5p, MIR-486-5p, MIR-378, MIR-140-3p, MIR-143 Hotell og
MIR-30c
) (tabell 3). De resterende 8 mirnas (
MIR-151-5p, MIR-155 *, MIR-17, MIR-199A-5p, MIR-23a, MIR-30a-5p, MIR-455-3p, og MIR-alfa 7i
) viste ikke signifikant endret uttrykk.
i kohort av 21 PC-pasienter, 13 av 18 miRNAs ble analysert ved qPCR i tumorvevet i forhold til normale prøver. Down-uttrykk ble kun observert for
MIR-21
, mens overuttrykk ble observert i 12 miRNA (
MIR-143, MIR-145, MIR-151-5p, MIR-155 *, MIR -199a-5p, MIR-23a, MIR-30a, Mir, 30c, MIR-21, MIR-455-3p, MIR-708 Hotell og
MIR-la-7i
) og bare to var ikke deregulert i en statistisk signifikant måte (
MIR-30a og MIR-30c
) (tabell 3).
Diskusjoner
mirnas som er forskjellig uttrykt i ulike kreftformer kan delta i felles endrede regulatoriske trasé [19]. Således kan kunnskap om deres samvirkende nettverk tilveiebringe et perspektiv av endrede mirnas og deres mønster av deregulering (dvs. opp- eller nedregulering). I denne studien profilert vi mirnas i to forskjellige solide kreft vev, CRC og PC, for å teste om noen plausible «signaturer» var synlig. For dette formål vi først så for mirnas differensielt uttrykt i tumorer og normalt vev av de to forskjellige linjer, og deretter identifisert «vevsspesifikke» mirnas ved hjelp av en ny statistisk metode, dvs. RF klassifikator. For hver kreftvev var vi i stand til å generere en liste over de mest konkrete og betydelig deregulerte miRNAs. Interessant, i de to listene bare to mirnas dukket men med motsatt mønster av uttrykk:
MIR-145
og
MIR-1280
. Men mens ulike mønstre av uttrykk for
MIR-145
er anerkjent [20], ingenting er kjent om
MIR-1280 Hotell og sin oppførsel i solid svulst.
En omfattende analyse av interaktive nettverk av disse mirnas viste at deres deregulerings mønstre er vevet spesifikk, som ulike forbindelser (dvs. forskjellige korrelasjonsmønster) ble observert mellom dem i de to linjene. Videre fant vi ut de mest kritiske mirnas og bekreftet at de var annerledes i barnekonvensjonen og i PC-nettverk.
For å forstå de regulatoriske mekanismer av mirnas knyttet betydelige forbindelser i begge nettverkene, gjennomførte vi en tre-trinns
in-silico
analyse. Først, rangert vi noder ved hjelp av kjente sentralitetsnivåer indekser: vektet
grad Hotell og
betweenness
. Mens det tidligere indeksen gitt innsikt i den direkte effekten som utøves av hver node til sitt nabolag (i vårt tilfelle, deres korrelasjon), sistnevnte identifisert noder essensielle for indirekte sammenhenger, nemlig noder som ligger i baner av sammenheng og som liksom bidrar til lang korrelasjoner. Derfor rangeres vi noder med
clustering koeffisient
indeks, for å måle deres grad av samhørighet med de nærmeste naboer. Målet var å kvantifisere robusthet av nettverkene, ved å se etter nodene som ellers ville forstyrre nettverk arkitektur når det ikke tatt hensyn til. For dette formålet, beregnet vi klyngen koeffisienten for hele nettverk av syklisk fjerne en node med tilsvarende kanter, og ved å bruke
vektet grad
som vekt funksjon. Vanligvis nettverk mangler noder avgjørende for den generelle robust utstilt lavere score.
Som siste trinn, vi validert vår
i-silikoaluminofosfater
beregninger av manuelt inspisere målgener og deres signalveier. Med disse metodene, observerte vi at flertallet av mirnas med tilsvar deregulering mønstre ble assosiert med vanlige målgener og /eller regulatoriske reaksjonsveier (se tabell S5). Spesielt i CRC tre hovednoder ble funnet:
MIR-195, MIR-18a
, og
MIR-1246
. Den første noden hadde en høy forhold til mirnas involvert i MAPK signalveien, som vist
in-silico
analyse ved hjelp DIANA-mirPath (https://diana.cslab.ece.ntua.gr/pathways/index_multiple Php), med unntak av
MIR-31 og MIR-28-3p
, som tilhører EGF veien. Den andre noden,
MIR-18a
, inkludert flere mirnas (
MIR-17, MIR-19b, MIR-92a
) tilhører samme gruppe:
miRNA 17- 92a
.
