Abstract
Bakgrunn
Den molekylære grunnlaget og kjennetegn ved familiær ikke-medullær skjoldbruskkjertelkreft er dårlig forstått. I denne studien utførte vi mikroRNA (miRNA) profilering av familiære og sporadiske papillær skjoldbruskkjertelkreft tumorprøver.
metodikk /hovedfunnene
Genome bredt miRNA profilering av sporadisk og familiær papillær skjoldbruskkjertelkreft ble utført . Forskjellig uttrykt mirnas ble validert ved kvantitativ RT-PCR. Ektopisk uttrykk for MIR-886-3p i skjoldbrusk kreft linjer ble utført for å identifisere trasé målrettet av miRNA, samt å bestemme dens effekt på tumorcellebiologi. Vi fant fire forskjellig uttrykt mirnas mellom familiære og sporadiske papillær skjoldbrusk kreft tumorprøver. MiR-886-3p og MIR-20a ble validert for å bli forskjellig uttrykt av 3- og 4-fold, henholdsvis. Pathway analyse av genom uttrykk data på celler som overuttrykker MIR-886-3p og målet prediksjon analyse viste gener involvert i DNA replikasjon og fokale vedheft trasé ble regulert av MIR-886-3p. Overekspresjon av MIR-886-3p i skjoldbruskkjertelen kreftcellelinjer betydelig hemmet celleproliferasjon, antall og størrelse på kuler og cellulær migrasjon. I tillegg overekspresjon av MIR-886-3p økt antall celler i S-fasen.
Konklusjon /Betydning
Våre funn for første gang foreslå at Mir-886-3p spiller en viktig rolle i skjoldbruskkjertelkreft tumorcellebiologi og regulerer gener involvert i DNA replikasjon og fokal heft. Dermed kan MIR-886-3p spille en rolle i initiering og eller progresjon av papillær skjoldbruskkjertelkreft
Citation. Xiong Y, Zhang L, Holloway AK, Wu X, Su L, Kebebew E (2011) MiR-886-3p Regulerer celleproliferasjon og migrasjon, og feilregulert i Familiær Non-Medullary skjoldbruskkjertelen. PLoS ONE 6 (10): e24717. doi: 10,1371 /journal.pone.0024717
Redaktør: Marian Ludgate, Cardiff University, Storbritannia
mottatt: 10 juni 2011; Godkjent: 17 august 2011; Publisert: 05.10.2011
Dette er en åpen-tilgang artikkelen, fri for all opphavsrett, og kan bli fritt reproduseres, distribueres, overføres, endres, bygd på, eller brukes av alle for ethvert lovlig formål. Arbeidet er gjort tilgjengelig under Creative Commons CC0 public domain engasjement
Finansiering:. Denne studien ble finansiert av egenutført Research Program av National Cancer Institute, Senter for Cancer Research. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Thyroid kreft er en av de raskest voksende kreftdiagnoser i USA med mer enn 44.000 nye tilfeller anslått å skje i 2011 [1]. Familiær ikke-medullær skjoldbruskkjertelkreft (FNMTC) kan oppstå som en mindre del av familiære kreftsyndromer (Gardner, Cowden sykdom, Carney kompleks type 1, Werner syndrom, McCune-Albright syndrom) eller som dominerer funksjonen [2]. De fleste tilfeller av FNMTC er papillær skjoldbruskkjertelkreft, og har en autosomal dominant arvemønster med ufullstendig penetrans. FNMTC står for opp til 8% av alle skjoldbrusk kreft tilfeller [2], [3], [4], [5], [6]. I de familiære kreftsyndromer som er nevnt ovenfor, er at pasienten har distinkte extrathyroidal lesjoner og mottakelighet gener ansvarlig for disse syndromene kjent. Men flertallet ( 95%) av FNMTC tilfellene oppstår som isolerte familiære nonmedullary skjoldbrusk kreft tilfeller hvor mottakelighet genet (e) er ukjent
FNMTC er definert som når to eller flere førstegradsslektninger. påvirkes med ikke-medullær skjoldbruskkjertelkreft. Den genetiske grunnlaget for FNMTC er dårlig forstått. I linkage studier har identifisert flere grupper kromosomale loci forbundet med FNMTC: 1q21, 2q21, 6q22, 8p23.1-P22, og 19p13.2 [7], [8], [9], [10], [11], [12], [13]. Mutasjon analyse har vist at slekter med FNMTC ikke har bakterie linje mutasjoner i
BRAF
,
RAS
, og
RET /PTC
gener som ofte mutert somatisk i skjoldbrusk kreft av follikulær celle opprinnelse [2]. Videre analyse av somatiske mutasjoner (
BRAF
,
RAS
, og
RET /PTC
) i sporadiske og familiære papillær skjoldbruskkrefttumorprøver viste ingen forskjell i prisen, og typen av mutasjoner i disse histologier [2], [6], [14]. Således er det ikke kjent om den molekylære profilen til sporadisk versus familiær tyreoideacancer er forskjellig. Videre er det også kjent om det er en molekylær basis for den tidligere alder av angrep og mer aggressiv sykdom oppførsel observert i FNMTC sammenlignet med sporadisk sykdom [6], [15], [16].
microRNAs ( mirnas) er små (~21-nukleotid-lang) kodende RNA som regulerer genekspresjon og spiller en betydelig rolle i mange biologiske prosesser, herunder tumorigenesis [1] – [2]. En spesifikk miRNA kan fungere enten som et onkogen eller som en tumor suppressor ved å regulere ekspresjon av mål-onkogenet (e) og tumor suppressor-gen (e), respektivt. I de fleste tilfeller mirnas binder til 3′-utranslaterte regioner (3′-UTR) av mål-mRNA, som fører til mRNA degradering eller undertrykkelse av translasjon. I kreft i skjoldbruskkjertelen, har en felles enkeltnukleotidpolymorfi i pre-MIR-146a blitt rapportert å hemme modne miRNA ekspresjon og øke risikoen for utvikling av papillær tyreoideacancer [17]. Så vidt vi vet, har ingen studier utført sammenligne miRNA profiler av familiære og sporadiske kreft generelt og spesielt for skjoldbruskkjertelkreft.
I denne studien utførte vi miRNA profilering av familiære og sporadiske papillær skjoldbrusk kreft tumorprøver. Vi fant at MIR-886-3p ble nedregulert i papillær tyreoideacancer, sammenlignet med normal og uttrykt forskjellig i familiær papillær tyreoideacancer, sammenlignet med sporadisk papillær skjoldbruskkjertelkreft. Pathway analyse av genom uttrykk data på celler som overuttrykker MIR-886-3p og målet prediksjon analyse viste gener involvert i DNA-replikasjon og brennvidde heft veien ble regulert av MIR-886-3p. Faktisk overekspresjon av MIR-886-3p i skjoldbruskkjertelen kreftcellelinjer betydelig hemmet celleproliferasjon, antall og størrelse på kuler og migrasjon.
Materialer og Metoder
Thyroid vevsprøver
Thyroid vevsprøver ble hurtigfrosset i flytende nitrogen på tidspunktet for tyreoidektomi. The National Cancer Institute Review Board godkjent denne forskningen protokollen etter informert skriftlig samtykke ble innhentet fra alle deltakerne. Alle vevsprøver gjennomgikk ekstra histologisk vurdering av en endokrin patolog for å bekrefte diagnosen og identifisere prøver med mer enn 80% tumorceller. Vi brukte 28 konvensjonelle papillær skjoldbruskkjertelkreft tumorprøver (21 sporadisk, 7 familiære) og 10 prøver normale tyroideavev for miRNA rekke profilering. En familiehistorie spørreskjema ble brukt for å fastslå om svulster bør kategoriseres som sporadisk eller familiær. FNMTC ble definert når 2 eller flere første-graders slektninger ble berørt med skjoldbrusk kreft av follikulær celle opprinnelse. Tilfeller av skjoldbruskkjertelkreft ble bekreftet i berørte familiemedlemmer. Alle de FNMTC tumorprøver var fra forskjellige familier. I 5 av 7 tumorprøver av FNMTC var det tre første grad slektninger påvirket og i 2 av 7 var det to første grad slektninger berørt. Tumorprøver ble matchet for alder (+/- 2 år), kjønn og TNM stadium av kreft (på en 3:01 ratio av sporadisk til familiær tilfeller).
miRNA microarray
totalt 28 mikromatriser (Exiqon ™) ble kjørt sammenligne både familiære og sporadiske papillær skjoldbrusk kreft til en pool av normal skjoldbruskkjertelen vev. Loggen
2-forhold av Cy5 til Cy3 intensitetssignaler ble beregnet for hver miRNA på hver matrise (med ingen bakgrunn subtraksjon) og dataene ble normalisert med trykk spiss løss normalisering [18], [19]. Siden enkelte mirnas var representert ved fire sonder på tabellen, var median normalisert log
2 Forholdet mellom de replikere sonder (for de med mer enn ett uvarslede probe) brukes som verdien for miRNA. Den oppsummert log
2 forholdstall for hvert forsøk ble så brukt i moderert t-statistikk og p-verdi beregning ved hjelp av limma pakken i R /Bioconductor [20], [21] med justering for falsk funnrate bruker Benjamini-Hochberg metode [22]. Mirna microarray data, som er MIAME kompatibel, er deponert i GEO database (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo).
Cellelinjer og kulturforhold
human thyroid kreft-cellelinjer FTC-133 (follikulær skjoldbruskkjertelkreft) og TPC-1 (papillær tyreoideacancer) ble opprettholdt i Dulbeccos modifiserte Eagle-medium (DMEM) med 4500 mg /l D-glukose, L-glutamin, og 110 mg /L natriumpyruvat) supplert med 10% serum, thyroid-stimulerende hormon (TSH) (10 mU /ml), penicillin (10.000 U /ml), streptomycin (10 000 U /ml), Fungizone (250 mg /ml) og insulin ( 10 (ug /ml) i en standard fuktet inkubator ved 37 ° C i en 5% CO
2 og 95% O
2 atmosfære. Begge cellelinjene blir etablert og autentiserte tyroid cancer-cellelinjer [23], [ ,,,0],24], [25], [26]. Den TPC-en cellelinje ble gitt av Dr. Nabuo Satoh (Japan) og FTC-133 cellelinje ble gitt av Dr. Peter Goretzki (Tyskland). Serum frie medier (DMEM- F12 medium) supplert med 4 hormoner (insulin [10 pg /ml], somatostatin [10 ng /ml], transferrin [5 pg /ml], og hydrokortison [0,36 ng /ml]) ble anvendt for funksjonelle studier.
Mirna Transfeksjon
Eldre miRNA forløper (pre-MIR-886-3p, Applied Biosystems, Foster City, CA) ble transfektert inn i cellene ved hjelp Lipofectamine RNAiMAX (Invitrogen, Carlsbad, California) etter produsentens instruksjoner . En tilfeldig sekvens forhånds MIR (pre-MIR-negativ kontroll) (Applied Biosystems) ble brukt som negativ kontroll (MIR-NC).
RNA Isolation og kvantitativ real-time RT-PCR
Total RNA ble ekstrahert ved hjelp av TRIzol reagens (Invitrogen) i overensstemmelse med produsentens instruksjoner. TaqMan mirna Analyser (Applied Biosystems) ble benyttet for å måle miRNA ekspresjonsnivå. Totalt RNA ble reverstranskribert med et miRNA-spesifikk primer, etterfulgt av real-time PCR med TaqMan prober. U6 ble anvendt som endogene kontroll. Den relative mengde av mRNA ble bestemt ved bruk av TaqMan®-analysen (Applied Biosystems) på en ABI 7900 HT-system, under anvendelse av human GAPDH som en endogen kontroll. Den ΔΔ Ct metoden ble brukt for å beregne uttrykket nivåer.
spredningsanalyse
Celleproliferering ble fastsatt ved hjelp CyQUANT Cell Proliferation Assay (Invitrogen) i henhold til produsentens protokoll. Fluorescensintensiteten ble målt ved hjelp av en fluorescens mikroplateleser (Molecular Devices, Sunnyvale, CA).
Migrasjon analysen
Den vandrende evne av skjoldbrusk kreft celler ble vurdert av grunnen såret analysen i celler dyrket i monolaget. Omtrent 150 000-celler ble transfektert med forhånds MIR-886-3p (25 nM) eller MIR-NC (25 nM) og deretter sådd ut i 6-brønners plater og tillatt å feste seg og vokse i 44 timer. Deretter ble tre vertikale sår laget med et sterilt 10 mL pipettespissen, og en horisontal linje ble laget på tvers av de tre linjer for å tillate observasjon av celler på samme punkt. Cellene ble inspisert hver 6. time og målinger tatt opp til 22 timer fra den opprinnelige såret.
Genome-wide mRNA uttrykk mikromatriser
TPC-1 celler ble transfektert med pre-MIR-886- 3p og pre-MIR-NC. Syttito timer etter transfeksjon, ble cellene vasket tre ganger med PBS. Total RNA ble fremstilt fra tredoble cellekulturer ved hjelp av RNeasy (Qiagen, Valencia, CA) kit i henhold til produsentens anvisninger. RNA kvalitet ble sikret før merking, bruk av Agilent RNA 6000 Nano kit og Bioanalyzer 2100. Ett hundre og femti ng av total RNA ble brukt til å utføre cDNA revers transkripsjon, syntese, forsterkning, fragmentering og terminal merking med Genechip WT Sense Target Merking og kontroll Reagenser (Affymetrix, Santa Clara, CA). Omtrent 25 ng /mL av cDNA ble hybridisert til Affymetrix menneskelige genet 1,0 ST Array Genechip. Arrays ble vasket og farget med lufthåndtering protokollen FS450_0007 prosedyre på Affymetrix lufthåndtering Station 450. Sonde intensiteter ble skannet av Genechip Scanner 3000. Rådata ble normalisert og analysert ved hjelp av Partek Genomisk Suite (Partek Inc., St Louis, MO , USA). Variansanalyse ble benyttet for å bestemme disse probe-sett signifikant forskjellig mellom de to gruppene. Genet Listen ble filtrert med en fold-endring cutoff av 2. Dette resulterte i produksjon av genet liste med gener som har betydning differensial uttrykk ved P≤0.001 og to-fold eller flere forskjeller. Pathway analyse ble utført ved bruk av de ressursene DAVID bioinformatikk.
Cellesyklus flowcytometri analyse
Virkningene av MIR-886-3p overekspresjon på cellecyklusprogresjonen ble vurdert ved hjelp propidiumjodid- flowcytometri. Kort sagt ble TPC-1 og FTC-133-celler transfektert med forhånds MIR-886-3p eller pre-MIR-NC i 72 timer til 120 timer. Cellene ble vasket med PBS, høstet og fiksert i 70% etanol. Deretter ble cellene behandlet med (500 U /ml) DNase-fri RNase og farget med propidiumjodid. Celleprøver ble analysert på en FACSCalibur (BD Biosciences, San Jose, CA), og G
0G
1, S og G
2M fasefraksjonene ble bestemt med ModFitLT programvare (Topsham, ME).
apoptose flowcytometri analyse
virkningene av MIR-886-3p overekspresjon på celledød ble vurdert av Annexin V- FITC og propidiumjodid- flowcytometri ved hjelp ApoAlert Annexin V kit (Clontech, Mountain View, CA). TPC-1 og FTC-133-celler ble transfektert med forhånds MIR-886-3p eller pre-MIR-NC i 72 timer til 120 timer. Cellene ble høstet og farget med Annexin V-FITC og propidiumjodid i henhold til produsentens protokoll. Celleprøver ble analysert på en FACSCalibur, og apoptotiske fraksjoner ble bestemt.
luciferaserapportørplasmid analysen
1160 basepar 3′-UTR av
CDC6
ble klonet i tomt luciferase reporter vektor pEZX-MT01 (GeneCopoeia, Rockville, MD), genererer en villtype
CDC6
UTR luciferase reporter konstruksjon (pEZX-WT-UTR). Mutasjoner i det 3′-UTR av
CDC6
ble beregnet for de første fire nukleotider (CACC til GTGG) eller de siste tre nukleotider (CGC GCG til) av 7-mer frø region av den antatte bindingssetet av MIR-886-3p, genererer to mutanter betegnes som henholdsvis pEZX-Mut-UTR-01 og pEZX-Mut-UTR-02,. Alle konstruksjonene ble sekvens-verifisert ved DNA-sekvensering. For den doble luciferase assay ble TPC-1 celler belagt i tre eksemplarer i 12-brønners plater og co-transfektert med 0,25 mikrogram av reporter konstruere og 15 pmol av pre-MIR-886-3p eller pre-MIR-NC ved hjelp Lipofectamine 2000 (Invitrogen). Etter 24 timer ble cellene lysert og analysert for både ildflue og Renilla luciferase med Luc-Pair ™ MIR Luciferase Assay Kit (GeneCopoeia, Rockville, MD) på en SpectraMax M5E mikroplateleser (Molecular Device, Sunnyvale, CA) i henhold til produsentene «instruksjoner.
data Analysis
data presentert som gjennomsnitt ± standard feil av gjennomsnittet. For å bestemme statistisk signifikans ble Mann-Whitney U-test, t test og variansanalyse anvendt, etter behov. En p-verdi på mindre enn 0,05 ble ansett som statistisk signifikant. Alle forsøkene ble gjentas minst tre ganger.
Resultater
miRNA profilering av sporadisk og familiær papillær skjoldbruskkjertelkreft
Vi sammenlignet miRNA uttrykket profilen til familiær og sporadisk papillær skjoldbrusk kreft tumorprøver ved hjelp av hel-genom miRNA microarray analyse. Prøvene ble matchet basert på alder og kjønn av pasientene, og TNM tumorstadium. MiRNA uttrykk i tumorprøver ble sammenlignet med normal thyroid vevsprøver. Det var 232 mirnas i sporadisk og 135 mirnas i familiær papillær skjoldbruskkjertelkreft som ble dysregulerte forhold til skjoldbrusk vevsprøver normale (figur 1A) (p 0,05). Ett hundre ni av feilregulert mirnas var unik for sporadisk, 13 var unik for familiære, og fire mirnas var signifikant forskjellig uttrykt mellom sporadisk og familiær papillær skjoldbruskkjertelkreft (figur 1A og 1B). To av de fire mirnas ble bekreftet å være signifikant forskjellig uttrykt mellom familiær og sporadisk papillær thyroid kreft ved kvantitativ sanntids RT-PCR (figur 2). Både MIR-20a og MIR-886-3p ble også betydelig nedregulert i sporadisk papillær skjoldbruskkjertelkreft i forhold til normal skjoldbruskkjertelen vev (p = 0,032 og p = 0,0032, henholdsvis) (figur 1B).
A) Sammenligning av forskjellig uttrykt mirnas i sporadisk og familiær papillær skjoldbruskkjertelkreft i forhold til normal skjoldbruskkjertelen vev. Den sporadiske sirkel indikerer denne gruppens forhold til normal skjoldbruskkjertelen vev, viser familiær sirkelen denne gruppens forhold til normal skjoldbruskkjertelen vev, og familiær-sporadisk sirkel indikerer sammenligning mellom familiære og sporadiske svulster. B) Relativ prosent miRNA uttrykket forskjellen mellom familiære og sporadiske svulster normalisert til normale vevsprøver. * P-verdi. 0,05
MiR-20a var fire ganger og MIR-886-3p var tre ganger høyere i familiær papillær skjoldbruskkjertelkreft sammenlignet med sporadisk (p = 0,025 for MIR-20a , p = 0,028 for MIR-886-3p, p = 0,37 for MIR-195, p = 0,46 for MIR-29C). Verdier er gjennomsnitt uttrykk pluss og minus standard feil av gjennomsnittet. Y-aksen representerer forholdet miRNA og U6 RNA ved hjelp av to
-ΔΔCt metode, og den laveste verdien av prøven ble satt til 1,0.
Målgener og veier av MiR-886- 3p i skjoldbruskkjertelen kreftceller
på grunn av funksjonen til mir-886-3p i tumorcellebiologi er ukjent, var vi først interessert i å bestemme mål-gen (e) og reaksjonsveien (e) som kan reguleres ved mir -886-3p. Vi brukte to tilnærminger til å bestemme MIR-886-3p mål: miRNA mål prediksjon og genome-wide mRNA uttrykk analyse i cellene overekspresjon MIR-886-3p (figur 3). Vi fant 730 spådd målgener for Mir-866-3p benytter mål prediksjon databaser (Miranda, miRBase, Target skanner). Ved å utføre KEGG pathway analyse på mRNA feilregulert i MIR-886-3p mindre under uttrykt celler, fant vi gener involvert i DNA-replikasjon og fokale vedheft trasé ble feilekspriraert på MIR-886-3p overekspresjon i skjoldbrusk kreft cellelinjer. Integrering av disse bioinformatikk tilnærminger identifisert seks gener i felles mellom analysene. Disse genene er derfor spådd å være MIR-886-3p mål.
For ytterligere å møte denne hypotesen, vi valgte fire av disse genene for validering ved MIR-886-3p overekspresjon. Vi fant betydelig nedregulering av alle fire gener ved MIR-886-3p overekspresjon av kvantitativ RT-PCR (figur 4). Av disse genene, var vi spesielt interessert i
CDC6
siden dette genet koder for et potent regulator av DNA replikasjon og onkogenese [27]. Interessant, western blot analyse viste nedregulering av
CDC6
protein uttrykk innen 72 timer MIR-886-3p overekspresjon (figur 5). For ytterligere å vurdere om
CDC6
er et direkte mål på MIR-886-3p regulering, transfeksjon av 3’UTR
CDC6
vill type vektor i skjoldbruskkjertelen kreftceller med MIR-886-3p overekspresjon viste signifikant nedregulering av luciferase aktivitet som tyder på at
CDC6
var et direkte mål på MIR-886-3p (figur 6). Mutasjoner i spådd frø regionen for MIR-886-3p i 3’UTR av
CDC6
avskaffet denne effekten, videre foreslå at Mir-886-3p direkte regulerer
CDC6
uttrykk (Figur 6 ).
Transfeksjon av pre-MIR-886-3p betydelig redusert de mRNA nivåer av fire mål gener (
CDC6
,
PIP5K1C
,
PXN
) ZYX
) i A) TPC-en cellelinje og B FTC-133 cellelinje (* p 0,05, ** p 0,01). Y-aksen representerer forholdet mellom den spesifikke mål-genet og GAPDH ved hjelp av to
-ΔΔCt metode, og verdien av MIR-NC gruppe ble innstilt på 1,0 for å tillate sammenligning av brette forskjeller mellom forskjellige cellelinjer og gener.
A) representant western blot bilde av
CDC6
protein uttrykk ved 72 timer etter transfeksjon med pre-MIR-886-3p sammenlignet med negativ kontroll (MIR-NC). B) Band densitometry kvantifisering av
CDC6
protein uttrykk. Programvaren ImageJ (Maryland, USA) ble brukt for densitometrisk analyse av vestlige blotter.
A) pEZX-WT-UTR vektor med både Renilla luciferase (hRLuc) ble brukt som en intern kontroll og ildflue luciferase (hLuc) var oppstrøms for det 3′-UTR-konstruksjonen. B) Antatte bindingssete fra Mir-886-3p på
CDC6
3 «UTR sammen med mutasjoner i spådd frø regionen. C) Venstre viser luciferase aktiviteten pEZX-WT-UTR i TPC-1 celler ved samtidig transfektert med pre-MIR-886-3p eller pre-MIR-NC, p 0,05. Midtre og høyre tall showluciferase aktivitet pEZX-Mut-UTR-01 og pEZX-Mut-UTR-02 i TPC-1 celler ved samtidig transfektert med pre-MIR-886-3p eller pre-MIR-NC, henholdsvis. Alle luciferasepreparater målinger ble gjort i tre paralleller og målinger ble utført på 24 timer etter transfeksjon.
MiR-886-3p regulerer cellesyklus og spredning, og spheroid dannelse og migrasjon
Fordi vi fant MIR-886-3p regulerer gener involvert i DNA replikasjon og fokale vedheft trasé, var vi interessert i å bestemme hvilken rolle MIR-886-3p på cellesyklus og cellulær proliferasjon, samt, spheroid dannelse og migrasjon. Vi først bestemmes basal uttrykk for MIR-886-3p i fire godt karakterisert og autentisert skjoldbrusk kreft cellelinjer og fant at FTC-133 og TPC-1 hadde høyeste og laveste nivå på MIR-886-3p uttrykk, henholdsvis (figur 7A ). Vi brukte disse cellelinjer for å analysere effekten av MIR-886-3p på celleproliferasjon. Overekspresjon av MIR-886-3p betydelig hemmet celleproliferasjon med 79% i FTC-133 celler i 144 timer (p 0,001) og 77% i TPC-1 celler på 120 timer (p 0,001) sammenlignet med pre-speil NC (figur 7B).
A) Baseline uttrykk for MIR-886-3p i fire skjoldbrusk kreft linjer. B) Effekt av MIR-886-3p overekspresjon på skjoldbruskkjertelkreft celleproliferasjon. Pre-MIR-886-3p betydelig hemmet tyreoideakreft celleproliferasjon. Feilfelt representerer standard feil av gjennomsnittet. * P≤0.001.
Gitt den dype effekten av MIR-886-3p overekspresjon på celleproliferasjon, ønsket vi å neste utforske mekanismen av MIR-886-3p-mediert veksthemming. Vi har derfor utført flow cytometri og Annexin V-analyser for å bestemme virkningen av MIR-886-3p på cellesyklusprogresjon og apoptose, respektivt. Overekspresjon av MIR-886-3p betydelig økt antall av celler i S-fasen (12-16%), mens reduksjon av antallet celler i G
0 /G
1 (11-22%) (p 0,001 ). Vi fant imidlertid ingen signifikant økning i antall celler i apoptose med og uten MIR-886-3p overekspresjon. Disse dataene indikerer at Mir-886-3p regulerer cellesyklus og spredning i tråd med vår MIR-886-3p veien og målet prediksjon analyser.
Fordi MIR-886-3p veien og målet analyser viste gener som regulerer brennvidde heft var feilekspriraert, vi har også bestemt effekten av MIR-886-3p overekspresjon på skjoldbruskkjertelkreft cellelinje spheroid dannelse og cellemigrasjon. FTC-133 cellelinje danner kuler når dyrket i ultralav tilhenger kulturflasker innen 72 timer. I overensstemmelse med effekten av MIR-886-3p overekspresjon i monolayer-celler, ble det observert en reduksjon i antallet og størrelsen av kuler i FTC-133 thyroid kreft cellelinje som ble opprettholdt i opp til 2 uker i kultur (figur 8). I tillegg sank MIR-886-3p overekspresjon de flere cellulære grenlignende strukturer observert i de negative kontrollcellene. Vi bestemte neste effekten av MIR-886-3p overekspresjon på cellemigrasjon ved bruk av scratch såret analysen. Overekspresjon av MIR-886-3p betydelig hemmet migrering av TPC-en cellelinje (p 0,001) (figur 9)
Pre-MIR-886-3p redusert størrelse og antall kuler i FTC. -133 cellelinje. A) Representant bilde av kuler i kultur med MIR-886-3p overekspresjon. B) Kvantifisering av celleklump forskjell MIR-886-3p overekspresjon. Det totale areal som opptas av sfæroidene i løpet av et bilde ble målt ved å omgi omkretsen av hver sfæroide, som markerer hele området, og å beregne piksel tall ved hjelp ImageJ programvare (Maryland, USA). Eksperimentene ble gjentatt tre ganger, og lignende resultater ble observert. (*** Indikerer p 0,001).
Forhånds MIR-886-3p betydelig redusert celle migrasjon på 22 timer (p 0,001). A) Representant bilde av såret analysen ved tid 0 og 22 timer etter scratch. B) Kvantifisering av sår bredde lukking med MIR-886-3p overekspresjon. Seks forskjellige steder ble visualisert og fotografert under et fasekontrast invertert mikroskop (10 x forstørrelse) i hver plate ved forskjellige tidspunkter, og tre plater ble benyttet for hver gruppe. Såret bredde på 10 x bildene ble målt ved anvendelse av en standard målepunktet. Eksperimentene ble gjentatt tre ganger, og lignende resultater ble observert. (*** Indikerer p 0,001).
Diskusjoner
I denne studien utførte vi miRNA profilering av familiære og sporadiske papillær skjoldbrusk kreft tumorprøver. Vi fant fire mirnas er uttrykt forskjellig mellom disse gruppene, hvorav to, MIR-886-3p og MIR-20a, ble validert for å bli forskjellig uttrykt av 3- og 4-fold, henholdsvis. Begge disse mirnas ble nedregulert i papillær tyreoideacancer, sammenlignet med normal tyroideavev av 3,5-4-fold. Genome-wide genekspresjon sti og målet prediksjon analyser påvist gener involvert i DNA replikasjon og fokale vedheft trasé ble rettet av MIR-886-3p. Overekspresjon av MIR-886-3p i skjoldbruskkjertelen kreftcellelinjer betydelig hemmet celleproliferasjon, antall og størrelse av kuler, og cellulær migrasjon. Videre overekspresjon av MIR-886-3p økt antall celler i S-fasen og redusert antall celler i G
0G
1 fase med ingen effekt på apoptose.
Vi er ikke kjent av andre studier som har sammenlignet miRNA profilen til svulster i forbindelse med familiære kreftsyndromer med sine sporadisk forekommende kolleger. En slik analyse gir viktig innsikt i de genetiske trasé som kan være annerledes i histologisk lignende svulster, de viktige målene for predisponerende genetiske endringer, og i tilfelle av FNMTC, det molekylære grunnlaget. Selv om de fleste etterforskere har antydet at FNMTC er et tydelig arvelig syndrom, argumenter mot dette inkluderer at 1) det samme mottakelighet genet (e) og eller loci har ikke blitt observert over flere linkage studier, 2) ikke-ondartede skjoldbrusk svulster er vanlig, og dermed en skjoldbruskkjertelkreft diagnose kan være en grunnleggereffekten eller forresten oppdaget, og 3) ekspressivitet er variabel [2]. På den annen side, flere studier støtter FNMTC som en tydelig arvelig syndrom fordi, 1) flere slekter har blitt rapportert å ha sann forekomst av FNMTC, 2) det er en høyere rate av skjoldbruskkjertelkreft hos menn og barn innen FNMTC stamtavler, 3 ) det er en tidligere alder av presentasjonen, og 4) det er hann-til-hann overføring. Til slutt, epidemiologiske studier viser at risikoen for thyroid kreft i en første-grad i forhold til en pasient diagnostisert med kreft i skjoldbruskkjertelen er fem ganger høyere [28]. Gitt denne uenigheten, setter vi ut for å avgjøre om uttrykket profiler av familiær og sporadisk papillær skjoldbruskkjertelkreft var annerledes. Et stort antall mirnas ble dysregulerte i både familiær og sporadisk papillær thyroid kreft sammenlignet med normalt vev skjoldbruskkjertelen. Vi utførte miRNA profilering i tumorprøver fra pasienter som var matchet for alder, kjønn og TNM kreft stadium. En slik tilnærming ble brukt for å minimalisere forstyrrende faktorer som kan resultere i forskjellig miRNA ekspresjonsprofilen på grunn av forskjellig grad av sykdom, histologiske subtyper av tumor, og differensiering status av tumor [29], [30], [31], [32], [33], [34], [35]. Derfor tror vi vår nøye studie design og analyse gi funn som, for første gang, støtter en molekylær forskjell i familiære og sporadisk papillær skjoldbruskkjertelkreft.
Blant de forskjellig uttrykt mirnas mellom familiære og sporadisk papillær skjoldbruskkjertelkreft, to mirnas ble bekreftet til å være forskjellig uttrykt ved kvantitativ RT-PCR. Både MIR-20a (13q31.3) og Mir-886-3p (5q31.2) ligger ikke i kromosom loci tidligere identifisert som mottakelighet loci ved linkage studier i slekter med FNMTC. Gitt de små nucleotide lengder mirnas, er det ikke overraskende at genetiske endringer i kromosom loci koding MIR-20a og MIR-886-3p kan ha vært savnet i disse studiene, selv med bruk av høyoppløselig SNP arrays [13]. I fremtiden kan kjønnsceller sekvensanalyse brukes til å avgjøre om disse mirnas er kandidat mottakelighet gener for FNMTC. I tillegg vil det være viktig å finne i fremtidige studier mekanismen av den generelle MiR-886-3p downregulation i skjoldbruskkjertelkreft skyldes kopiere nummer variasjon, inaktivere mutasjoner eller sletting.
Vi var interessert i å studere rollen av MIR-886-3p i skjoldbruskkjertelen kreftutvikling av flere grunner. Hovedsakelig er ukjent funksjon av MIR-886-3p er MIR-886 genet kromosom beliggenhet på 5q31 delt med transvekstfaktor β1, en viktig regulator i epiteliale kreftutvikling, og nivået på MIR-886-3p uttrykk forskjell mellom familiære og sporadisk papillær skjoldbruskkjertelkreft var stort (3 ganger). I samsvar med våre funn, en fersk studie viste MIR-886-3p ble nedregulert i plateepitel lungekreft sammenlignet med normal lungevevet, noe som tyder på en mulig svulst suppressor rolle for denne miRNA [5]. Ved hjelp av to godt karakterisert skjoldbrusk kreft cellelinjer med ulike nivåer av basal MIR-866-3p uttrykk, viste vi at Mir-886-3p spiller en avgjørende rolle i celleproliferasjon og migrasjon, og regulerer gener som er involvert i DNA-replikasjon og brennvidde heft trasé. Vi valgte
CDC6
, en potent regulator av DNA replikasjon og onkogenese [27], for videre analyse og funnet ut at
CDC6
var et direkte mål på MIR-886-3p. Selv om våre funksjonelle studier ble gjort i skjoldbruskkjertelen kreft linjer, tyder våre data på at MIR-886-3p er en viktig regulator av tumorcellebiologi i skjoldbruskkjertelkreft [26].
Overuttrykte MIR-886-3p forårsaket dramatisk endringer i uttrykket av gener som regulerer DNA replikasjon og brennvidde heft. Fire gener (
CDC6
,
PIP5K1C
,
PXN
,
ZYX
) hadde 4 ganger knockdown med økt MIR-886-3p uttrykk .
