Abstract
Cytoplasmatiske nærvær av hsp60, som er i hovedsak en kjernefysisk gen-kodet mitokondrie chaperonin, har ofte vært nevnt, men dens rolle i intracellulær signalisering er stort sett ukjent. I denne studien viser vi at det cytosoliske hsp60 fremmer TNF-α-mediert aktivering av IKK /NF-kB overlevelse vei via direkte interaksjon med IKKα /β i cytoplasma. Selektiv tap eller blokade av cytosolisk hsp60 ved spesifikke antisens oligonukleotid eller nøytraliserende antistoff svekket IKK /NF-kB-aktivering og ekspresjon av NF-kB målgener, slik som Bfl-1 /A1 og MnSOD, som dermed utvidet intracellulær ROS produksjon og ASK1 -avhengig celledød, som respons på TNF-α. Omvendt, ektopisk uttrykk for cytosol målrettede hsp60 forbedret IKK /NF-kB aktivering. Mekanistisk, cytosoliske hsp60 forbedret ikk aktivering via oppregulering aktiverings-avhengig serin fosforylering i en anstand uavhengig. Videre transgen muse studie viste at cytosolic hsp60 trykkes lever celledød indusert av diethylnitrosamine
in vivo
. Cytosoliske hsp60 er sannsynlig å være en regulerende del av ikk komplekse og det impliserer den første mitokondrie faktoren som regulerer celle overlevelse via NF-kB veien
Citation. Chun JN, Choi B, Lee KW, Lee DJ, Kang DH, Lee JY, et al. (2010) cytosolic hsp60 er involvert i NF-kB-Dependent Survival av kreftceller via IKK forordning. PLoS ONE 5 (3): e9422. doi: 10,1371 /journal.pone.0009422
Redaktør: Rafael Linden, Universidade Federal do Rio de Janeiro (UFRJ), Brasil
mottatt: 02.12.2009; Godkjent: 18 januar 2010; Publisert: 23 mars 2010
Copyright: © 2010 Chun et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Denne studien ble støttet av 21C Frontier Funksjonell Proteomics Project (FPR08-B1-190) finansiert av Kunnskapsdepartementet, Science Teknologi og ved KOSEF gjennom Senter for Cell Signaling Drug Discovery forskning (CCS DDR, R15-2006-020) ved Ewha Womans University. Denne studien ble også støttet delvis av en bevilgning på National R D Program for Cancer Control, Ministry of Health Velferd (0.420.190). J. N. Chun, K. W. Lee, J. Y. Lee, B. A. Choi, og H. I. Kim ble støttet av Brain Korea 21 stipend fra Korea Ministry of Education, Science Teknologi. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Pattedyrceller celler~~POS=HEADCOMP uttrykker en rekke overlevelse gener som spiller rollene i begrenser caspaseaktivering, fjerne skadelige oksygenradikaler, forsvarer mitokondrienes funksjon, og sjekke cellesyklusen. Blant de transkripsjonsfaktorer som er ansvarlige for induksjon av overlevelsesgener, nukleær faktor-kB (NF-kB) er et viktig element som orkestrerer komplekset celle overlevelse svar [1]. Spesielt er NF-kB-avhengige overlevelses gener inkluderer anti-apoptotiske gener, for eksempel c-tilgangspunkter og c-FLIP, og mitokondrielle beskyttelsestiltak gener, så som mangan-superoksyd-dismutase (MnSOD) og Bcl-2 familiemedlemmer [2] , [3], [4]. En sentral kinase i NF-kB-aktivering veien er den hemmer av kB kinase (IKB-kinase eller IKK) som fosforylerer den IkB-proteinet i to aminoterminale serin-rester, som fører til dens ubiquitinylation og proteosomal nedbrytning og til den derav følgende frigjøring av NF-kB proteiner [5]. Den ekstracellulære stimuli for å aktivere NF-kB vei konvergere til IKK [6]. Derfor har mange forsøkt å avgrense regulering av ikk aktivering. For det første har den fosforyleringen-avhengig regulering av ikk aktivering vært preget [7]. Fosforylering av to serinrester (Ser 177 /Ser181 i human IKKβ) i aktiveringen T-sløyfe er essensielt for aktiveringen, mens den autofosforylering av karboksyl-terminale serin klynge slår av aktiveringen. Mange kinaser har vært implisert å være involvert i aktivering fosforyleringen: NF-kB-induserende kinase (NIK) [8], [9], mitogen-aktivert protein kinase /ERK kinase kinaser 1 (MEKK1) [10], MEKK2 /3 [11], [12], hematopoetisk stamcelle kinase-en (HPK1) [13], Mixed-avstamning kinase 3 (MLK3) [14], TGF-β aktivert kinase 1 (TAK1) [15]. Men bortsett TAK1, er det uklart hvordan oppstrøms kinase aktiverer IKK komplekset. For det andre har den ubiquitin-avhengige reguleringen av ikk aktivering blitt studert i mange år [15], [16]. Nylig har det regulatoriske subenhet IKKγ (eller NEMO) av ikk komplekse vist seg å være ubiquitinmolekyler, samt å anerkjenne Lys63 bundet polyubiquination kjeden på reseptor-interaksjon protein 1 (RIP1) [17], [18]. For det tredje har reguleringen av ikk aktivering via samspill proteiner vært preget. De beste eksemplene er varmesjokkproteiner. For eksempel har Cdc37 og HSP90 blitt rapportert å virke som ytterligere komponenter av den ikk-komplekset som stabiliserer komplekset [19], [20]. Hsp27 er vist å interagere med IKKβ i en TNF-α-avhengig måte [21]. Hsp70 samhandler også med IKKγ men forstyrrer ikk aktivering [22]. Dessuten har sammenhengen mellom protein fosfatase 2Cβ (PP2Cβ) og IKK komplekset er påvist [23], og elg har også blitt identifisert som en ny regulatorisk subenhet av ikk kompleks som medierer rekruttering av IKB til komplekset [24]. Det er imidlertid ingen indikasjon på en mitokondriell protein som er involvert i den IKK /NF-kB-aktivering.
Vi har nylig identifisert varmesjokkprotein 60 (hsp60) som et IKK-veksel protein. Hsp60 er den mitokondrielle chaperonin som fremmer folding av den importerte proteinet med nativ konformasjon. Likevel har eksistens og funksjon av hsp60 i extramitochondrial avdelinger ofte vært uttalt [25]. For eksempel, kan hsp60 være en ligand for celleoverflatereseptorer som toll-lignende reseptor [26]. Intracellulært, hsp60 er blitt vist å interagere med pro-kaspase-3 eller Bax [27], [28], [29]. Imidlertid har funksjonen av hsp60 relatert til celleoverlevelse signalering ikke blitt rapportert. I denne studien ble hsp60 funnet å mekle NF-kB avhengig overlevelse signalering i cellene. Nærmere bestemt hsp60 direkte interaksjon med IKKα /β i cytoplasma og deretter fremmet fosforyleringen-avhengig aktivering av kinasen i respons på TNF-α. Slike signalfunksjon hsp60 var uavhengig av sin anstand aktivitet, som setter hsp60 fra andre heat shock proteiner som fungerer via stabiliserende eller destabiliserende signaliserer kompleks [30]. Vi viste også
in vivo
bevis for at cytosolic uttrykk for hsp60 beskytter levercellene mot kjemiske-indusert skade via styrke ikk aktivering. Dermed representerer dette funnet romanen pro-overlevelse funksjon av cytosoliske hsp60 og kaste lys på å forstå funksjonen av hsp60 i ekstra mitokondrie avdelinger [25].
Resultater
hsp60 samhandler med IKK kompleks i cytoplasma
for å identifisere en ekstra komponent, vi undersøkte den molekylære sammensetningen av latent IKK-komplekset ved hjelp av en proteomikk teknikk som kombinerer immuno-affinitet rensing og massespektrometri. I korte trekk ble det ikk-komplekset utfelt fra lysatene av ustimulerte HeLa S3 celler ved anvendelse av anti-IKKα antistoffkuler, og de ko-utfelte proteiner ble sekvensert ved væskekromatografi-tandem massespektrometri. Identifiseringen av de ikk underenheter og HSP90 indikerte at immunorensing av ikk-komplekset ganske arbeidet (Fig. 1A). Som en konsekvens av dette proteomikk undersøkelsen identifisert et varmesjokkprotein, hsp60, i bunnfallene (Fig. 1A og 1B). Tilstedeværelsen av IKK underenheter og hsp60 i utfellingene ble bekreftet ved immunoblotting (Fig. 1C). Deretter bestemte vi oss for å undersøke den biologiske betydningen av IKK hsp60 interaksjon.
A. En sølv-farget polyakrylamidgel løse affinitetsrenset ikk kompleks. B. MS /MS-spektra for [M + 2H]
2+ ioner av peptider avledet fra proteinbånd svarende til hsp60. C. Immunoblot (IB) analyser av IKK underenheter og hsp60 i affinitetsrenset kompleks. D. Interaksjon av hsp60 med ikk kompleks. Ikk-kompleks ble immunopresipitert (IP) fra HeLa-cellelysatene (500 ug totalt protein for hver) med IKKα, IKKβ, og IKKγ-spesifikke antistoffer. De IKKα /β /y underenheter, hsp60, og HSP90 ble immunoblottet. WCL, hele cellelysat. E. TNF-α-uavhengig interaksjon av hsp60 og ikk kompleks. F. Co-immunoprecipitation av hsp60 og ikk kompleks i cytosoliske fraksjonen.
Øvre panel
, post-kjernefysiske supernatant (PNS), ble cytosol (Cyto), og mitokondrier (Mito) fraksjoner fra HeLa-celler immunoblottet. COX4 og tubulin ble brukt som mitokondrie og cytosoliske markører, henholdsvis.
Nedre panel
, hsp60 ble immunopresipitert fra cytosoliske fraksjonen ved hjelp av enten kontroll geit IgG eller anti-hsp60 antistoffer (K-19 og N-20). Representative blotter vises (
n
= 3).
Det første skrittet var å verifisere den endogene samspillet mellom hsp60 og IKKS av co-immunoutfellingsstudier eksperimenter. Når den heterogene IKK kompleksene ble utfelt med antistoffer mot IKKα, IKKβ, og IKKγ, hver av IKK underenhetsspesifikke antistoffer på samme måte utfelte hsp60 (Fig. 1D). I tillegg HSP90 var også ko-utfelt med ikk-komplekset [20], [21]. Denne interaksjonen ble funnet å være upåvirket av TNF-α behandling (fig. 1E), som indikerer at hsp60 er en komponent av heterogene protein IKK komplekser. En omvendt immunoutfelling ble deretter utført med den cytosoliske fraksjonen for å utelukke den mitokondrielle forurensning. De anti-hsp60-antistoffer ko-utfelt IKKγ med hsp60, mens kontroll geit IgG ikke (fig. 1F), noe som bekrefter at cytosoliske interaksjon av hsp60 og IKK. For å visualisere den virtuelle interaksjonen av hsp60 med IKKS i cytoplasma, ble en immunfarging kombinert med elektronmikroskopi (EM) utføres. Immunkomplekser av hsp60 og IKK med deres spesifikke antistoffer ble detektert på en annen måte ved hjelp av sekundære antistoffer merket med 20 nm- og 40 nm diameter gullpartikler, respektivt. Som et resultat ble de hsp60-merking gullpartikler fordelt gjennom de cellulære strukturer: ikke bare i matrisen og intermembrane plass av mitokondrier, men også i cytoplasma og plasmamembran (figur 2B.). I motsetning til dette ble IKKα- og IKKβ-merking av gullpartiklene i hovedsak funnet i cytoplasma (fig. 2C og 2D), mens den IKKα ble også påvist i kjernen, noe som er i samsvar med tidligere rapporter [31], [32] . Selv om kjerne IKK-subenheter er blitt vist å bli funnet i mitokondrie fraksjonen [33], våre data viste at den ikk-merking gullpartikler ble ofte sett i vesikulær strukturene i stedet for mitokondrier (Fig. 2C og 2D). Dette avviket kan skyldes den tidligere studie gjort med subcellulære fraksjonering. Når hsp60 og IKKS var co-farget, direkte binding på 20 nm og 40 nm gullpartikler var tydelig oppdaget i cytoplasma (fig. 2E og 2F). Det bør bemerkes at ikke alle av de IKKα og IKKβ var assosiert med hsp60. Disse resultatene kollektivt indikerer at hsp60 vekselvirker direkte med ikk-komplekset i cytosol.
HeLa-celler ble immunologisk med ingen primær (A), anti-hsp60 (B), anti-IKKα (C), anti-IKKβ (D), anti-hsp60 /IKKα (E), og anti-hsp60 /IKKβ (F) antistoffer, og deretter merket med de tilsvarende sekundære antistoffer konjugert med 20 nm eller 40 nm gull-partikler, som beskrevet i eksperimentell prosedyre. Merkingen ble bestemt ved immuno-gull-elektronmikroskopi. Kjerner (Nu) og mitokondrier (M) er indikert.
Piler
indikerer direkte tilslutning av Hsp60- og IKK-merket gull partikler. Ingen immunreaktive signal ble observert i prøven uten primære antistoffer (A). Forsøkene ble gjentatt to ganger med samme resultat, og representative resultatene er vist.
hsp60 direkte kontakt med IKKα /β, ikke IKKγ
Deretter analyserte vi den molekylære samspill av hsp60 og Ikks. For å gjøre dette, ble en cytosol-målrettet versjon av hsp60 (Hsp60c), hvor mitokondrie målretting signalsekvens blir slettet, konstruert. Når Hsp60c ble co-uttrykt med hver av IKK kjerneunderenheter, Hsp60c interaksjon med IKKα og, om enn i mindre grad, med IKKβ, men ikke med IKKγ (fig. 3A). Deretter en
in vitro
bindende eksperiment ved hjelp av rekombinante proteiner av glutation-S-transferase (GST) -fused hsp60 og (Hans)
6-merket IKK kjerne ble vurdert av en GST rullegardin subenheter analyse. Resultatet, igjen, indikerer at hsp60 bindes direkte til IKKα og IKKβ, men ikke for å IKKγ (Fig. 3B).
A. Direkte binding av hsp60 og IKK subenheter. De 293T celler ble ko-transfektert med Hsp60c (HA tag) og hver av IKK subenhet proteiner (Flag tag) i 24 timer. B.
In vitro
sammenslutning av hsp60 med IKKα og IKKβ. GST-fusert hsp60 proteiner bundet til glutation Sepharose-kuler ble inkubert med lysater av Sf9 insektceller som uttrykker Hans
6-merkede IKK proteiner. Hsp60 og Ikks ble oppdaget av immunblot for GST og HA-koder, henholdsvis. C. Prinsippskisse som viser delesjonsmutanter av hsp60. De antatte fosforyleringsseter av kinaser, inkludert PKA /PKG (1) og PKC (2), er angitt. D og E. Interaksjon av hsp60 villtype (WT) og delesjonsmutanter med ectopically-uttrykt IKKα i 293T-celler (D) eller endogent ikk kompleks i HeLa-celler (E). Kontrollen vektor (C) er angitt. Representative blotter og bilder vises (
n
= 3). N.S., uspesifikke.
Den molekylære samspill av hsp60 med IKK ble ytterligere preget av domene kartlegging eksperimenter. På grunn av at C-terminal delesjon hemmet ektopisk ekspresjon, en serie av N-terminale delesjonsmutanter av Hsp60c ble testet for ikk binding via ko-ekspresjon med Flag-merket IKKα i HEK293-celler (fig. 3C). Resultatene viste at den N-terminale del (~160 aminosyrer fra N-terminus) av hsp60-protein ble vist å være unnværlig for interaksjon (fig. 3D). Det samme resultat ble oppnådd når endogene ikk komplekset ble immunopresipitert fra HeLa-celler transfektert med de Hsp60c konstruksjonene (fig. 3E). Resultatene nokså indikerer at kjernen bindende domene er lokalisert i midten av hsp60 protein.
hsp60 er involvert i IKK /NF-kB-aktivering
Deretter den biologiske effekten av cytosolisk Hsp60- IKK interaksjon ble undersøkt i TNF-α-mediert NF-kB pathway. For å oppnå målet, er det viktig skritt for å manipulere nivået av cytosolisk hsp60 uten å påvirke den mitokondrielle en fordi hsp60 mangel er kjent for å forårsake en mitokondriell funksjonell mangel [34], [35], [36]. Interessant nok har en rekke studier som tidligere rapportert at et antisense-oligodeoksynukleotid (AS-ODN) komplementære til en sekvens rundt startkodonet av det humane hsp60 åpne leseramme faktisk reduserer cytosoliske hsp60-nivå [27], [37], [38] . Vi har derfor besluttet å teste dette AS-ODN (utpekt som AS-1) for en selektiv knockdown effekt. For å utelukke muligheten for ikke-spesifikk påvirkning av en spesiell ODN sekvens, valgte vi en andre AS-ODN (AS-2) som er komplementær med den regionen (+ 95~ + 110 fra startkodonet) i nærheten av 5′-enden , men etter mitokondriell målretting signalsekvens (MTS), av hsp60 åpen leseramme (fig. S1A). Den forstand ODN (S-ODN) komplementært til AS-1 ble anvendt som en kontroll-ODN. Siden antisense ODN er en moderat translasjonell blocker, det gjorde ikke lokke fram reduksjon av total hsp60 nivå (Fig. S1B). Men transfeksjon av AS-ODNs faktisk selektivt reduserte cytosolic hsp60 nivåer sammenlignet med mock eller kontroll S-ODN uten å påvirke mitokondrienivå (fig. 4A). For å forstå dette fenomenet, hypotese vi at halveringstiden av hsp60-protein i to avdelinger kan være forskjellig. For å bevise det, var halveringstiden av cytosol-målrettede hsp60 (Hsp60c) bedømmes etter hemming av proteinsyntesen. Overraskende, nivået av cytosolisk hsp60-protein ble raskt redusert (beregnet
t
½ = 3,2 minutter), mens det totale nivå av endogene hsp60 og IKKα proteiner var uendret (fig. 4B). Videre, denne reduksjonen ble fullstendig blokkert ved behandling av en proteasominhibitor MG132 (fig. 4C). Det skal bemerkes at den MG132 behandling resulterte også i bemerkelsesverdig økning av basalnivået av den Hsp60c proteinet. Således dette resultat, i det minste delvis forklarer hvorfor nivået av cytosolisk hsp60 var mer følsomme for AS-ODN behandling, og det i tillegg tyder på at nivået av cytosolisk hsp60 kan bli kontrollert av proteasomet.
A. Ablasjon av cytosoliske hsp60 av antisense ODNs. De cytosoliske og mitokondrielle fraksjoner fremstilt av mock eller ODN-transfekterte HeLa celler ble immunblottet. S, sanse ODN; AS-en og AS-2, antisense ODNs. Den mitokondrielle fraksjon ble applisert ved et volum på en femtedel av den tilsvarende cytosoliske fraksjon. Spesielt prx III, som er en antioksidant enzym til stede i den mitokondrielle matriks, ble anvendt som mitokondrielle markører for å se på den ikke-spesifikke mitokondrie ruptur. B. Half-life of ectopically-uttrykte Hsp60c protein (HA tag) etter hemming av proteinsyntesen med cycloheximide. Intensiteten av HA-båndet ble målt og normalisert ved mengden av IKKα band. Data i grafen er midler ± S.D. av to uavhengige eksperimenter og montert i Sigmaplot 8.0 programvare. C. Proteasome avhengig omsetning på cytosolisk Hsp60c protein. HeLa-celler ble forbehandlet med eller uten MG132 (5 pM) 30 min før cykloheksimid behandling. D. TNF-α-indusert IKK og JNK1 aktivering i håne eller ODN-transfekterte celler.
in vitro
kinase aktivitet (KA) ble i gjennomsnitt med verdiene fra to uavhengige forsøk, og det er representert som en dobling av aktiviteten versus ustimulerte og mock-transfekterte celler (spor 1). E. NF-kB transcriptional aktivering i håne eller ODN-transfekterte celler. Den økende konsentrasjon av AS-ODN (100 nM eller 200 nM) ble testet. Den relative luciferaseaktivitet ble normalisert til den β-galaktosidase-aktivitet og data er middel ± S.D. av fire uavhengige forsøk (*
P
0,0001, **
P
0,001 versus stimulert S-ODN-transfekterte celler).
TNF -α-indusert IKK /NF-kB aktivering ble deretter undersøkt i AS-ODN-transfekterte celler. En
in vitro
kinase analyse viste at transfeksjon av AS-ODNs vesentlig reduserte ikk aktivering som respons på TNF-α med 60% i forhold til den av uekte eller S-ODN (fig. 4D). Imidlertid AS-ODNs hadde ingen effekt på MAP-kinase-aktivering som respons på TNF-α (fig. 4D og S1C fig.), Avslører den spesifikke effekten av hsp60 AS-ODNs på IKK aktivering. Videre AS-ODNs nesten fullstendig opphevet den NF-kB transkripsjonen aktivering som respons på TNF-α, mens S-ODN ikke, sammenlignet med mock-behandlede celler (fig. 4E). På grunn av sin knockdown effekt, AS-en er mer potent at AS-2. Men den transfeksjon av ODNs seg ikke overtale basal NF-kB aktivering, som indikerer ingen off-target effekten av ODNs. I tillegg er den reduktive virkning av AS-ODNs på NF-kB transkripsjonen aktivitet var også tydelig i 293T og A549-celler (fig. S1D). En ekstra kontroll eksperiment viste at AS-ODNs hadde ingen innvirkning på andre transkripsjonsfaktor aktivering, slik som AP-1, NF-AT, og CRE (Fig. S1E).
En lignende studie ble utført ved å blokkere cytosol-hsp60 ved å bruke et spesifikt antistoff (Hsp60N), som har vært anvendt for immunopresipitering og immunostaing av hsp60 (se fig. 1). Antistoffet transduksjon ble oppnådd ved en peptid-mediert protein avgivelsessystem [39]. Kontrollen geit IgG og Hsp60N antistoff ble funnet å bli levert til cytoplasma, så blir ikke slått sammen med Mitotracker (fig. 5A), og Hsp60N, men ikke kontroll IgG bundet til hsp60 (Fig. 5B). Dette resultatet indikerer at den leverte antistoffet kan fungere som en funksjon blokker. Deretter ble IKK /NF-kB-aktivering undersøkt i antistoff-transdusert celler. Den Hsp60N antistoffet tydeligvis reduserte ikk aktivering som respons på TNF-α med 50% av nivået oppnådd med (fig. 5C) kontroll IgG. I motsetning til dette ble TNF-α-indusert JNK-aktivering ikke berørt, noe som igjen viser at rollen til hsp60 er spesifikk for ikk aktivering. Konsekvent, den Hsp60N antistoffet reduseres den transkripsjonelle aktivitet av NF-kB (fig. 5D) betydelig. Dataene kollektivt konkludere med at cytosolic hsp60 fremmer TNF-α-indusert IKK /NF-kB signalering.
A. Transduksjon av hsp60-nøytraliserende antistoff (Hsp60N) inn i cytoplasma i HeLa-celler. Mitotracker Rød (Molecular Probes, USA) og DAPI indikere mitokondrier og kjerner, respektivt. B. transduced Hsp60N antistoff bundet til endogent hsp60. Etter antistoff transfeksjonen ble HeLa-cellelysatene utsettes for utfelling under anvendelse av protein-A Sepharose-kuler. De utfelte proteiner ble immunblottet for hsp60. C. ikk og JNK1 aktivering som respons på TNF-α kontroll IgG eller Hsp60N antistoff-transfekterte HeLa-celler.
in vitro
kinase-aktivitet (KA) ble fordelt med verdiene fra to uavhengige eksperimenter, og det er representert som et gangers økning av aktiviteten i forhold til ustimulerte og kontroll IgG-transfekterte celler (kolonne 1). D. TNF-α-indusert NF-kB transcriptional aktivering i antistoff-transfekterte celler (*
P
0,01 versus stimulert IgG-transfekterte celler).
Ektopisk uttrykk for cytosol -targeted hsp60 fremmer tilstrekkelig IKK /NF-kB aktivering
Motsatt ble rollen cytosoliske hsp60 i IKK /NF-kB vei opp av over-uttrykk for cytosol-målrettet Hsp60c. Den ectopically-uttrykt Hsp60c ble funnet å assosiere med ikk komplekse (fig. 6A) og markert forbedret IKK og NF-kB aktivering i respons på TNF-α (Fig. 6B og 6C). Det bør bemerkes at ektopisk ekspresjon av Hsp60c marginalt indusert basal IKK og NF-kB-aktivering. Effekten av Hsp60c ekspresjon i NF-kB-aktivering ble fullstendig opphevet i IKKβ-manglende celler (fig. 6D), som indikerer at den regulatoriske aktiviteten av cytosolisk hsp60 er IKK-avhengig. I tillegg hadde ikke ektopisk ekspresjon av Hsp60c ikke forbedre enten JNK-aktivering eller aktivering av andre transkripsjonsfaktorer slik som AP-1, CRE, og NF-AT (fig. S2). Dette resultat indikerer at en økning av cytosoliske hsp60-nivå forsterker TNF-α-indusert IKK /NF-kB-aktivering.
Celler ble transfektert med enten kontroll (VIE) eller Hsp60c-kodende plasmid (HA-tag) i 24 timer og deretter behandlet med TNF-α. A. Innlemmelse av ectopically-uttrykt Hsp60c (HA tag) i IKK komplekset. B. TNF-α-indusert ikk aktivering i HeLa-celler. C TNF-α-indusert NF-kB aktivering i HeLa-celler (
n
= 4, *
P
0,0001 versus unstimulated motstykke). D. TNF-α-indusert NF-kB aktivering i transfekterte IKKβ
– /- 3T3 celler (
n
= 4, *
P
0,001 versus stimulert CGN-transfekterte celler, ND ikke funnet).
hsp60 regulerer IKK fosforylering ved aktivisering T-loop
for å forstå mekanismen bak den regulatoriske tiltak av hsp60 i IKK /NF-kB aktivering, flere eksperimentelle tilnærminger ble forsøkt. For å bestemme hvorvidt den anstand aktiviteten av hsp60 er nødvendig, til de to aminosyrerester som er kjent for å være kritisk for den anstand aktiviteten av hsp60 ble vurdert. Den ene er en lysinrest (K28), som er involvert i den oligomerisering av hsp60-protein [40], [41]. Den andre er en aspartat rest (D423), som er et aktivt sete rest for ATPase-aktivitet [42], [43]. Således er de Hsp60c mutanter, hvor K28 og D423 er substituert med glutamat og alanin respektivt, ble konstruert. Kotransfeksjonssystemet Forsøket viste at begge mutanter samhandlet med IKKα og IKKβ like godt eller kanskje enda bedre enn villtypen (Fig 7A.). Den ikk aktivering som respons på TNF-α i hsp60 mutante-uttrykkende celler var den samme som i villtypen (fig. 7B), som indikerer at slike tap-av-funksjon mutasjonene ikke påvirke den IKK-fremmende aktivitet. Videre TNF-α-indusert NF-kB transkripsjon ble også forbedret i de mutante hsp60-uttrykkende celler ved omtrent 4-6 ganger høyere enn i vektorkontrollen (fig. 7C). Den Forsterkingen av mutantene var tydelig IKKβ avhengig, som testet igjen i IKKβ-manglende 3T3-celler. Dermed dette eksperimentet ved hjelp av tap-av-funksjon mutanter det sterkeste at de cytosoliske hsp60 fungerer uavhengig av anstand aktivitet i IKK /NF-kB aktivering.
Å. Association of Hsp60c villtype (WT) og mutanter med IKKα og IKKβ. De angitte proteiner ble co-uttrykt i 293T-celler, som vist i fig. 3A. B og C. IKK (B) og NF-kB transkripsjonen aktivering (C) i celler som uttrykker Hsp60c villtype og holde øye-inaktive mutanter. De kinase og reporter aktiviteter ble analysert som beskrevet i fig. 4 (for reporter analysen,
n
= 6, *
P
0,0001 versus unstimulated motstykke). D.
In vitro
kinaseaktivitet av IKK i nærvær av rekombinant hsp60-protein. Ikk komplekset ble immunopresipitert fra HeLa-cellelysatene og inkubert med eller uten de indikerte GST-proteiner (20 ug hver) i kinase reaksjonsbuffer i 10 minutter før kinasereaksjonen. E. Serine fosforylering av IKKα /β i HeLa celler transfektert med AS-1 ODN. Data i grafen er midler ± S.D. (
n
= 3, *
P
0,02, *
P
0,001). F. Serine fosforylering av IKKα /β i Hsp60c-uttrykk HeLa-celler. En representant blot er vist (
n
= 3).
En av IKK-samspill protein, elg, har vist seg å megle IKB rekrutteringen til IKK komplekset [24] . For å teste denne virkningsmåte, ble det rekombinante proteinet hsp60 direkte tilsatt til IKK-kinase-reaksjonen, hvor det aktiverte ikk-komplekset inkubert med full-lengde human IkB som et substrat.
in vitro
kinaseaktivitet av det aktiverte IKK mot IkB ble ikke påvirket av tilstedeværelsen av hsp60-proteinet (fig. 7D), noe som indikerer at hsp60 ikke er involvert i interaksjonen av IKK og dets substrat IkB.
til slutt, en direkte involvering av cytosoliske hsp60 i ikk aktivering ble løst ved å undersøke aktiverings-avhengig serin fosforylering i T-løkke av IKKα /β. AS-ODN transfeksjon markert avskaffet TNF-α-indusert fosforylering av IKK ved Ser178 /181, noe som indikerer at fosforylering avhengige ikk aktivering ble svekket (fig. 7E). Omvendt, ektopisk ekspresjon av Hsp60c resulterte i en økning av IKK-fosforylering (fig. 7F). Samlet viser dataene tyder på at den cytosoliske hsp60 er involvert i fosforyleringen avhengige ikk aktivering, snarere enn anstand-avhengige stabilisering av ikk-komplekset.
cytosoliske hsp60 påvirker NF-kB target-genekspresjon og celleoverlevelse
for å finne ut betydningen av cytosoliske hsp60-mediert regulering av IKK /NF-kB veien, undersøkte vi uttrykket av NF-kB målgener i ODN-transfekterte celler. Når ekspresjon av anti-apoptotiske gener ble screenet ved en RNase-beskyttelsestest [44], et uttrykk for TRAF1, c-IAP1, og c-IAP2 ble ikke påvirket av AS-ODN transfeksjon (fig. 8A). Dette var uventet, men ledet oss til å postulere en mulighet for at noen utvalgte mål gener knyttet til mitokondrie beskyttelse kan bli påvirket. For å teste dette, så vi på induksjon av flere mål gener, inkludert antioksidanter proteiner (ferritin tung kjede og MnSOD) og BCL-2 medlemmer (BCL-2, Bcl-X
L, Bfl-1 /A1). Interessant, AS-ODN vesentlig redusert induksjon av bare MnSOD og Bfl-1 /A1 uttrykk som respons på TNF-α (Fig. 8B). Den Hsp60N antistoffet også vesentlig redusert induksjon av disse genene (Fig. 8C). Det ble igjen bekreftet at induksjonen av c-IAP2 ekspresjon ikke ble påvirket i begge tilfeller. Således indikerer resultatene at reguleringen av ikk aktivering av cytosolisk hsp60 påvirker ekspresjon av utvalgte NF-kB målgener.
A. RNase beskyttelsestest for induksjon av anti-apoptotiske gener i ODN-transfekterte celler. Autoradiogrammet er vist er et representativt for tre uavhengige eksperimenter. B og C. QPCR for induksjon av endogene NF-kB målgener i ODN-transfekterte celler (B) og antistoff-transfekterte celler (C) (
n
= 3, *
P
0,001). D. TNF-α-mediert cellulær produksjon av ROS i ODN-transfekterte celler. De representative bildene blir vist. Dataene er midler ± S.D. av dobling i forhold til ubehandlede mock celler av den relative DCF fluorescens (
n
= 4, *
P
0,05, **
P
0,001). E. JNK og p38 MAPK aktivering i ODN-transfekterte celler. Representative blottene er vist. Dataene i grafene er midler ± S.D. av intensiteter av fosfor-JNK (P46) eller fosfor-p38 band som hadde blitt normalisert etter de tilsvarende ikke-fosfo-band (
n
= 3, *
P
0,05, **
P
0,001). F. ASK-en aktivering i ODN-transfekterte celler. Den kinase aktivitet (KA) ble i gjennomsnitt med verdiene fra to uavhengige forsøk, og presentert som en dobling av aktiviteten versus ustimulerte og mock-transfekterte celler (spor 1). G. TNF-α-indusert celledød i uekte eller ODN-transfekterte HeLa. Dataene er midler ± S.D. (
n
= 3, *
P
0,01). H. TNF-α-indusert celledød av kolon karsinom celler transfektert med ODNs. Nivået på hsp60 i subcellulære fraksjoner er vist (
Øvre
). Data i grafen er midler ± S.D. (
n
= 3, *
P
0,05, **
P
0,01). Celledød ble analysert ved FACS etter farging med annexin V-fluoresceinisothiocyanat og propidiumjodid.
Vi lurte på neste om en slik regulering av utvalgte mål gener har en innvirkning på celleoverlevelse. Siden det er en mulighet for at MnSOD og Bfl-1 /A1 funksjon for å undertrykke mitokondrie-avledede reaktive oksygenarter (ROS) [2], [45], nivået av celle ROS ble undersøkt i ODN-transfekterte celler ved hjelp av en oksydasjons følsom fluorescens fargestoff, CM-H
2DCFDA. AS-ODN transfeksjon induserte en markert økning av cellulære ROS som respons på TNF-α behandling i en tidsavhengig måte, sammenlignet med mock eller S-ODN transfeksjon (fig. 8D). Siden den forbedrede ROS nivå er knyttet til celledød via vedvarende JNK-aktivering [46], den vedvarende aktivering av stress-aktiverte protein-kinaser, JNK og p38 MAPK, ble undersøkt. Uventet, ble aktivering av både JNK og p38 MAPK funnet å være tydelig påført i AS-ODN-transfekterte celler (Fig. 8E). ASK-en MAP3K er kjent for å være ansvarlig for vedvarende aktivering av JNK og p38 i ROS-mediert celledød [47]. Som vist på fig.
