Abstract
transkripsjonsfaktor FOXO3 er et veletablert tumor suppressor hvis virksomhet, stabilitet og lokalisering er regulert av fosforylering og acetylering. Tidligere data ved vårt laboratorium demonstrert forsterket tromboksan-A
2 signale var assosiert med dårlig prognose i blærekreftpasienter og overekspresjon av tromboksan-A
2 isoform-β-reseptor (TPβ), men ikke TPα, indusert malign transformasjon av udødeliggjort blære celler
in vivo
. Her beskriver vi en mekanisme for TP mediert modulering av FOXO3 aktivitet og lokalisering av fosforylering og deacetylering i en blære kreft celle modell.
In vitro
gevinst og tap av funksjonsstudier i ikke-transformerte cellelinjer, UROsta og SV-høgskolen, avslørte knockdown av FOXO3 uttrykk ved shRNA økt celle migrasjon og invasjon, mens eksogent overekspresjon TPβ oppvokst basal fosforylert (p ) FOXO3-S294 nivåer. Omvendt, overekspresjon av ERK-resistent mutant FOXO3 redusert økninger i UMUC3 cellemigrering og invasjon, herunder at mediert av TP agonist (U46619). I tillegg, stimulering av celler med UMUC3 U46619 øket pFOXO3-S294 uttrykk, som kan svekkes ved hjelp av behandling med en TP-antagonist (PTXA
2) eller ERK-inhibitor (U0126). Utgangspunktet U46619 forårsaket atom opphopning av pFOXO3-S294; Men langvarig stimulering økt FOXO3 cytoplasma lokalisering. U46619 stimulering redusert samlet FOXO3 transkripsjonen aktivitet, men var assosiert med økt uttrykk av sin pro-overlevelse mål, mangan superoksid dismutase. Dataene viser også at TP stimulering øket ekspresjon av histondeacetylase, SIRT1, og korresponderte med redusert acetylert-FOXO3. Samlet tyder dataene på en rolle for TP signalering i reguleringen av FOXO3 aktivitet, formidlet blant annet gjennom fosforylering og deacetylering
Citation. Sobolesky PM, Halushka PV, Garrett-Mayer E, Smith MT, Moussa O ( 2014) Regulering av tumorsupressorproteinene FOXO3 av tromboksan-A
2 reseptorer i uroteliale kreft. PLoS ONE ni (9): e107530. doi: 10,1371 /journal.pone.0107530
Redaktør: Natasha Kyprianou, University of Kentucky College of Medicine, USA
mottatt: 04.02.2014; Godkjent: 19 august 2014; Publisert: 09.09.2014
Copyright: © 2014 Sobolesky et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Imaging fasiliteter for denne forskningen ble støttet, delvis ved Cancer Center Support Grant P30 CA138313 til Hollings Cancer Center, MUSC. Forskningsprosjektet beskrevet var delvis støttet med tilskudd RO1127905CA, UL1TR000062, og UL1RR029882 fra National Cancer Institute, National Institutes of Health. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Blærekreft er den femte vanligste kreftsykdommen i USA med overfladiske overgangsordning celle carcinoma (TCC) er den vanligste diagnosen form [1]. TCC har en stor grad av tilbakefall og krever kostbare livslang oppfølging, noe som gjør blærekreft en av de dyreste formene for kreft på over en pasients liv [2]. Å forstå mekanismene for onkogene transformasjon av urotelialceller er viktig å utforme effektive og nye terapier for behandling av blærekreft. Vi har tidligere identifisert en invers sammenheng mellom tromboxan-syntase (TXS) uttrykk og overlevelse av blærekreftpasienter, noe som tyder på en rolle for tromboksan prostaglandin (TP) signalering i urothelial tumorprogresjon [3]. TXS er et viktig enzym som katalyserer omdannelsen av prostaglandin H
2 til tromboksan A
2 (TXA
2). Det TXA
2-ligand, i sin tur, aktiverer TP-reseptoren, fremmer celle-migrering, proliferasjon, og invasjon, som er viktige kjennetegnene ved cellulær transformasjon og progresjon av sykdommen [3], [4], [5], [ ,,,0],6], [7]. Andre studier har antydet en rolle for TXA
2 signale i tumorigenese og ondartede fenotyper av prostata [8] og brystkreft [9], [10].
Den humane TP-reseptor-genet koder for to isoformer, TPα og TPβ [11]. Begge isoformene er syv transmembran G-protein-koblede reseptorer som skiller seg bare ved den C-terminale domene [12]. Den C-terminale variasjoner gjør at hver isoform til å interagere med både identiske og unike signalformidlere [13]. Uttrykk for de TP reseptor isoformer er vev og celletype avhengig. Vi har tidligere rapportert TPβ overekspresjon i blærecancerpasienter var assosiert med en signifikant reduksjon i overlevelse [14]. I tillegg er overekspresjon av TPβ, men ikke TPα, var tilstrekkelig for å øke migreringen, invasjon, og spredning, så vel som å indusere den maligne transformasjon av en immortalisert ikke-transformerte cellelinje urothelial [14]. Mekanismen for transformasjon indusert av TPβ overekspresjon er ukjent.
transkripsjonsfaktor gaffelhode box-O3 (FOXO3) regulerer viktige celleoverlevelses prosesser, inkludert oksidativt stress motstand, cellesyklus arrest og apoptose gjennom regulering av sine målgener f.eks mangan superoksid dismutase (MnSOD), p27
Kip1, Fas ligand (Fasl), og Bim [15], [16]. FOXO3 transkripsjonen aktivitet kan reguleres via post-translasjonelle modifikasjoner (PTM) slik som acetylering og fosforylering. Dysregulering av FOXO3 aktivitet og lokalisering har vært assosiert med kreft initiering og progresjon, samt kjemoterapeutiske motstand [17], [18], [19]. Acetylering av FOXO3 av histon-acetyl-transferase p300 har vært knyttet til redusert FOXO3 aktivitet, økt cytoplasmisk lokalisering, og degradering [20]. Deacetylering av NAD-avhengig deacetylase Sirtuin-en (SIRT1) har vist seg å differensielt regulere FOXO3 mål ved å fremme transkripsjon av p27
Kip1 og MnSOD, samtidig redusere transkripsjon av Bim og Fasl [21]. Ekstracellulære signalregulerte kinase 1 og 2 (ERK1 /2) har blitt vist å fosforylere FOXO3 ved -S294, -S344, og -S425, og negativt påvirke dens funksjon og stabilitet gjennom murine dobbelt minutt 2 (MDM2) -mediert FOXO3 degradering [ ,,,0],22]. Mens stimulering av TPβ er kjent for å indusere fosforylering og aktivering av ERK [23], [24], [25], så vidt vi vet ingen studier har undersøkt effekten av TP signale på FOXO3 modulering.
Her har vi identifisert FOXO3 som en nedstrøms mål for TP-reseptor-reaksjonsveien og undersøkt de negative effektene av TP-signalisering på FOXO3 lokalisasjon og funksjon i blære-cancer-avledet cellelinje UMUC3. Interessant nok ble samlet FOXO3 transkripsjonen aktivitet redusert følgende TP agonist-stimulering som resulterer i redusert ekspresjon av en apoptotisk mål, men forsterket ekspresjon av en spenningsmotstands mål. I overensstemmelse med tidligere studier [21], ble den differensielle ekspresjonen av FOXO3 mål følgende TP agonist-stimulering forbundet med økt ekspresjon SIRT1 og deacetylert FOXO3. Til sammen denne studien belyser en mekanisme som TP indusert modulering av FOXO3 aktivitet gjennom posttranslasjonelle modifikasjoner bidrar til ondartet fenotype av urotelialceller.
Materialer og metoder
Cell kultur
UROsta cellelinje, vennlig levert av Dr. Donald Sens (University of North Dakota, Grand Forks, ND) ble avledet fra normale menneskelige urotelialceller og udødeliggjort med SV40 T-antigen [26]. UROsta celler ble holdt i en 70:30 blanding av DMEM-medium (1 g /l glukose: 4,5 g /l glukose; Mediatech, VA, USA), 10% føtalt bovint serum (FBS). Simian virus 40-udødeliggjort human uroepithelial (SV-høgskolen), ikke-omformet urothelial cellelinjen ble vennlig levert av Dr. Santhanam Swaminathan (University of Wisconsin, Comprehensive Cancer Center, Madison, WI) [27], [28], [29] og cellene ble dyrket i F12K Khaigns modifisert media supplert med 10% FBS, insulin, hydrokortison, og transferrin. Blærecancercellelinje UMUC3 ble oppnådd fra American Type Culture Collection og celler dyrket i RPMI 1640 medium (Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL, USA) inneholdende 10% FBS. Hver media inneholdt 1% penicillin /streptomycin. Cellelinjer ble dyrket ved 37 ° C i 5% CO
2
Antistoffer, reagenser, og plasmider
Følgende antistoffer ble brukt i henhold til produsentens anbefalinger. PFOXO3-S294 , pc-Jun Ser63, c-Jun, Pakt Ser473, pMAPK Thr202 /Tyr204, Akt, ERK, p300, SIRT1, Bim, p27
Kip1 (Cell Signaling Technology, Danvers, MA, USA), FOXO3, GFP (i Santa Cruz), Lamin B1 (GeneTex, Irvine, CA, USA) MnSOD (EnzoLife Sciences, Ann Arbor, MI, USA), α-Tubulin (ABD Serotec, Raleigh, NC, USA), GAPDH (Sigma-Aldrich, St. Louis , MO, USA). TP spesifikk agonist, U46619 ble kjøpt fra Cayman Chemicals (Ann Arbor, Michigan, USA). ERK1 /2-hemmer U0126 ble kjøpt fra Sigma-Aldrich. FHRE-Luc plasmid var en gave fra Michael Greenberg (Addgene plasmid # 1789, Cambridge, MA, USA). GFP-FOXO3
3A (seriner-294, -344 og -425 byttet til alaniner) og kontrollere pEGFP-C
2 plasmid var gaver fra Mien-Chie Hung på The University of Texas M.D. Anderson Cancer Center. GFP-TPβ plasmid var en gave fra Jean-Luc Parent fra University of Sherbrooke, Canada.
Western blot analyse
Celler ble vasket med PBS og høstet i RIPA buffer (Thermo Fisher Scientific ) supplert med Komplett proteasehemmere Cocktail Tabletter og PhosSTOP fosfatase hemmere Cocktail tabletter (Roche Applied Science). Proteiner ble denaturert ved koking i Laemmli buffer (BioRad, Hercules, CA, USA) og løst med 12% SDS-PAGE. Etter protein overføring ble nitrocellulosemembranen blokkert med 5% melk i TBST 1 x og probet med primært antistoff i 5% BSA i 1 x TBST over natten ved 4 ° C. Etter primær antistoff inkubasjon ble membranene vasket i 1 × TBST og inkubert med HRP-linked sekundært antistoff (Cell Signaling Technology) i en × TBST. Membraner ble vasket 5 x 5 min med en × TBST og deteksjon ble visualisert ved hjelp SuperSignal West Pico kjemiluminescenssubstrat (Thermo Fisher Scientific). Western blot ble kvantifisert ved hjelp av Image Studio Lite Ver. 3.1 Følgende programvareinstruksjoner og grafene på GraphPad Prism 5.
transfections og generering av stabile kloner
For å generere stabile FOXO3 knockdown kloner, SV-høgskolens og UROsta celler ble transfektert med enten pRFP-C- RS kontroll plasmid, pRFP-C-egge~~POS=TRUNC eller pRFP-c-shRNA til FOXO3 plasmid (hysj-29; OriGene, Rockville, MD, USA) ved hjelp Fugene 6 (Roche Applied Science, Indianapolis, IN, USA). Enkelt kloner ble valgt i media som inneholder 2,5 mikrogram /ml puromycin (Invivogen, San Diego, CA, USA) og knockdown ble analysert ved immunoblotting hjelp av en FOXO3 spesifikt antistoff (H-144; sc-11351, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA , USA). Transfeksjon av GFP-TPβ inn i SVHUC-celler ble utført med TurboFect transfeksjon reagens (Thermo Fisher Scientific) ved anvendelse av et forhold på 1,5 ug DNA til 4 pl TurboFect. UROsta celler (1 x 10
6) ble electroporated med 3,5 mikrogram GFP-TPβ bruker Amaxa cellelinje Nucleofector kit V løsning boks (cat #: VCA-1003, Lonza, Allendale, NJ, USA) og Nucleofector 2b enhets (Lonza) med forhåndsprogrammerte protokoll T-030. Fire timer etter elektroporering mediet ble aspirert, erstattet med fullstendig medium, og inkubert ved 37 ° C i 5% CO
2. Transfeksjon effektivitet ble kontrollert 24 timer etter electroporation. For å generere stabile GFP-FOXO3
3A uttrykker UMUC3 kloner, ble celler i en 6-brønns plate transfektert ved anvendelse av 4 ul X-tremeGENE HP-DNA Transfection Reagent (Roche Applied Science) og 1,5 ug plasmid-DNA. Enkelt kloner ble valgt i media som inneholder 500 mikrogram /ml Geneticin Selective Antibiotika (Life Technologies, Grand Island, NY, USA).
Cell migrasjon analysen
BD Falcon Cell Culture Insert System inneholder polyetylentereftalat (PET) membraner med 8 um porer (BD Biosciences, Rockville, MD, USA) ble anvendt for denne analysen. Innsatsene ble forhåndsbelagt over natten med 5 ug /cm
2 fibronectin ved 4 ° C og ekvilibrert i vann i 2 timer ved 37 ° C før bruk. Trypsinisert celler ble samlet opp, tellet, og 5 x 10
4 celler ble resuspendert i 250 ul serumfritt medium. Det øvre kammer av innsatsen var fylt med cellesuspensjonen, mens 750 ul medium inneholdende 10% FBS ble tilsatt til bunnen av hver brønn. UROsta celler ble tillatt å migrere i 16 timer i en fuktig miljø ved 37 ° C med 5% CO
2. Etter overføringen ble celler fjernet fra den øvre overflate av membranen ved å tørke den med en fuktig bomullspinne. Den nedre overflate av membranene ble farget ved hjelp av Hema-3 Farging kit (Fisher Scientific, Pittsburg, PA, USA). Når fargingen var ferdig ble membranene skylt i destillert vann i overskudd av flekkfjerning og lufttørket over natten. Prosent migrering eller invasjon ble beregnet ved å telle og gjennomsnittet av antall celler invaderte i 10 tilfeldig synsfelt på en 40 x forstørrelse, dividert med arealet av mikroskopet visningsfeltet og deretter multiplisert med arealet av det transwell innsatsen. Deretter dele den tidligere beregnede antall med antall celler sådd og til slutt multipliseres med 100 for å få en prosent. Dette eksperimentet ble utført uavhengig tre ganger i duplikater.
Cell invasjon analysen
BD BioCoat Matrigel invasjonen Chamber Cell Culture Insert System inneholder 8 mikrometer PET membran (BD Biosciences) med et tynt lag av Matrigel basalmembran Matrix ble benyttet i denne analysen. Trypsinisert celler ble samlet opp, tellet og resuspendert ved 5 x 10
4 celler /ml i serumfritt medium. Den øverste kammer fikk 500 ul av cellesuspensjonen, mens 750 ul RPMI med 10% FBS ble tilsatt til brønnen. Cellene ble tillatt å invadere i 16 timer i en fuktig miljø ved 37 ° C med 5% CO
2 før celle fjerning fra den øvre overflate med en fuktig bomullspinne. Membraner ble farget ved hjelp av Hema-3 Farging kit (Thermo Fisher Scientific) og prosent invasjon ble beregnet som beskrevet i cellemigrering assay delen. Dette eksperimentet ble utført uavhengig tre ganger i duplikater.
Dual luciferase assay
UMUC3 celler ble sådd i 6-brønners plater på 0,3 × 10
6 celler /brønn, deretter transient transfektert innen 24 timer ved bruk av X-tremeGENE HP DNA transfeksjon reagens (Roche Applied Science) med 4 mikrogram av 3 × gaffelhode respons element (FHRE) reporter konstruksjon (Addgene plasmid # 1789) og 0,1 mikrogram pBind Renilla luciferase kontroll vektor (Promega, Madison, WI, USA). Transfekterte celler ble inkubert i 24 timer i en fuktig miljø ved 37 ° C med 5% CO
2. Cellene ble deretter serumsultede natten over og behandlet med enten bærer kontroll (metylacetat, Sigma-Aldrich) eller 1 uM U46619 (Cayman Chemical) i 30 eller 120 minutter. Etter behandling ble cellene vasket to ganger med PBS og høstet i Reporter Lysis Buffer (Promega). Luminescens ble målt ved anvendelse av en Microplate Veritas luminometer (Turner BioSystems, Sunnyvale, CA, USA) i 20 ul av hver prøve i 10 sekunder etter hver injeksjon av 50 ul Luciferase Assay Reagent II deretter 50 ul stopp og gløde. Gjennomsnittlig luciferase-ekspresjon Firefly ble justert til totalt protein og kontroll vektor Renilla luciferase ekspresjon, og deretter normalisert til bærerkontroll. Resultater representerer gjennomsnitt prosent aktiviteten av tre uavhengige eksperimenter utført i duplikater, Student
t
-Test (*) P. 0,05
Nuclear /cytoplasma cellefraksjone
UMUC3 celler ble serum sultet over natten og deretter forbehandlet med en pM Indometacin (Cayman Chemicals) i 10 minutter for å redusere endogen TXA
2 signalering. Celler ble behandlet med bærer eller 1 uM U46619 i 5, 30 eller 120 minutter. Cellene ble trypsinert, oppsamlet, og vasket to ganger med PBS. Fraksjonering ble utført ved hjelp av Pierce NE-PER Kjerne- og Cytoplasmatiske Extraction Kit (Thermo Fisher Scientific) etter produsentens protokoll. Ekstrakter ble analysert ved Western blot.
Immunpresipitasjon
Immunpresipitasjon av FOXO3 fra UMUC3 celler ble utført ved hjelp av NHS-tilknyttede IP /Co-IP kit (Thermo Fisher Scientific) følgende produsenter protokollen. Kort sagt ble de UMUC3 celler dyrket til 80% konfluens i 10 cm plater, og deretter plassert i serumfritt medium i 24 timer i en fuktig miljø ved 37 ° C med 5% CO
2. Cellene ble deretter behandlet med enten bærer kontroll (metylacetat, Sigma-Aldrich) eller 1 uM U46619 (Cayman Chemical) i 30, 60 eller 120 minutter. Etter behandling ble cellene vasket en gang med PBS (-CA, Mg) og høstet i iskald IP lyse /vaskebuffer supplert med proteasehemmer EDTA-fri cocktail og PhosSTOP inhibitor cocktail (Roche). Innsamlet lysat deretter sentrifugert for å fjerne cellerester og bestemt protein konsentrasjon bruker BCA protein assay kit (Thermo Fisher Scientific). NHS-aktiverte magnetiske kuler ble virvlet og 25 ul av slurryen ble overført til 1,5 ml rør per IP reaksjon. Rørene ble plassert på magneten og lagringsløsningen ble kastet, og deretter vasket med iskald 1 mM HCl og forsiktig vortex-blandet i 5 sekunder. Perlene ble samlet opp på magnetisk stativ og kastet supernatanten.
Antistoffløsningen ble fremstilt ved å fortynne to ug FOXO3 (Santa Cruz Biotechnology) og negativ kontroll kanin immunoglobulin fraksjon (fast-fase-absorbert) (Dako, Carpinteria, CA , USA) til en sluttkonsentrasjon på 2 pg antistoff i 100 ul 0.067M boratbuffer. Det tilsatt 100 ul forberedt antistoffløsning til de aktiverte perler, forsiktig blandet og inkubert på en roterende plattform i 60 minutter ved romtemperatur. Reaksjoner ble vortex-blandet i 10 minutter under inkuberingen for å sikre at kulene forble i suspensjon. Kulene ble samlet og supernatanten ble kastet. Vasket to ganger perler med elueringsbuffer, vortex-rør hver vask for å fjerne ikke-kovalent bundet antistoff. Bråkjøling buffer ble tilsatt til kulene, og inkubert på en roterende plattform i 60 minutter ved romtemperatur. Perlene ble samlet opp på magnetisk stativ og kastet supernatanten. Fremstilt og tilsatt 0,5 ml av modifisert boratbuffer til hver IP og forsiktig blandet ved vortex, da kulene ble samlet opp på magnetisk stativ og kastet supernatanten. Reaksjonene ble vasket to ganger med lyserings IP /vaskebuffer og deretter inkubert hver IP reaksjon med 100 ug lysat i sluttvolum på 500 ul lyserings IP /vaskebuffer supplert med protease og fosfatase-inhibitorer cocktail over natten (mellom 14-18 timer ved 4 ° C på en rotator. kulene ble vortex-omrørt hvert 15. minutt den første timen for å sikre at kulene oppholdt seg i suspensjon. Etter antigen inkubasjon ble kulene oppsamlet, vasket to ganger med IP-lyserings /vaskebuffer og deretter overført til et nytt 1,5 ml rør. vasket perler med ultrarent vann (pH 7,0), deretter plassert på magnetisk stativ og kastet supernatanten. proteinene ble eluert fra perlene med lav pH-elueringsbuffer (pH 2,0) to ganger og nøytralisert med Tris-HCl pH 8,5. eluerte proteiner ble så analysert ved hjelp av Western blot .
Statistisk analyse
Kontinuerlig resultater ble sammenlignet på tvers av forhold ved hjelp av en tosidig to-utvalgs Students
t
-test. Eksperimenter som inneholder mer enn to variabler ble sammenliknet med en enveis ANOVA fulgt med en Tukey post-hoc test. En P-verdi 0,05 ble ansett som statistisk signifikant
Resultater
knockdown av FOXO3 Øker urothelial migrasjon og invasjon
Vi har tidligere rapportert en rolle for TPβ reseptor i urothelial. migrasjon, invasjon, og ondartet transformasjon [3], [14]. Redusert FOXO3 uttrykk hos pasienter har også blitt koblet med urothelial kreft invasivitet [30]. For å bestemme hvorvidt FOXO3 inaktivering ville være tilstrekkelig til å indusere en ondartet fenotype uavhengig av TPβ, lav endogen TPβ uttrykker UROsta og SVHUC cellelinjer (tidligere bestemt [14]) ble stabilt transfektert med FOXO3 spesifikk shRNA (figur 1A). FOXO3-shRNA transfekterte celler reduserte FOXO3 protein uttrykk over en halvering i forhold til egge (SCR) -shRNA observert av Western blot og validerte ved å undersøke nedstrøms målet MnSOD (figur 1A). Sammenlignet med scr-shRNA-celler knockdown av FOXO3 ekspresjon resulterte i en økning på 39% og 114% i migrasjon, så vel som en 63% og 18% økning i invasjon av SV-HUC og UROsta celler henholdsvis, (P 0,05, figur 1B-C). Siden det ikke foreligger FOXO3 var tilstrekkelig til å indusere en ondartet fenotype i udødeliggjorte ikke-transformerte urotelialceller, undersøkte vi effekten av TPβ overekspresjon på FOXO3 inaktivering. SV-HUC og UROsta celler transfektert med TPβ viste en 0,5 gangers økning i den basal ekspresjon av det inaktive pFOXO3-S294-protein (figur 1D-E).
(A) Western blot av helcellelysater fra SV -HUC og UROsta celler stabilt transfektert med FOXO3-shRNA eller kontroll egge (scr-) shRNA immunoblottet for total FOXO3 og dens kjente nedstrøms mål MnSOD. a-tubulin ble brukt som lasting kontroll. Blot vises er representative for tre individuelle eksperimenter og tallene representerer de gjennomsnittlige forholdstall på FOXO3 til a-tubulin. Nøkkeltall kvantifiseres ved hjelp av Image Studio Lite Ver.3.1. SV-HUC og UROsta FOXO3 knockdown og kontroll kloner ble sådd på innsatser belagt med fibronektin eller matrigel og lov til å migrere (B) eller invadere (C) i 16 timer. Knockdown av FOXO3 øket SV-HUC og UROsta cellemigrering (39% og 114%) og invasjon (63% og 18%) sammenlignet med SCR-shRNA. Data representerer tre uavhengige analysene utført i duplikater og uttrykt som gjennomsnitt ± SEM. Betydning ble bestemt med en tosidig to-utvalg
t
-test, (* = P 0,05, n = 3) sammenlignet med scr- kontroll. (D) Overekspresjon av GFP merket TPβ i UROsta og SVHUC celler øker basal pFOXO3-S294 uttrykket (E) i forhold til vektorkontrollen (n = 3). Tallene representerer de gjennomsnittlige forholdstall på pFOXO3-S294 til FOXO3. Nøkkeltall kvantifiseres ved hjelp av Image Studio Lite Ver.3.1. [AU] = vilkårlige enheter.
Effekter av TP agonist stimulering på FOXO3 Fosforylering, lokalisering, og transkripsjonen aktivitet
For å demonstrere TXA
2 signalisering er involvert i FOXO3 regulering, fosforyleringen statusen FOXO3 og dets kjente regulator ERK ble undersøkt i UMUC3 celler etter TP agonist U46619 stimulering (figur 2A). TP-agonist-mediert fosforylering av ERK ved T202 /Y204 betydelig høyere (~ 1-fold) 15 og 30 minutter etter stimulering (figur 2A og C). Tilsvarende ble en signifikant økning i pFOXO3-S294 observert 15 (fem ganger), 30 (7-ganger), og 60 (3,5-fold) minutter etter TP agonist stimulering (figur 2A-B). Behandling av celler med UMUC3 TP antagonist pinan (PTXA
2) eller ERK-inhibitor (U0126) attenuert den U46619-medierte effekter av aktivert ERK og pFOXO3-S294 (figur 2D-I).
(A) UMUC3 celler ble behandlet med 1 pM U46619 i de angitte tidsrom. Cellelysater ble analysert ved immunblotting for både total og fosforylert ERK og FOXO3. GAPDH tjente som lasting kontroll. Blotter ble kvantifisert og forholdstall for (B) pFOXO3-S294 til FOXO3 og (C) pERKT202 /Y204 til ERK1 /2 ble tegnes ved hjelp GraphPad Prism 5. UMUC3 celler forbehandlet i 15 minutter med (D) 2 mikrometer TP antagonist pinan (PTXA
2) eller (G) 10 uM ERK-inhibitor (U0126) attenuert aktivering av ERK og fosforylering av FOXO3 etter behandling med 1 mM U46619 i 30 minutter. Cellelysater ble immunoblottet for både total og fosforylert ERK og FOXO3. a-Tubulin tjente som lasting kontroll. Grafer representerer kvantifisert forholdstall for (E og jeg) pFOXO3-S294 til FOXO3 og (F og G) pERKT202 /Y204 til ERK1 /2 ble fremstilt grafisk. Betydning ble bestemt for alle tallfestede blotter ved hjelp av en gjentatt tiltak Enveis ANOVA med Tukey post-hoc test. P . 0,05
Effektene av TP agonist stimulering på FOXO3 transkripsjonen aktivitet ble undersøkt av en dual luciferase assay. UMUC3 celler ble transient transfektert med den gaffelhoderesponselementet (FHRE) ildflue luciferase reporter-konstruksjonen og Renilla kontroll vektor, før behandling med bærer eller TP-agonist. FOXO3 transkripsjonen aktivitet ble betydelig redusert med 36% og 44% ved 30 og 120 minutter, henholdsvis følgende TP agonist stimulering i forhold til kjøretøykontroll (figur 3A).
(A) UMUC3 celler transient transfektert med 3 × gaffelhode responselement (FHRE) reporter konstruksjon og Renilla luciferase kontroll vektor ble behandlet med 1 pM U46619 i 30 eller 120 minutter og resulterte i redusert FOXO3 transkripsjonen aktivitet. Gjennomsnittlig luciferase-ekspresjon Firefly ble justert til totalt protein og kontroll vektor Renilla luciferase-ekspresjon før normalisering til bærerkontroll. Resultater representerer gjennomsnitt prosent luciferase aktivitet av tre uavhengige eksperimenter utført i duplikater. * P 0,05, Enveis ANOVA med Tukey post-hoc test. (B) UMUC3-celler ble serum-sultet over natten og forbehandlet i 15 min. med 1 uM Indomethacin før behandling med enten bærer eller 1 uM U46619 i 5, 30 eller 120 minutter. Cellene ble underkastet kjerne og cytoplasmisk fraksjonering og proteiner ble analysert ved hjelp av Western blot. α-Tubulin og Lamin-B1 fungerte som laste kontroller for cytoplasmatiske og kjernefysiske fraksjoner, henholdsvis. (C) Densitometry av blotter som viser langvarig agonist stimulering økt cytoplasma FOXO3 protein og økt kjerne pFOXO3 proteiner i forhold til kjøretøykontroller. Betydning ble bestemt for alle tallfestede blotter ved hjelp av en gjentatt tiltak Enveis ANOVA med Tukey post-hoc test. P . 0,05
Basert på fosforylering kinetikk FOXO3, undersøkte vi den cellulære fordeling av FOXO3 i UMUC3 celler behandlet med kjøretøy eller TP agonist for 5, 30 eller 120 minutter. Nukleære og cytoplasmatiske proteinfraksjoner ble analysert ved hjelp av Western blot (figur 3B) og bånd densiteter ble kvantifisert ved hjelp av Image Studio Lite Ver 3.1 (figur 3C). UMUC3 celler stimulert med TP-agonist viste en innledende økning i kjerne FOXO3 som også var assosiert med en økning i kjernefysisk pFOXO3-Ser294 (figur 3C). Langvarig stimulering resulterte i en betydelig økning i den totale FOXO3 i cytoplasma (Figur 3C).
TP stimulering øker SIRT1 uttrykk, deacetylering av FOXO3, og påvirker FOXO3 målet uttrykk
Effekten av U46619 stimulering på uttrykket nivåer av godt karakterisert FOXO3 mål p27
Kip1, MnSOD, og Bim ble undersøkt med Western blot (Figur 4A). UMUC3 celler stimulert med U46619 30, 120, og 240 minutter observeres redusert p27
Kip1 og Bim proteiner og øket MnSOD proteinekspresjon (figur 4A). Siden uttrykket mønster av FOXO3 mål lignet mønsteret observert etter overekspresjon av histon deacetyltransferase SIRT1 [21], undersøkte vi effekten av U46619 stimulering på SIRT1 uttrykk. UMUC3 celler stimulert med TP agonist som vises økt uttrykk av SIRT1 og redusert uttrykk av p300 i forhold til kjøretøykontroll (figur 4B-C). For å finne ut om den økte SIRT1 uttrykk i UMUC3 celler stimulert med TP agonist påvirket FOXO3 acetylering status, FOXO3 ble immunopresipitert fra UMUC3 celler behandlet med enten bil eller U46619, og immunoblottet for acetylerte lysinresidier. vist stimulering av celler med UMUC3 U46619 for 120 og 240 minutter en 48% og 70% reduksjon av acetylert FOXO3, henholdsvis (figur 4D-E).
(A) UMUC3 cellene behandlet med bærer eller 1 uM U46619 for 30, 120, og 240 minutter. Cellelysater ble samlet og analysert ved hjelp av Western blot for total FOXO3 ekspresjon og nedstrøms mål p27
Kip1, MnSOD, og Bim. (B) Protein uttrykk for p300 og SIRT1 i samme cellelysatene. α-tubulin tjente som lasting kontroll. (C) Tallfestede verdier fra blot av tre uavhengige eksperimenter fremstilles grafisk. (*) Viser p 0,05, Enveis ANOVA, sammenlignet med tid 0 for hver Target forholdet. (D) Økt SIRT1 uttrykk formidlet av U46619 i UMUC3 celler korresponderte med redusert acetylert FOXO3. Total FOXO3 ble immunopresipitert fra serum-sultet UMUC3 celler behandlet med bærer eller 1 uM U46619 30, 120, eller 240 minutter. Eluerte proteiner ble analysert ved hjelp av Western blot med antistoffer mot acetylerte lysinrester og FOXO3. Blot er representative for tre uavhengige eksperimenter. Blotter ble kvantifisert og forholdstall for (E) acetylert-lysin (acetyl-K) for å FOXO3 ble tegnes. Betydning ble bestemt ved hjelp av gjentatte målinger Enveis ANOVA med Tukey post-hoc test. P . 0,05
ERK motstandsdyktig mutert FOXO3
3A Redusert TP agonist mediert migrasjon og invasjon
UMUC3 celler ble stabilt transfektert med GFP-vektor eller mutert GFP-FOXO3
3A-konstruksjon hvor alle tre ERK fosforylering restene ble byttet ut med alanin-rester for å etterligne en ikke-fosforylert eller aktiv tilstand (figur 5A). For å avgjøre om U46619 mediert fosforylering av FOXO3 av ERK påvirker celle migrasjon og invasjon ble stabilt transfekterte celler lov til å migrere og invadere etter stimulering med bil eller U46619. Kontroll GFP-vektor-celler resulterte i en to-gangers økning i celle-migrering og invasjon med U46619 stimulering sammenlignet med bærerkontroll, mens ekspresjon av GFP-FOXO3
3A-proteinet redusert U46619 mediert migrering og invasjon (figur 5B-C) .
(A) GFP-FOXO3
3A eller EGFP-C
2 (Vector) ble stabilt transfektert inn UMUC3 celler og mutant FOXO3 uttrykk ble bekreftet av immunoblotting for GFP. α-tubulin tjente som lasting kontroll. Celler ble sådd ut i innsatser belagt med fibronektin for migrering eller matrigel for invasjon i serumfritt medium inneholdende 1 pM U46619 og plassert i brønner inneholdende komplett medium med 1 uM U46619. Celler ble tillatt å migrere (B) i 8 timer eller invadere (C) i 16 timer. Betydning ble bestemt med en tosidig to-utvalg
t
-test, (* = P 0,05, n = 3) sammenlignet med GFP-vektorkontroll. (D) UMUC3-celler ble forbehandlet med 10 uM U0126 i 15 minutter før stimulering med 1 uM U46619 og tillatt å migrere i 16 timer. Data representerer tre uavhengige analysene utført i duplikater og uttrykt som gjennomsnitt ± SEM. Betydning ble bestemt med en enveis ANOVA med Tukey post-hoc test. P . 0,05
For ytterligere å demonstrere betydningen av ERK signal i TXA
2 mediert celle mobilitet, vi pre-behandlet med ERK inhibitor U0126 (10 mm) i 10 minutter før måle effekt på U46619 mediert migrasjon.
