Abstract
Twist1 overekspresjon er hyppig observert i ulike kreftformer, inkludert magekreft (GC). Selv om DNA metylering av
Twist1
genet har blitt rapportert hos kreftceller, mekanismene bak transkripsjonen aktivering fortsatt usikre. I denne studien, vi først undersøkt epigenetiske forandringer av
Twist1
bruker
Twist1
transkripsjons-positive og -negative cellelinjer som er utledet fra vårt etablerte diffuse-type GC musemodell. Behandling med en DNA-demetylering middel 5-aza-dC reaktiveres Twist1 ekspresjon i Twist1 ekspresjons-negative GC-celler. Ifølge metylering spesifikk PCR og bisulfite sekvensering analyse, metylering ved CpG rike region innenfor
Twist1
koding ekson 1, snarere enn dens promoter-regionen, var tett knyttet til transkripsjonen stanse av
Twist1
ekspresjon i mus GC-celler. Kromatin immunoutfellingsstudier analyser viste at aktiv histone mark H3K4me3 ble beriket i Twist1 uttrykk-positive celler, og inaktive histon mark H3K9me3 ble beriket i Twist1 uttrykk-negative celler. Uttrykket nivåer av
Suv39h1 Hotell og
Suv39h2
, histone metyltransferaser for H3K9me3, ble omvendt korrelert med
Twist1
uttrykk, og knockdown av
Suv39h1
eller
Suv39h2
indusert
Twist1
uttrykk. Videre Sp1 transkripsjonsfaktor bundet til ekson 1 CpG rike regionen i Twist1 uttrykks-positive cellelinjer, og
Twist1
uttrykk ble svekket av mithramycin, som som forstyrrer SP1 binding til CpG-rike regulatoriske sekvenser. Våre studier antydet at
Twist1
transkripsjon i GC-celler kan bli regulert gjennom potensial samarbeid med DNA metylering, histon endring i kompleks med SP1 binding til CpG-rike regioner i ekson en region.
Citation: Sakamoto A, Akiyama Y, Shimada S, Zhu WG, Yuasa Y, Tanaka S (2015) DNA Metylering i Exon en region og Complex Regulering av Twist1 Expression i Gastric kreftceller. PLoS ONE 10 (12): e0145630. doi: 10,1371 /journal.pone.0145630
Redaktør: Tae-Young Roh, Pohang vitenskapelige og teknologiske universitet (POSTECH), Sør-Korea
mottatt: 21 september 2015; Godkjent: 06.12.2015; Publisert: 22.12.2015
Copyright: © 2015 Sakamoto et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet: All relevant data er i avisen og dens saksdokumenter filer
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av Grants-i-Aid for Scientific Research (C) (24590444) og (A) (25253081), og A3 Foresight sight~~POS=HEADCOMP Program (AA005) fra Japan Society for Promotion of Science (JSP), og praktisk forskning for Innovative Cancer Control (15Ack0106017h0002) fra Japan Direktoratet for medisinsk forskning og utvikling, AMED; https://kaken.nii.ac.jp/d/r/30253420.ja.html, https://kaken.nii.ac.jp/d/r/80262187.ja.html.
konkurrerende interesser: forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Forkortelser:. BS, bisulfite sekvensering; CGI, CpG island; Chip, kromatin immunpresipitering; DCKO, dobbel betinget knockout mus; DGC, diffus-type magekreft; GAPDH, glyseraldehyd-3-fosfat-dehydrogenase; GC, magekreft; H3K4me3, histon H3 lysin 4 tri-metylering; H3K9me3, histon H3 lysin 9 tri-metylering; H3K27me3, histon H3 lysin 27 tri-metylering; MSP, metylering-spesifikke polymerase-kjedereaksjon; RT-PCR, revers transkripsjon-polymerasekjedereaksjon; QRT-PCR, kvantitativ RT-PCR; TSGs, tumorsuppressorgener; TSS, transkripsjon start stedet; 5-aza-DC, 5-aza-2′-deoxycitidine
Innledning
Twist1, fungerer som en grunnleggende helix-loop-helix transkripsjonsfaktor, bindes direkte til e-bokselementer (NCANNTGN ) på spesifikke målgener [1]. Twist1 er viden kjent for å være avgjørende for mesoderm formasjon under tidlig embryoutvikling av Drosophila og mus [2, 3]. I humane kreftformer, er ektopisk ekspresjon Twist1 rapportert å være assosiert med malign progresjon, invasjon epithelial-til-mechencymal overgang, metastase og stemness, noe som indikerer potensielle onkogene funksjoner av Twist1 [4-6]. Dermed er det svært viktig å avklare transkripsjonsregulerende mekanismer for Twist1 i kreftceller.
epigenetiske endringer, for eksempel DNA metylering og histon modifikasjon, er tett knyttet til genet Slå [7-9]. Selv om epigenetiske forandringer ved CGI (CpG øy) promoter region av tumorsuppressorgener (TSGs) er kjent for å være forbundet med deres geninaktivering [10], er mekanismene for epigenetisk regulering av onkogener dårlig forstått. Flere grupper har vist at
Twist1
ble re-aktiveres ved behandling med en Demetyleringen medikament, 5-aza-2′-deoxycitidine (5-aza-dC), i kreftceller [11, 12]. Avvikende DNA metylering ved CGI arrangøren i menneskelig
Twist1
har vært hyppig påvist i primærkreftformer inkludert av magekreft (GC) [11-14]. Likevel er det en rekke funn som DNA metylering på
Twist1
promoter-regionen er ikke korrelert med uttrykk av genet i ulike kreft [12, 14]. Mens
Twist1
metylering kan være en nyttig biomarkør for å forutsi de kliniske utfall som til tilbakefall og overlevelse hos pasienter med kreft [12, 13, 15], er det fortsatt kontroversielt hvorvidt
Twist1
metylering ved promotorområdet fører til stanse av genet.
transkripsjonsregulering av gener er korrelert med lysin (K) metylering mønstre i histon-hale som består av tre forskjellige lysin metylering tilstander (mono-, di- og tri-). Tri-metylering av H3K4 (H3K4me3) er knyttet til genet aktivering, og at av H3K9me3 og H3K27me3 til genet undertrykkelse [7-9]. Selv om disse tre histon H3-methyaltion mønstre er knyttet til CGI metylering også, transkripsjonsregulerende mekanismer for
Twist1
underliggende histone modifikasjon er dårlig forstått i kreftceller.
GC er den nest hyppigste dødsårsak av kreft i verden [16]. GC er klassifisert i to hoved histologiske typer; diffus og intestinal, som er to forskjellige reaksjonsveier karsinogene [17]. Diffuse-type magekreft (DGC) er kjent for å vise hyppig invasjon og metastasering, som resulterer i en dårlig prognose [18]. Tap av E-cadherin og p53 er blitt rapportert i diffust-type gastrisk karsinogenese [19-21]. Flere rapporter viste hyppig overekspresjon av Twist1 i menneskelige DGCs [22, 23].
Vi har tidligere utviklet en dobbel betinget knockout (DCKO) mus linje som til E-cadherin og p53, som er spesielt inaktivert i magen [ ,,,0],19]. Alle DCKO musene fatale DGCs innen et år, de fenotyper blir høy invasivitet og hyppige metastaser til lymfeknuter. Det er bemerkelsesverdig at genuttrykksmønster av DGCs i DCKO mus oppdaget på microarray analyse var veldig lik de menneskelige annet enn tarm de primære DGCs. Dermed er vår DCKO musemodell et kraftig verktøy for å undersøke rollen av genfunksjon i DGC karsinogenese og for å utvikle et terapeutisk strategi. I denne studien har vi etablert Twist1 uttrykk-positive og -negative DGC cellelinjer som er utledet fra DCKO mus. Som en konsekvens av analyse av epigenetiske forandringer, ble den felles reguleringsmekanisme for
Twist1
klarlagt, og evaluert i både murine og humane DGCs i denne studien.
Materialer og Metoder
Etikk erklæringen
Alle
in vivo
prosedyrene ble godkjent av Animal Care Committee of Tokyo Medical and Dental University (Permission nr 0160073A). Som for normale menneskelige mage slimhinner prøver, ble skriftlig informert samtykke innhentes fra alle fag, og studien ble godkjent av etikkomiteen i Tokyo Medical and Dental University (No.1115).
Cell kulturer og vevsprøver
Vi har tidligere etablert en E-cadherin /p53 DCKO (
Atp4b-Cre
+
;
Cdh1
loxP /loxP
;
Trp53
loxP /loxP
) musemodell [19]. Fra sin kreft vev, etablerte vi fem mus DGC cellelinjer og kalte dem MDGCs (Shimada S, upublisert observasjon). MDGC-1 og MDGC-3-celler ble dyrket i Dulbeccos modifiserte Eagles medium (DMEM) inneholdende høy glukose supplert med 10% føtalt bovint serum, og MDGC-7, MDGC-8 og MDGC-9 ble dyrket i Hams F12 supplert med 5% hesteserum. ble utført DNA-analyse for å detektere avkortet
Cdh1 Hotell og
Trp53
alleler (S1 Fig). Åtte mennesker GC cellelinjer (KATO-III, GCIY, AGS, MKN7, MKN45, MKN74, NUGC4 og HSC60) ble også brukt i denne studien. MKN7, MKN45, MKN74, GCIY og KATO-III ble kjøpt fra Riken cell bank (Tsukuba, Japan). NUGC4 og AGS celler ble hentet fra Human Science Research Resources Bank (Osaka, Japan) og ATCC (American Type Cell Collection). HSC60 celler ble hentet fra Dr. Kazuyoshi Yanagihara (National Cancer Research Center, Tokyo, Japan) [24]. KATO-III, MKN7, MKN45, MKN74, NUGC4, AGS og HSC60 celler ble dyrket i RPMI 1640, og GCIY ble dyrket i Dulbeccos modifiserte Eagles medium, begge supplert med 10% føtalt bovint serum. For de-metylering studier, murine og humane GC-celler ble behandlet daglig med 500nM 5-aza-deoksycytidin (5-aza-dC, Sigma, # A3656) i 72 timer. Vi har behandlet disse GC-celler med 100nM trichostatin A (TSA, Wako; # 200-11993) i 24 timer eller 100 nM mithramycin A (Wako; # 132-17101) i 24 timer
Atten primære GC vev og tilsvarende. ikke-kreft gastriske slimhinner ble oppnådd fra 15 DCKO mus. Som for menneskelige mage vev, brukte vi tre ikke-kreft mage slimhinner fra GC pasienter. Vi har også fått fem normal mage slimhinner fra
Atp4b-Cre
–
;
Cdh1
loxP /loxP
;
Trp53
loxP /loxP
mus som ble brukt som negative kontroller i vår tidligere studie [19]. I denne studien har vi kalt «normal mage slimhinner» hvis prøvene ble hentet fra kontroll mus, og «ikke-kreft mage slimhinner» hvis prøvene ble hentet fra DCKO mus og menneskelige GC pasientene i denne studien.
revers transkripsjon (RT) -PCR og kvantitativ RT-PCR (QRT-PCR)
Total RNA ble isolert med en RNeasy Mini kit (Qiagen; # 74134) og cDNA ble fremstilt fra RNA ved hjelp av et Superscript III kit (Invitrogen; # 18080044) i henhold til produsentens protokoller. Sluttpunkt RT-PCR utført med flere syklus tall 28-35 sykluser. Som en intern kontroll, glyceraldehyd-3-fosfat-dehydrogenase (
GAPDH
) ble amplifisert med 21 sykluser for å sikre cDNA kvalitet og kvantitet for hver RT-PCR. De amplifiserte produkter ble lastet til 2% agarosegel eller kvantifisert ved kvantitativ RT-PCR bruker LightCycler DNA Master SYBR Grønn I (Roche Diagnostics, # 04707516001). Forsterker programmer for PCR ble gjentatt i 40 sykluser for GAPDH og 45cycles for andre gener unntatt GAPDH. PCR-produktene ble klonet inn i pMD20 T-vektoren ved hjelp av en Mighty TA-kloningssett (Takara BIO INC; # 6028), og deretter sekvensert direkte. Primersekvensene og PCR-produkt størrelser er vist i tabell S1.
Metylering Analyse
ekstraheres genom-DNA fra murine og humane cellelinjer GC ved fenol-kloroform-metoden, og deretter utføres bisulfitt modifikasjon og MSP prosedyren. Bisulfite behandling av DNA ble utført med EZ DNA Metylering-gull (ZYMO FORSKNING; # D5006), og deretter metylering spesifikke PCR (MSP) ble gjennomført. I korthet ble PCR reaksjonen utført i 35 sykluser i en 25 pl blanding som omfatter bisulfitt-modifisert DNA, 2,5 pl av 10 x PCR-buffer, 1,25 ul 25 mM dNTPs, 25 pmol /l av hver primer og en U av Jumpstart RedTaq polymerase (Sigma ; # D0563). Betingelsene for PCR var som følger: 95 ° C i 5 minutter; 35 sykluser av 95 ° C for 1minutes, 53 ° C for 2 minutters, og 72 ° C for 1.5minutes; og en endelig forlengelse ved 72 ° C i 5 minutter. Som for mus GC vev, ble DNA ekstrahert fra formalinfiksert parafin-embedded (FFPE) vev. Bisulfite DNA ble forsterket med flanke PCR primere og deretter nestet MSP ble gjennomført [25, 26]. Primersekvensene og PCR-produktstørrelser er vist i S2 Tabell
Chromatin immunoprecipitation (chip) assay
chip Analysen ble utført ved hjelp av en chip-IT Express kit (Active Motif, # 53008). henhold til produsentens protokoll. Immunopresipitert DNA berikelse ble normalisert som til inngangen. Antistoffene som brukes i denne studien var anti-histon H3K4me3 (Active Motif, # 39915), anti-H3K9me3 (Active Motif, # 39765), anti-H3K27me3 (Active Motif, # 39155), anti-H3K36me2 (Abcam; # ab9049) , anti-SP1 (Abcam; # ab13370), og anti-Histone H3 (Active Motif, # 39163) antistoffer. Normal kanin IgG (Cell Signaling Technology; # 2729s) ble brukt som en negativ kontroll for chip. Primersekvensene og PCR-produktstørrelser er vist i S2 tabell.
Pusse analyse ved hjelp av små interfererende RNA
siRNA-basert knockdown av
Suv39h1 Hotell og
Suv39h2
ble utført ved anvendelse av en elektroporering (Neon transfeksjon system, Invitrogen) i henhold til produsentens instruksjoner. MDGC celler ble transfektert med 50 nM siRNA av Suv39h1 (SASI_Hs02_00335192, Sigma), Suv39h2 (SASI_Hs01_00101226), eller negativ kontroll siRNA (Mission siRNA Universal negativ kontroll, Sigma). Etter 48 timer dyrking ble cellene høstet for RT-PCR, Western blot analyser, migrasjon, invasjon, og spredning analysen.
Western Blot analyse
GC cellene ble lysert med Pierce RIPA buffer (Thermo vitenskapelig; # 89900). Proteinene ble separert på SDS-polyakrylamidgeler og deretter overført til polyvinylidenfluorid (PVDF) membraner, etterfulgt av inkubasjon med antistoffer oppløst i Tris-bufret saltvann (TBS) inneholdende 2% skummet melk og 10% Tween 20. De primære antistoffer som brukes i denne studien ble mus monoklonalt anti-Twist1 (1: 100, Santa Cruz Bio-teknologi; # sc-81417), kanin-polyklonalt anti-Sp1 (1: 200, Aktiv motiv, # 39058), og muse-monoklonalt anti-α-tubulin ( 1: 200, Santa Cruz, # sc-8035) antistoffer. De sekundære antistoff alkalisk fosfatase-konjugert anti-kanin-IgG (1: 3000, Bio-Rad Laboratories; # 1706518), og anti-mus IgG (1: 3000, Bio-Rad Laboratories; # 1706520). Blottene ble utviklet med ImmunoStar AP substrat (Bio-Rad Laboratories; # 1705018)
Immunohistochemistry
FFPE- seksjoner (4 mikrometer) ble deparaffinized i xylen, rehydrert i graderte etanol løsninger og deretter Antigen henting. ble utført i 10 mM sitronsyrebuffer med mikrobølger. Immunhistokjemi ble utført ved anvendelse av anti-Twist1 antistoffer (Santa Cruz, 1:20) som tidligere beskrevet [19]. Uttrykk for Twist1 ble definert som positiv atom flekker i mer enn 10% av cellene, og intensiteten ble scoret som- (negativ), + (svak) og ++ (moderat til sterk) med tre etterforskere uavhengig.
Resultater
Twist1 uttrykk i murine og humane GC cellelinjer
fra DGC vev av DCKO mus,
Twist1
transkripsjons-positive cellelinjer (MDGC-7, MDGC- 8 og MDGC-9) og negative cellelinjer (MDGC-1 og MDGC-3) ble opprettet (figur 1A og S2A figur), og ekspresjon av Twist1 protein ble bekreftet i hver cellelinje (figur 1B). Twist1 uttrykk ble forsterket på mRNA og protein nivå i Twist1 uttrykks-negative MDGC celler etter behandling med DNA demetylering agenten 5-aza-DC (fig 1C og 1D), mens uttrykket ikke ble endret etter behandling med histondeacetylase inhibitor TSA (S2B fig). I de åtte menneske GC cellelinjer undersøkt,
Twist1
uttrykk ble nedregulert i fire cellelinjer (figur 1E, venstre), tre (KATO-III, GCIY og AGS) som demonstrerte re-aktivering av
Twist1
uttrykk etter behandling med 5-aza-dC ved RT-PCR (eksempel figur 1E, til høyre). Som for
Twist1
uttrykks-positive GC cellelinjer, etter fem-aza-dC behandling, 2.1- og 3.2-fold oppregulering av
Twist1
ble påvist i henholdsvis MKN45 og MKN7,, ved QRT-PCR, mens Twist1 uttrykk ikke ble endret i MDGC-9 celler (figur 1F).
(A) RT-PCR analyse av
Twist1
mRNA uttrykk i fem mus GC cellelinjer MDGC-1, MDGC-3, MDGC-7, MDGC-8 og MDGC-9) fra DCKO mus. Mus
GAPDH
ble brukt som en intern kontroll. (B) Expression of Twist1 protein i MDGC celler ved Western blot. α-tubulin ble anvendt som en intern kontroll. (C og D) Virkninger av en DNA-demetylering middel i MDGC celler. Etter behandling med 5-aza-dC,
Twist1
ekspresjon ble oppregulert på mRNA-(C) og proteinnivåer (D) i Twist1 ekspresjons-negative MDGC-1 og MDGC-3-celler, men ikke i Twist1 uttrykk-positive MDGC-9 celler. M, mock; A, 5-aza-dC. (E) RT-PCR analyse av
Twist1
mRNA uttrykk i humane GC cellelinjer (KATO-III, GCIY, AGS, MKN74, MKN7, MKN45, NUGC4 og HSC60) (til venstre).
Twist1
uttrykk ble oppregulert på mRNA nivå i KATO-III og GCIY celler etter 5-aza-dC behandling (til høyre). Menneskelig
GAPDH
ble brukt som en intern kontroll. (F) QRT-PCR analyse av
Twist1
mRNA uttrykk i MDGC-9, MKN7 og MKN45 celler med og uten 5-aza-dC behandling (** P 0,01).
CGI metylering og uttrykk for
Twist1
i GC cellelinjer
Twist1
har et tett CGI regionen fra arrangøren til hele exon 1, denne regionen blir sterkt konservert blant virveldyr inkludert mus og menneske (S3 fig). For å klargjøre CGI i mus og menneske
Twist1
utførte vi beregningsanalyse ved hjelp av UCSC Genome Browser (https://genome.ucsc.edu/index.html) og MethPrimer (http: //www.urogene. org /methprimer /) som er mye brukt som identifikasjon av CGI og MSP primere [27]. Vi analyserte ca 1,4 kb regionen, inkludert arrangøren og hele exon 1. UCSC Genome Browser på mus og menneskelig analyse utstilt en CGI i regionen undersøkt (data ikke vist). Imidlertid antatte to CGI-områder ble detektert i regionen i både mus og menneske når vi brukte kriteriene for CGI med GC-innhold på 50% og følges /ventet CpG-forhold på 0,8 ved MethPrimer (Fig 2A og 2C). Disse to antatte CGI-regioner ble plassert på promoteren og ekson 1. Siden metylering ved promotorområdet har blitt rapportert i forskjellige humane cancere [12, 14], vi først undersøkt metylering status ved regionen i murine og humane cellelinjer GC av MSP. Imidlertid metyleringen status ved promoter-regionen i
Twist1
ikke samsvarer med dets ekspresjon i alle GC cellelinjer undersøkt (region P1, figur 2A). For å bestemme kritisk denaturert regioner forbundet med Twist1 uttrykk i MDGC celler, vi videre utført MSP på CGI-regionen i ekson 1 (E1-1, E1-2 og E1-3), og spådde CpG shore språk ligger ca 1,6 kb fra TSS (transkripsjon start stedet, S1) (figur 2A). Som et resultat, CGI metylering ved området (E1-1 og E1-2) rundt TSS i
Twist1
ekson 1 ble funnet å korrespondere til ekspresjon av genet i MDGC celler, selv om det ikke var noen korrelasjon mellom dem ved den forutsagte shore region (S1) og enden av ekson en region (E1-3) (figur 2B, til venstre) i MDGC celler. Ingen metylering ble oppdaget på noen CpG regioner i tre normal mage slimhinner uten Twist1 uttrykk fra
Atp4b-Cre
–
;
Cdh1
loxP /loxP
;
Trp53
loxP /loxP
mus (Fig 2B). I human mage slimhinner, ingen
Twist1
metylering ble også funnet i tre ikke-kreft mage slimhinner fra GC pasienter (fig 2D), hvorav den ene viste veldig svak
Twist1
uttrykk (data ikke vist ). Vi undersøkte også ytterligere fire ikke-kreft gastrisk mucosa fra GC-pasienter, mens ingen metylering ble detektert ved E1-2 region i noen tilfeller (data ikke vist). Bisulfite sekvensering (BS) viste at CGI-regionen i exon 1 viste tett metylering i Twist1 uttrykks-negative MDGC-3 celler, men ikke i Twist1-positive MDGC-9 celler (BS-c, 2A og 2B, høyre), mens det var ingen forskjell i metylering mønsteret mellom dem på CpG kysten og promotorområdene (BS-a og BS-B, fig S4A). Blant de humane GC cellelinjer, KATO-III og GCIY uten
Twist1
ekspresjon viste tett CGI metylering ved området av ekson 1 (E1-2) som er i overensstemmelse med de av mus
Twist1
(fig 2C og 2D, venstre). Både metyleringen og unmethylation i E1-2-regionen ble påvist i MKN7 og MKN45 celler ved MSP og bisulfitt-sekvensering (figur 2D) som er basalt uttrykt Twist1 men deres ekspresjonsnivåer ble økt etter 5-aza-dC behandling (figur 1F). Således våre data indikerer at metylering i ekson 1 regionen
Twist1
påvist i denne studien er korrelert til dets ekspresjon.
(A) Skjematisk fremstilling av genomisk struktur og den forutsagte med CGI MethPrimer (https://www.urogene.org/methprimer/) muse
Twist1
genet. To CGIer (tynne blå regioner, venstre -358 til -149, høyre, -96 til 759) ble observert på regionen fra arrangøren til hele exon 1 (Obs /Exp = 0,8,% GC 50%). Den bøyde pilen viser transkripsjon start hotellet (TSS). Individuelle CpG nettsteder er angitt som oransje vertikale linjer. Boksene betegne exon. De svarte tohodet piler indikerer regionene (S1, P1, E1-1, E1-2 og E1-3) undersøkt ved metylering spesifikk PCR (MSP). De blå tohodet piler indikerer regionene undersøkt av ChIP analysen. De røde linjene viser regionene undersøkt av bisulfite sekvensering (BS). (B) MSP analyse av MDGC cellelinjer og tre normal mage slimhinner fra
Atp4b-Cre
–
;
Cdh1
loxP /loxP
;
Trp53
loxP /loxP
mus i de fem regionene (til venstre). U: unmethylated lene; M: metylert alleler. BS i regionen 322-670 (BS-c) i MDGC-3 og MDGC-9 (høyre). BS-A og BS-B er vist i S3 fig. MSP-regionen i E1-2 og BS-c tilsvarer
Twist1
uttrykk. Svarte sirkler representerer metylert CpG nettstedet; hvite sirklene representerer de unmethylated CpG nettsteder. (C) Skjematisk fremstilling av genomisk struktur og den forutsagte CGI med MethPrimer av det menneskelige
Twist1
genet. To CGIer (venstre, -369 til -138, høyre, 91-742) ble observert (Obs /Exp = 0,8,% GC 50%). (D) MSP og BS analyser av humane GC cellelinjer og tre ikke-kreft gastrisk mucosa fra GC-pasienter. Vi vurderte fire regioner (venstre, P1, E1-1, E1-2 og E1-3) og exon 1 (høyre, 315 til 651, BS-c) i den menneskelige
Twist en
genet, som er plassert analogt mus MSP og BS regioner. Tett metylering ble oppdaget i KATO-III celler mangler
Twist1
uttrykk, mens MKN45 celler uttrykker
Twist1
utstilt både denaturert og unmethylated alleler.
Twist1
metylering og uttrykk i DCKO mus GC vevsprøver
Vi undersøkte metylering status for
Twist1
bruker 18 primære GC vev fra 15 DCKO mus. Fordi GC regionene var veldig liten og deres DNA fra FFPE-prøver viste lave konsentrasjoner, utførte vi nestet MSP [25, 26].
Twist1
ble betydelig metylert (9/18, 50%) i primær GCer sammenlignet med tilsvarende ikke-cancerous vev (1/10, 10%), å være statistisk signifikant forskjell (P 0,05, tabell 1). Representative data med MSP er vist i figur 3A. Blant dem, 4 av 10 (40%) tilfellene var intramucosal og 5 av 8 (62,5%) ble invasiv GCer (tabell 1). I denne studien
Twist1
metylering-positive tilfeller demonstrert unmethylated MSP band også, som på grunn av tilstedeværelsen av normal stromal /fibroblast og inflammatoriske celler i kreft vevssnitt, selv om vi ikke kunne nekte muligheten for delvis metylering som MKN45 og MKN7 og tumor heterogenitet.
(A) Representative resultatene av nestet MSP analyse av
Twist1
i DGCs fra DCKO mus og et tilsvarende ikke-kreft mageslimhinnen (kolonne N). Regionene (E1-2) som ble analysert er vist i figur 2A. U: unmethylated allel; M: metylert allel. (B) Representant immunhistokjemisk farging av Twist1 protein i DGC vev fra DCKO mus. (I) Sterk nukleær farging av Twist1 protein i en GC uten metylering. (Ii) Negativ Twist1 protein uttrykk i en GC med metylering. Original forstørrelse, x400. (C) Sammendrag av
Twist1
metylering og uttrykk i grunnskolen DGCs.
Twist1
ble metylert i 9 av 18 GCer, som antydet ved M. Intensiteten av fargingen ble bedømt Twist1 som- (negativ), + (svak) og ++ (moderat til sterk). Mus GCer ble delt inn i to grupper, intramucosal og invasive GCer i henhold til kriteriene for menneskelig GC etablert av den japanske Gastric Cancer Association [53].
Twist1 protein uttrykk ble påvist i 7 av 18 (38,9%) GCer sammenlignet med tilsvarende ikke-kreft mage slimhinner ved immunhistokjemi. Representative bilder er vist i figur 3B. Vi videre analysert sammenhengen mellom
Twist1
uttrykk og metylering nivåer i disse tilfellene. Blant de 18 primære GC undersøkt, ni tilfeller viste sammenheng mellom
Twist1
metylering og uttrykk (Fig 3C). Tre av fire tilfeller med Twist1 svakt uttrykk utstilt sin metylering, muligens at lav uttrykk for Twist1 kan være forårsaket av sin metylering. Men de resterende fem tilfeller viste ingen metylering og uttrykk (tabell 1).
Histone metylering er knyttet til regulering av
Twist1
uttrykk
Vi neste undersøkt hvorvidt lysin metylering nivå av histon H3 bidrar til
Twist1
uttrykk. Kromatin immunoutfellingsstudier (chip) ble utført på den predikerte CpG shore (CP1.3k), promoter (CP1), og eksoner 1 (CE1-1 og CE1-2) og 2 (CE2) regioner (figur 2A). På CP1 og CE1-2 regioner ble aktiv histon mark H3K4me3 beriket i Twist1 uttrykk-positive celler (MDGC-7 og MDGC-9), men inaktive histon mark H3K9me3 ble beriket i Twist1 uttrykk-negative celler (MDGC-en og MDGC -3) (figur 4A og 4B). Chip-analyser viste både H3K4me3 og H3K9me3 signaler i MDGC-en og MDGC-3 celler med 5-aza-dC behandling, noe som indikerer forhøyede H3K4me3 nivåene i disse cellene (fig 4C). Tvert imot ble H3K27me3 og H3K36me2 nivåer ikke er korrelert med Twist1 ekspresjon i noen MDGC celler ble undersøkt i dette studiet. Som for menneske GC cellelinjer, en tilsvarende region ligger fra arrangøren til ekson 1 viste H3K4me3 berikelse i
Twist1
uttrykks-positive MKN45 celler, og H3K9me3 i
Twist1
uttrykk-negative KATO-III celler (fig 2C og 4D).
(A) Histone metylering status i Twist1 ekspresjons-positive celler (MDGC-7 og MDGC-9) og -negative cellene (MDGC-1 og MDGC-3). ChIP analysen ble utført ved bruk av H3K4me3, H3K9me3, H3K27me3 og H3K36me2 antistoffer. De fem Chip regioner (CP1.3k, CP1, CE1-1, CE1-2 og CE2) analysert er vist i figur 2A. Input-DNA-prøver ble anvendt som interne kontroller. (B) Semi-kvantitativ ChIP analyser av histone H3K4me3 og H3K9me3 berikelse. Chip intensiteter ble analysert ved hjelp av Image J 1.47v programvare, og deretter chip /Input ble beregnet. Aktiv histone mark H3K4me3 ble beriket i Twist1 uttrykk-positive celler, men inaktive histon mark H3K9me3 ble beriket i Twist1 uttrykk-negative celler. (C) Forhold mellom histon og CGI metylering i MDGC celler. MDGC-1 og MDGC-3-celler ble behandlet med 5-aza-dC, og den histon metylering status av deres H3K4me3 og H3K9me3 ble undersøkt av Chip-analyse. De H3K4me3 nivåene ble øket i disse 5-aza-dC-behandlede celler sammenlignet i ubehandlede kontroller (figur 4A), som vist med trekanter. (D) Semi-kvantitativ ChIP analyse av H3K4me og H3K9me3 i menneskelige GC-celler. Regionene (CP1, CE1-2) analysert er vist i figur 2C. I likhet med dataene for mus
Twist1 plakater (figur 4B), nivåene H3K4me3 og H3K9me3 ble beriket i MKN45 og KATO-III celler, henholdsvis. Den gjennomsnittlige (kolonne) ± SD (bar) for tre uavhengige agarosegel electrophorese i forskjellige eksperimenter indikeres (** P 0,01).
Suv39h1 Hotell og
Suv39h2
, en histon metyltransferase, regulerer H3K9me3
Det er mange histone metyltransferaser forbundet med H3K4, H3K9 og H3K27 [28]. Derfor, for å finne ut hvilke histone modifikasjon enzymer er ansvarlig for H3K4me3 eller H3K9me3 berikelse på
Twist1
ekson en region i GC-celler, vi undersøkt ti H3K4me3 (
Mll1
,
Mll2
,
Mll3
,
Mll4
,
Setd1a
,
Setd1b
,
Ash1
,
Ash1l
Smyd3 Hotell og
Meisetz
), syv H3K9me3 (
Suv39h1
,
Suv39h2
,
G9a
,
Setdb1
,
Clld8
,
Glp Hotell og
Riz1
), og en H3K27me3 (
Ezh2
) knyttet gener. Representative data er vist i figur 5A. Blant dem, uttrykket nivåer av
Suv39h1 Hotell og
Suv39h2
ble omvendt korrelert med
Twist1
uttrykk. Men uttrykket nivåer av resterende 16 histone methylatasferase gener ble undersøkt var ikke forbundet med
Twist1
uttrykk i MDGC celler. Vi utførte siRNA-basert knockdown av
Suv39h1
eller
Suv39h2
i de respektive uttrykk-positive MDGC-1 og MDGC-3 celler ved elektroporering (Fig 5B). Knockdown av
Suv39h1
eller
Suv39h2
i disse cellelinjene ført til en økning av
Twist1
uttrykk observerbar på RT-PCR (Fig 5B) og QRT-PCR (MDGC- 1, fig 5C).
(A) uttrykk for histone metyltransferaser for H3K4 (
Mll1
,
Mll2
,
Mll3
,
Mll4
,
Setd1a og Ash1l
), H3K9 (
Suv39h1
,
Suv39h2
,
G9a og Setdb1
), og H3K27 (
Ezh2
) ble bestemt ved RT-PCR. Uttrykket nivåer av
Suv39H1 Hotell og
Suv39H2
ble omvendt korrelert med
Twist1
uttrykk.
GAPDH
ble brukt som en intern kontroll. (B og C) Effekt av
Suv39h1
eller
Suv39h2
knockdown på
Twist1
uttrykk i MDGC celler. RT-PCR ble utført på MDGC-en og MDGC-3 celler med
Twist1
uttrykk etter transfeksjon av si
Suv39h1 plakater (sih1), si
Suv39h2 plakater (sih2) eller negativ kontroll (sinc) siRNA. (C)
Twist1
,
Suv39h1 Hotell og
Suv39h2
mRNA nivåer i MDGC-1 celler ble ytterligere bekreftet ved QRT-PCR. Søylene og barer indikerer gjennomsnitt og standardavvik, henholdsvis. ** P. 0,01
Association of SP1 med transcriptional regulering av
Twist1
Det er enighet 5 «- (G /T) GGGCGG (G /A) (G /A) (C /T) -3-sekvensen er kjent som den bindende motivet av transkripsjonsfaktor SP1, og et forhold mellom CGI metylering og Sp1 binding i promoteren er blitt rapportert [29, 30].
