Abstract
Bakgrunn
I analogi til vanlig stamcelle differensiering, den nåværende kreftstamcelle (CSC) modell forutsetter en hierarkisk organisasjon og en irreversibel differensiering i svulstvev. Følgelig cscs bør bestå av bare en liten del av tumorcellene, som mater tumorvekst. Men noen nyere funn reist tvil om den generelle anvendelsen av CSC modell og ba for sin eleganse.
metodikk /hovedfunnene
I denne studien har vi analysert CSC egenskaper brystkarsinomceller avledet fra transgene (WAP-T) mus. Vi etablerte et sterkt tumorigent WAP-T cellelinje (G-2-celler) som viser stilk-lignende egenskaper. G-2 celler, samt deres klonale derivater, er nært knyttet til primærsvulster om histologi og genuttrykk profiler, og reflektere heterogenitet om deres differensiering stater. G-2 kulturer omfatter cellepopulasjoner i forskjellige differensieringstilstander identifisert av co-uttrykk for cytoskeletal proteiner (cytokeratins og vimentin), en kombinasjon av celleoverflatemarkører og et sett av transkripsjonsfaktorer. Cellular undergrupper sortert etter uttrykk for CD24a, CD49f, CD61, EpCAM, Sca1, og Thy1 celleoverflateproteiner eller metabolske markører (f.eks ALDH aktivitet) er kompetente til å rekonstituere den første cellulære sammensetningen. Repopulation effektivitet varierer mellom de enkelte undergrupper og påvirkes av samhandling med de respektive utfyllende G-2 cellulære undergruppe. Balansen mellom differensiering stater reguleres delvis av transkripsjonsfaktoren Sox10, som utarming av Sox10 førte til oppregulering av Twist2 og økt andelen Thy1-uttrykke celler som representerer celler i en selv fornybar, reversibel, kvasi-mesenchymale differensiering state .
Konklusjon /Betydning
G-2 celler være en selvreproduserende kreftcelle system, vedlikeholdt av bi- og enveis konvertering av komplementære cellulære undergrupper. Vårt arbeid bidrar til dagens kontroversielle diskusjon om eksistensen og arten av CSC og gir grunnlag for innarbeiding av alternative hypoteser inn i CSC modell
Citation. Wegwitz F, Kluth MA, Manz C, Otto B, Gruner K, Heinlein C, et al. (2010) Svulst WAP-T Mouse brystkarsinomceller: En modell for en selvreproduserende homeostatiske Cancer Cell System. PLoS ONE 5 (8): e12103. doi: 10,1371 /journal.pone.0012103
Redaktør: Joseph Najbauer, City of Hope National Medical Center, USA
mottatt: 07.04.2010; Godkjent: 14 juli 2010; Publisert: 11 august 2010
Copyright: © 2010 Wegwitz et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Denne studien ble støttet med tilskudd fra Deutsche Forschungsgemeinschaft (de 212 /23-1-3 til WD og GT), Deutsche Krebshilfe (Forschungsverbund «Tumorstammzellen») til WD og GT, den VFK Krebsforschung gGmbH til WD og Fonds der Chemischen Industrie . Heinrich-Pette-instituttet er finansielt støttet av Freie und Hansestadt Hamburg og Bundesministerium für Gesundheit. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
definisjonen av Rollin Hotchkiss av levende materie «som repeterende produksjon av bestilte heterogenitet» er aktuelt for normal samt svulstvev [1]. Den cellulære heterogenitet observert i mange faste tumorer ved den funksjonelle og strukturelle nivå minner til den komplekse cellulære organisasjon av de respektive normale vev. Denne likheten av svulsten til normalt vev legitimerer den formelle anvendelsen av prinsipper og begreper i utviklingsbiologi til kreftforskning. Modellen av kreft stamceller (cscs) [2], [3] beskriver en svulst som et hierarkisk organisert system av stilk-lignende celler og deres avkom differensiert. Som postulert av CSC-modell, en liten undergruppe av celler som driver tumorvekst og er ansvarlig for tumor tilbakefall etter en tilsynelatende vellykket terapi. Disse tumorceller, referert til som cscs, tumor-initiere eller tumorigene celler, utmerker seg ved en kombinasjon av operasjonelt definert felles eller unike celleoverflatemarkører forbundet og evnen til å etablere sykdom i passende resipientmus [4]. I motsetning til den stokastiske modellen av klonal evolusjon, som tilskriver tumorcelle heterogenitet til genetiske forskjeller i tumorcelle bassenget [5], postulerer CSC modellen som epigenetiske snarere enn genetiske forskjeller skille tumorigen fra ikke-tumorigene celler, for derved å tilveiebringe en basis for de hierarkiske relasjonene i tumorcellepopulasjon [6].
Nyere funn som tumorigene celler kan utgjøre en betydelig andel av tumormassen [7] spørsmålstegn ved den strengt hierarkiske organiseringen av tumorvev [8], og heller argumentere for «fenotypisk plastisitet» av tumorceller [9], som opprettholdes av homeostatiske mekanismer [10]. Derfor trenger cscs ikke eksistere som en unik befolkningen definert av diskrete molekylære egenskaper, men snarere sammen med sin differensiert avkom være en selvreproduserende «stamcelle system» der den cellulære sammensetningen er regulert av omdannelse av ulike differensieringstilstander [9]. Svulster av epitelial opprinnelse (karsinomer) viser vanligvis høy histologisk heterogenitet reflekterer ulike differensierings tilstander av individuelle celler. Basert på tre kriterier fenotypiske – celle polarisasjonstilstander, celle samhørighet og ekspresjon mønster av cytoplasmatisk mellomliggende filament (CIF) proteiner – det har blitt foreslått for å definere fire fenotyper, som strekker seg fra rent epiteliale til helt mesenchymal [11]. Følgelig differensieringstilstanden av individuelle celler i karsinomer tilsvarer en epitelial, mesenchymal en og en mellomliggende fenotype. Disse differensieringstilstander kan videre deles inn i stabile og forbigående undertyper, som helt er satt sammen inn i en dynamisk «økosystem». Prosessen kalles epitel-mesenchymale overgang (EMT) og dens motstykke, kalt mesenchymale-epitel overgang (MET) [12], [13], beskriver omdanningen av motsatte differensiering stater. Disse overgangene har nylig blitt knyttet til celle stemness ved den observasjon at induksjon av EMT i humane bryst epitel-cellekultur modeller skaper et undersett av celler som sterkt anriket på cscs [14], [15]. Modellen som kommer ut fra disse studiene foreslår at det i karsinomer EMT og MET står for generering av et undersett av celler som er i balanse med det tumor epithelial rommet og er i stand til å regenerere hele tumorcellepopulasjon [9].
Transgene og knockout-mus gi syngene (eller congenic) modeller for CSC forskning, som de tillater å etablere kreftsykdommer i immunkompetente dyr som etterligner den tilsvarende menneskelig situasjon, og er en kilde til cellelinjer som muliggjør studier av CSC egenskaper. Imidlertid er egnetheten av musemodeller ofte begrenset av det faktum at virkningene av ekspresjon av et onkogen, eller tap av en tumor suppressor, er allerede utøvet på embryostadiet og i løpet av vev utvikling, mens det i de aller fleste humane cancere genetiske forandringer som fører til kreft vil forekomme i celler av voksent vev. WAP-T-transgene mus [16] – [19] har vist seg å være en nyttig modell for analyse av onkogen-induced mammary carcinogenesis i voksne mus. I kvinnelig WAP-T-mus aktivering av transgenet, simian virus 40 (SV40) tidlig-gen-regionen flankert av en ~1.4 kb oppstrøms region av genet som koder for det musemyse surt protein (WAP) [20], startes under sen graviditet i bryst epitel (ME) celler samstemmige med den endogene
Wap
genet [21]. Ekspresjon av SV40 tidlige gener som koder for stort T-antigen (LT) og små t-antigen (st) driver mammary carcinogenesis ved å etterligne en rekke genetiske endringer som vanligvis sees i humane brystcarcinomer, som opphør av pRB-kontrollerte G1-kontrollpunkt [ ,,,0],22], og inaktivering av p53 tumor suppressor [23]. Som en konsekvens av SV40 tidlig genekspresjon, parous WAP-T-mus utvikler multiple alveolære lesjoner – multifokale intraepitelial neoplasi (min). Noen av disse fokale lesjoner videre utvikle seg til invasiv, men sjelden metastatisk brystcarcinomer [19]. Morfologisk, svulstene utvikler seg i WAP-T mus er adenokarsinomer, alt fra en brønn til en dårlig differensiert fenotype [16]. Relevansen av denne modellen understrekes av det nære likhet i histologi av musesvulster med tilsvarende humane tumorer [19].
I denne studien spurte vi om WAP-T svulster er bedre beskrevet av den klassiske CSC modell eller av alternative hypoteser. Vi fant at tumorigene celler er forholdsvis hyppig i WAP-T-tumorer (opp til 1/10) og er i stand til å rekapitulere fenotypen til de respektive primære tumorer etter ortotopisk transplantasjon inn i syngeniske mus. For å studere deres tumorigene egenskaper i mer detalj, vi etablert fra en WAP-T tumor en cellelinje (G-2 celler). G-2 celler med høy effektivitet danner svulster i syngene mus som av genuttrykk og fenotypiske analyser er nært knyttet til primærsvulster. G-2 cellekulturer er kjennetegnet ved en basal /luminal genekspresjon signatur, heterogenitet av differensieringstilstander og tilstedeværelsen av komplementære cellulære undersett som kan separeres i henhold til forskjeller i ekspresjon av visse stemness-relaterte celleoverflatemarkører. Vi viser at strengt FACS-adskilte delmengder av G-2 celler er kompetente til å rekonstituere det opprinnelige cellulære sammensetning av cellekulturen når individuelt dyrket. Våre data argumentere for en selvreproduserende homeostatic «kreftcelle system», der balansen er avhengig av omdannelse av de komplementære cellulære undergrupper, deres interaksjoner og transkripsjonen kompetanse. Til støtte for EMT-CSC modell [9], vi identifisert i G-2 kultur en selvfornyende populasjon av celler preget av uttrykk for Thy1 og vise spontan reversibilitet av en kvasi-mesenchymale differensiering tilstand.
resultatene
WAP-T tumorer inneholde en høy andel av tumorigene celler
et avgjørende kriterium for cscs er deres evne til å initiere tumorvekst etter transplantasjon i hensiktsmessige resipientmus og å rekapitulere fenotypen av den opprinnelige svulst. Orthotopic transplantasjon av serielt utvannet WAP-T tumorceller viste at så lite som 10
2 celler fra godt til moderat differensierte (lavgradig) svulster, og så lavt som 10
1 celler fra dårlig differensiert (høyverdig ) svulster var i stand til å indusere brystcarcinomer i syngene mus (figur 1A). Transplanterte svulster vanligvis reflekterte fenotype av foreldre tumorer (Figur 1b). Men transplantasjon av celler fra en lavgradig tumor noen ganger også ga opphav til høyverdig svulster. Som pauci-klonalitet av WAP-T svulster er tidvis observert [17], den utvekst av celler fra en høyverdig tumor celle bassenget kan ikke utelukkes.
(A) Celler fra høyverdig WAP-T svulster er mer tumorigent enn celler fra lavgradige svulster. Serielt fortynnet (10
1, 10
2, 10
3, 10
4) nylig isolerte WAP-T-tumorceller ble injisert inn i den venstre abdominale melkekjertlene som beskrevet i Materialer og Metoder. (B) H E farging av lav grad og høy klasse, henholdsvis WAP-T primære og deres tilsvarende transplantert tumor. De transplanterte svulster vokste etter injeksjon av 10
4 eller 10
2 celler, henholdsvis fra svulster lavgradig og høyverdig. Skala:. 100 mikrometer
Karakterisering av G-2 celler og deres klonale derivater
For å unngå komplikasjoner forbundet med analyse av primærtumorceller, vi etablert en cellelinje fra en WAP-T tumor (G-2 celler) som ville tillate analyse av brysttumor initiere og stamcelleegenskaper under
in vitro Hotell og
in vivo
innstillinger (se Materialer og metoder for detaljer) .
a)
In vitro
.
fra de første passasjer G-2 cellekulturer viste en homogen vekstmønster, kjennetegnet av tettpakkede kolonier innebygd i brostein lignende områdene (Figur 2A). I påfølgende passeringer G-2-celler bevart evnen til å danne flere cellegrupper og tre-dimensjonalt ekspanderende kolonier, men fått en mer fibroblastisk lignende morfologi (figur 2B, C). G-2-celler utviser stabil, selv om heterogene ekspresjon av SV40-LT, som i kompleks med endogent villtype p53 akkumulert i kjernene i de fleste celler (figur 2D), for derved å reflektere SV40-LT-ekspresjon
in vivo
. Uttrykk for SV40-LT korrelerer med endogen
Wap
genaktivitet (figur 2E), noe som indikerer at regulatorer ansvarlige for transkripsjon av
Wap
genet er konstitutivt aktiv i G-2 celler. Til støtte, lentiviral transduksjon av G-2 celler med en GFP reporter konstruere under kontroll av en ~1.4 kb
Wap
promoter fragment viste at selv etter 2 uker i kultur en stor bestand av FACS-beriket EGFP
+ – cellene forble EGFP-positive (figur 2F). Disse cellene tidvis dannet tette områder med høyt EGFP uttrykker cellene.
(A-C) Fase kontrast av G-2 celler i en tidlig (P9) og senere (p29) passasje. (D) Confocal bilde av G-2 celler farget med anti-SV40-LT (grønn) og anti-p53 (røde) antistoffer. Bilder ble slått sammen med en differensial interferens kontrast (DIC) mikrograf. (E) Confocal bilde av G-2 celler farget med anti-WAP (grønn) antistoff. Cellekjernene ble visualisert ved farging DRAQ5 (blå). (F) Levende celler fluorescens bilde av G-2 celler etter lentiviral transduksjon med en EGFP reporter konstruere under kontroll av
Wap
-promoter. FACS-anrikede EGFP
+ – celler ble holdt i kultur i 2 uker. (G og H) Keratin 14 (rød) og keratin 18 (grønn) farging av dyrkede G-2 celler. Cellekjernene ble visualisert ved farging DAPI (blå). (I) FACS-basert kvantifisering av keratin 18 uttrykk i G-2 celler ved passering 20. (J og K) vimentin (grønn) og SV40-LT (rød) /keratin 18 (rød) co-farging av kultivert G-2 cellene ved passasje 10. piler markere G-2 celler uten påvisbar SV40-LT uttrykk. Cellekjernene ble visualisert ved farging DAPI (blå). (L) FACS-basert kvantifisering av vimentin uttrykk i G-2 celler ved passering 20. Scale barer: A: 150 mikrometer; B og C: 200 um; D og E: 20 um; F, G, H og J: 100 um; K:. 50 pm
Siden konstituerende
Wap
genaktivitet har vært knyttet til begått bipotent alveolære forfedre og CD61
+ luminal-begrenset stamfedre, som er presumptivt mål av onkogen aktivitet [24], utførte vi en celle avstamning analyse av immunfluorescens (IF) farging for luminal epitelceller markør keratin 18 (Krt18), basal /korgcellemarkører keratin 5 (Krt5) og keratin 14 (Krt14). I tidlige passasjer flertallet av G-2-celler uttrykte både Krt14 (figur 2G) og Krt18 mellomliggende filamentproteiner (figur 2H); imidlertid den vanlige ko-polymerisering partner av Krt14, den Krt5 protein, var ikke påvisbart ved et spesifikt antistoff (data ikke vist). I etterfølgende passasjer små variasjoner i de enkelte ekspresjonsnivåer av Krt14 og Krt18 (data ikke vist), og ble det observert en betydelig svingning i antall cytokeratin-uttrykkende celler som strekker seg fra 40 til 70%. Fig 2I viser som et eksempel den FACS-baserte kvantifisering av Krt18 ekspresjon i G-2-celler ved passasje 20, som indikerer overgang mot en mesenchymale differensiering tilstand. Derfor uttrykk for den mellomliggende filament protein vimentin ble analysert som en mye brukt markør for mesenchymale celler og carcinoma celler som gjennomgår overgangen mellom epitel og mesenchymale differensiering tilstander [25], [26]. Uavhengig av passasje antall nesten alle G-2 celler uttrykker vimentin, der intensiteten av vimentin uttrykk spenner fra en diffus cytoplasma distribusjon og svake trådformede strukturer til et rikt trådformede nettverk (figur 2J-K viser vimentin /SV40-LT og vimentin /Krt18 co -staining ved passering 10). Figur 2L viser som et eksempel den FACS-baserte kvantifisering av vimentin ekspresjon i G-2-celler ved passasje 20. SV40-LT-ekspresjon ble påvist nesten alltid også i celler som uttrykker sterkt vimentin (figur 2J). Men få celler mangler SV40-LT var alltid til stede i G-2 kulturer (figur 2J, merket med piler). I sammendrag, ved farging analyse vi har observert for det første at de fleste G-2 celler utmerker seg ved en differensieringstilstand som er kjennetegnet ved ko-ekspresjon av vimentin og cytokeratins, for det andre at det antall celler blottet for cytokeratins svinger mellom passasjene, og for det tredje at en mindre populasjon av celler som uttrykker cytokeratins men helt mangler vimentin er alltid til stede.
slik heterogenitet i differensieringstilstander kan gjenspeile en multiclonal opphav til G-2 cellekulturer, da denne kulturen ble avledet fra en hel tumor. For å løse denne muligheten, ble G-2-celler klonet i myk agar, og ti kolonier ble ekspandert inn i stabile cellelinjer. Som visualisert ved hjelp av IF-farging, ble G-2 celle mønster av cytokeratin ekspresjon gjengitt i G-2 celle-avledede kloner (figur S1A-B, vist som eksempel for kloner G-2C9 og G-2C11), selv om det ifølge qPCR-analyse de relative nivåer av
Krt14 Hotell og
Krt18
genuttrykk stor variasjon mellom kloner (figur S1C-D). Også i de sekundære kloner, avledet av agar kloning fra G-2C9 og G-2C11 kloner, en 2-3 ganger variasjon i transkripsjon av
Krt14 Hotell og
Krt18
gener kunne bli demonstrert ( Figur S1E-F). Ligner på foreldrenes kultur, var heterogene uttrykk for vimentin observert i G-2 cellekloner (Figur S1G). Derfor konkluderer vi at tilstedeværelsen av cellepopulasjoner i epiteliale, mesenchymale og mellom differensiering stater er en iboende egenskap ved G-2 kulturer.
b)
In vivo
.
Vi testet svulsten initiere potensialet i G-2 celler ved orthotopic transplantasjon inn i venstre abdominal melkekjertlene av førstegangsfødende WAP-T mottaker mus. 10
6 G-2 celler raskt dannet palpable tumorer (høyverdig adenokarsinomer) i alle mottaker mus (tabell 1). Jo færre celler vi transplantert, jo lenger var forsinkelsen perioden og jo høyere dens variasjon (tabell 1). Selv fra 10 injisert G-2-celler i 10 ut av 12 resipientmus tumorutvekst ble påvist (tabell 1), noe som indikerer en høy frekvens av tumorigene celler i G-2 kulturen. Farging analyse av vimentin og Krt8 /18 uttrykk i G-2 celle avledet svulster (figur 3A) avslørte sin nære likhet med dårlig differensiert (grad G3) WAP-T tumorer (Figur 3B). Mens i lavgradig WAP-T svulster vimentin farging ble stort sett begrenset til septa og stromal rommet (figur 3C), variabel uttrykk for vimentin var også påvises i epitel rommet (representert ved Krt8 /18) i høyverdig WAP-T tumorer (figur 3B), noe som indikerer en mellom differensiering tilstand av tumorceller i G-2 avledet og WAP-T svulster høyverdig og en epitelial differensiering tilstand av tumorceller i WAP-T svulster lav grad. Co-farging for vimentin og SV40-LT (ekspresjon av SV40-LT er begrenset til tumorceller) gjør det mulig å skille mellom stromale mesenchymale celler som rekrutteres inn i tumorer og tumorceller som uttrykker et mesenchymale eller en mellomliggende fenotype. I transplantert G-2 tumorer (figur 4A) og WAP-T tumorer høy grad (figur 4b) observerte vi i tillegg til den forventede ekspresjon av vimentin i stromal rommet også ko-ekspresjon av vimentin og SV40-LT i individuelle tumor celler. I motsetning til WAP-T svulster lavgradige (figur 4C) vimentin og SV40-LT uttrykk er begrenset til stromal og tumor epitelceller avdelinger, henholdsvis. Svulster vokst fra transplanterte G-2 celler (figur 5A) rekapitulert de karakteristiske trekk ved WAP-T svulster høy grad (figur 5B), nemlig en moderat andel av celler co-uttrykker Krt14 og Krt8 /18. I motsetning til dette, i WAP-T tumorer lav grad Krt8 /Krt18 og Krt14 er ofte co-uttrykte (figur 5C).
(A-C) Representative konfokale bilder av tumor-frysesnitt av et G-2 cell avledede tumor (A), og en høy grad (B) og en lav grad (C) endogen WAP-T svulst farget med anti-vimentin (grønn) og anti-keratin 8/18 (rød) antistoffer. Kjernene ble farget med DRAQ5 (blå). Kraft innfellinger brukes til å vise co-uttrykk for vimentin og keratin 8/18 i G-2 og WAP-T svulster høyverdig. De hvite stiplede linjene markerer stromale strukturer. De confocal 3D-stabler ble deconvoluted hjelp Huygens Essential og rekonstruert med Imaris programvare. Skala: Hovedbildet: 30 mikrometer; forstørrelse: 3 mikrometer
(A-C) Representative confocal bilder av tumor-frysesnitt av en G-2 cell-avledet tumor (A), et høyverdig (B) og en lav. klasse (C) endogen WAP-T tumor farget med anti-vimentin (grønn) og anti-SV40-LT (røde) antistoffer. Kjernene ble farget med DRAQ5 (blå). Kraft innfellinger brukes til å vise co-uttrykk for vimentin og SV40-LT i G-2 og WAP-T svulster høyverdig. De hvite stiplede linjene markerer stromale strukturer. De confocal 3D-stabler ble deconvoluted hjelp Huygens Essential og rekonstruert med Imaris programvare. Skala: Hovedbildet: 50 mikrometer; forstørrelse: 6 mikrometer
(A-C) Representative confocal bilder av tumor-frysesnitt av en G-2 cell-avledet tumor (A), et høyverdig (B) og en lav. klasse (C) endogen WAP-T tumor farget med anti-keratin 8/18 (grønn) og anti-keratin 14 (rød) antistoffer. Kjernene ble farget med DRAQ5 (blå). Kraft innfellinger brukes til å vise co-uttrykk for keratin 8/18 og keratin 14 i G-2, høyverdig og WAP-T svulster lav grad. De confocal 3D-stabler ble deconvoluted hjelp Huygens Essential og rekonstruert med Imaris programvare. Skala: Hovedbildet: 50 mikrometer; forstørrelse. 6 mikrometer
I et eksperiment ble 10
6 G-2 celler transplantert inn i kjepphest pads av to ikke-transgene BALB /c mus. I begge musene store, solide tumorer vokste etter 4-6 uker. Interessant, tumorcellene var stort sett fri for epiteliale markører, EpCAM (figur S2A) og cytokeratins (fig S2B, d), men sterkt uttrykt vimentin (figur S2B, C), som indikerer at i ikke-transgene mus overgang inn i den mesenchymale tilstand er favorisert, muligens som en konsekvens av en interaksjon med vertens immunsystem. Som kreftceller fortsetter å uttrykke WAP-promoter drevet SV40-LT (figur S2C), er det sannsynlig at mesenchymale differensiering i disse cellene var ufullstendig.
c) Gene uttrykk profilering.
histomorphological likhet mellom G-2 celle transplantert og WAP-T-tumorer indikerer at disse tumorer kan også være nært beslektet på molekylært nivå. Basert på sammenlignbare uttrykk for CIF proteiner, vi også forventet en nær sammenheng mellom G-2 celler i kultur og i G-2 svulster. For å teste disse forutsetningene, utførte vi mikromatriser uttrykk profilering. Total RNA fra G-2, G-2C9 og G-2C11-celler, fra to G-2 transplanterte tumorer, så vel som fra fire WAP-T-NP8 tumorer som representerer fire histologiske karakterer (G1-G4) ble analysert på Affymetrix microarray plattform (MOE430 2.0). Søknad som vesentlige kriterier den korr. P-verdi (Benjamini-Hochberg) = 0,05, og en fold endring-cutoff tre identifiserte vi 250 gener som var forskjellig uttrykt mellom cellekultur og tumorprøver (tabell S1). Stramme statistiske kriterier til en korr. P-verdi = 0,01, bare 24 gener oppfylte disse strenge kriterier. De 250 differensielt uttrykte gener ble videre analysert ved EXPANDER program for å identifisere over-representert GO (genet ontologi) kategorier og TF (transkripsjonsfaktor) bindingsseter i sine
cis
regulatoriske regioner [27]. GO-berikelse analyse ble kombinert med hierarkisk clustering, og resultatene er presentert i varmen kartet vist i figur 6A. Et betydelig antall differensielt uttrykte gener faller inn i kategorien av immunforsvarsgener, som gjenspeiler det faktum at svulster inneholde en viss kontingent av immunceller, som mangler i cellekultur. Anriking av gener relatert til immunprosessene korrelerer godt med den overrepresentasjon av bindingsseter for Elf1, en transkripsjonsfaktor sterkt uttrykt i lymfoide celler [28], i promotorområdene til de differensielt uttrykte gener (P-verdi 0,001) . På den annen side er de cellekulturprøver utmerker seg ved en høyere ekspresjon av gener assosiert med transkripsjonsregulering, f.eks
Foxa2
,
Foxm1
,
Gata6
,
Hoxb2
,
Jmjd2c
,
Ppargc1a
, og
Tle1
og utviklingsprosesser, f.eks
Bmp4
som er involvert i differensiering av mesenchymale celler. Denne observasjon kan forklares ved tilpasning av den transkripsjonelle nettverk og av signalveier til celledyrkningsforhold. Til sammen genuttrykket analyse viste at G-2 celler og svulster vise flere likheter enn forskjeller i genuttrykk program; forskjellene er i hovedsak relatert til deres ulike biologiske sammenheng.
(A) 250 gener forskjellig uttrykt i dyrkede G-2 celler og endogent WAP-T eller G-2 celle avledet tumorer (Tabell S1) ble brukt til å generere et varmekart. Beriket GO kategorier er vist som søylediagrammene som tilsvarer høyere eller lavere uttrykt gensamlingene i de respektive utvalgsgruppe. Fargekoding og høyden på en bar representerer statistisk signifikans (-log
10 (p-verdi)) av den observerte anrikning av de respektive GO kategorier. (B) Gener karakteristiske for luminal-ER
+, luminal-ER
– og basal /korgcellene ble brukt til å generere varme kart. Genuttrykk data innhentet for cellekultur (G-2, G-2C9 og G-2C11 celler) og tumorprøver (to G-2 transplanterte svulster og fire WAP-T-NP8 svulster som representerer fire histologiske karakterer) ble brukt for denne analysen. Genuttrykk intensiteter av en melkekjertlene av en parous BALB /c-mus (50 dager etter avvenning) ble anvendt som en referanse. Prominente gensamlingene (
Krt14
,
Vim
,
Krt5
,
Krt18
, og
Esr1
) er markert med gule bokser . Uttrykket verdiene er fargekodet: rød – høy uttrykk, blå – lav uttrykk
Vi regnet med at analyse av genuttrykk skal bidra til å finne G-2 celler innenfor melke epitelceller hierarki.. Ved hjelp av en liste av gener karakteristisk av luminal-ER
+, luminal-ER
– og basal /korgcellene [29] (tabell S1), og genuttrykket profil av melkekjertlene av en parous BALB /c mus (50 dager etter avvenning) som en referanse, hierarkisk klyngeanalyse avslørte igjen likheten mellom cellekultur og tumorprøver (figur 6B). Videre er en kompleks transkripsjonen program bestående av mange gener fra alle de tre linjene ble klart. Spesielt,
Esr1 plakater (som koder for østrogen reseptor alfa) er inne i en klynge av nedregulert «luminal-ER
+» gener,
Vim plakater (koding for vimentin) i klyngen av ikke-regulerte gener,
Krt14
ligger i klyngen av oppregulert «basale» gener, mens
Krt5
sammen med en rekke andre gener danner en klynge av nedregulert » basal «gener, i samsvar med fravær av Krt5 uttrykk i G-2 cellekulturer og den sjeldne forekomsten av Krt5-postive celler i WAP-T svulster (data ikke vist). Basert på denne analysen, konkluderer vi at G-2 cell transkriptomet sannsynlig er knyttet til celler forpliktet til luminal-ER
– differensiering. Disse cellene kan være stamfedre luminal-ER
– celler, som i løpet engasjement mistet uttrykk for fremtredende markører, som
Esr1 Hotell og
Krt5 Anmeldelser – gener funksjonelt knyttet til luminal-ER
+ og basalcelle linjene, og ble udødeliggjort av SV40 proteiner. Men endelig avklaring av sin identitet krever videre studier.
Stemness av G-2 celler og deres klonale derivater
Den høye tumorigent potensialet i G-2 celler bedt oss å studere deres CSC eiendommer i mer informasjon. Vi utførte en rekke standard analyser for å måle ekspresjonen av et sett av celleoverflatemarkører, selvfornyelse, og generering av fenotypisk forskjellig avkom (kollektivt betegnet repopulation aktivitet), aktivitet av aldehyd-dehydrogenase, og kolonidannende potensiale.
a) Cell overflatemarkører.
uttrykk for visse celleoverflaten assosierte proteiner, som inte og GPI-forankrede proteiner, er diagnostisk for normale bryst stamceller og brystkreft stamceller. Ved FACS vi iakttatt at nesten alle G-2-celler uttrykker stemness relaterte markører CD29 (integrin beta 1) [30] (figur 7A) og CD44 (reseptor hyaluronat) [31] (figur 7B). En stor fraksjon av G-2 celler er positive for EpCAM (epitelisk celleadhesjonsmolekyl) [31], [32] (figur 7C, venstre), som er ko-uttrykt med CD24a og CD49f (integrin a-6) proteiner [30] , [33] – [35] (figur 7C, til høyre). En annen bryst progenitor-assosiert markør, CD61 (integrin beta 3) [36], ble detektert på en stor fraksjon av G-2 celler (figur 7D, til venstre), og er også ko-uttrykkes med CD24a og CD49f (figur 7D, høyre) . Derfor har vi samlet betegnet brøkdel av G-2 celler co-uttrykker disse cellemembran assosierte proteiner som CD24a
høy undergruppe. Variasjoner som strekker seg fra ~ 30% til ~90% i det absolutte antall av celler i denne undergruppen ble oppdaget mellom paren G-2-celler og kloner (data ikke vist). Deretter observerte vi at motstykket til CD24a
høy undergruppe (figur 7E, til venstre) er preget av uttrykk for stamcelleforskningen markør Sca1 [37] (figur 7E, høyre). Til sammen omfatter G-2 kultur to store distinkte undergrupper, CD24a
høy /Sca1
lav og CD24a
lav /Sca1
høy. SV40 transgenet er like transkribert i begge undergrupper, men transkripsjon av Krt14 og Krt18 gener er høyere i CD24a
høy /Sca1
lave celler (figur S3A, B). Vi har også observert av qPCR analyse at
Cd24a
,
Cd49f Hotell og
Sca1
gener transkriberes i begge undergrupper (figur S3C).
(A, B) Representative FACS dot plott som viser ekspresjon av CD29 (A) og CD44 (B) i G-2 dyrkede celler. (C) Representative FACS dot plott som viser ekspresjonen av EpCAM (C, til venstre) i dyrkede G-2-celler og fordelingen av CD24a og CD49f (C, til høyre) i EpCAM
høy cellepopulasjon.
