Abstract
K-Ras avhengige ikke-småcellet lungekreft (NSCLC) celler er «avhengige» til basal autofagi som omprogrammerer cellenes stoffskifte i en lysosomal-sensitiv måte. Her viser vi at xenophagy-assosiert kinase TBK1 driver basal autofagi, i samsvar med sin kjente krav i K-Ras-avhengig NSCLC spredning. Videre er basal autofagi i denne sammenheng preget av deponering av xenophagy last reseptoren Ndp52 og dens paralogue Tax1bp1, som vi viser her til å være en
bona fide
last reseptoren. Autophagy av disse laste reseptorene fremmer ikke-kanoniske NF-kB signalering. Vi foreslår at dette TBK1 avhengig mekanisme for NF-kB signalering bidrar til autofagi avhengighet i K-Ras drevet NSCLC
Citation. Newman AC, Scholefield CL, Kemp AJ, Newman M, McIver EG, Kamal A, et al. (2012) TBK1 Kinase Addiction i lungekreftceller medieres via Autophagy av Tax1bp1 /Ndp52 og ikke-Canonical NF-kB Signale. PLoS ONE 7 (11): e50672. doi: 10,1371 /journal.pone.0050672
Redaktør: Edward Harhaj, Johns Hopkins School of Medicine, USA
mottatt: 26. juli 2012; Akseptert: 23. oktober 2012; Publisert: 29.11.2012
Copyright: © 2012 Newman et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Arbeidet i SW laboratoriet ble finansiert av en Cancer Research UK Karriereutvikling Fellowship (C20685 /A12825) holdt av SW. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:. Ahmad Kamal, Ed McIver og Michelle Newman er ansatte i Medical Research Council Technology, Lynton hus, 7-12 Tavistock Square, London WC1H 9LT, UK. Medical Research Council Technology eier en patentsøknad (PCT ingen WO2010100431) på TBK1 hemmere inkludert MRT68601. Disse forfatterne kan derfor få økonomiske fordeler fra noen framtidig utnyttelse av dette patentet. Dette endrer ikke forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikk på deling av data og materialer.
Innledning
En strategi for å målrette tumorprogresjon er å identifisere spesifikke molekylære sårbarheter er tillagt av genetisk bakgrunn. Aktivering av K-Ras ved mutasjon, eller på annen måte, gjør ikke-småcellet lungekreft (NSCLC) -celler «avhengige» av tilstedeværelsen av TBK1 (TANK bindende kinase 1) proteinet for videre proliferasjon og /eller overlevelse [1], eventuelt via direkte stimulering av TBK1 aktivitet [2]. TBK1 og dens paralogue, IKKε, sammen med veldefinerte IKKα og IKKβ proteiner, utgjør en underfamilie av serin-treonin proteinkinaser [3]. TBK1 og IKKε ble opprinnelig beskrevet som medierer NF-kB-aktivering transkripsjonsfaktor [4], [5], [6]. Det er også blitt foreslått at konstitutiv fremming av NF-kB signalering i NSCLC-celler, nedstrøms av K-Ras, kan ligge til grunn for TBK1 «avhengighet» [1]. Faktisk har genekspresjon profilering vist at en K-Ras drevet, er NF-kB-lignende signatur avhengig av TBK1-genet [1]. Imidlertid har mekanistisk bevis for TBK1-mediert NF-kB engasjement i kreft vært sparsom. Alternative forklaringer på TBK1 avhengighet har blitt foreslått, slik som direkte aktivering av pro-overlevelse Akt kinase signal [7], [8]. Men det er ingen individuell bidrag TBK1 nødvendigvis gjensidig utelukkende med andre.
En annen vei engasjert nedstrøms for K-Ras aktivering er macroautophagy (heretter autofagi) [9], [10], [11]. Autophagy er en multistep lysosomal degradering prosessen [12]. I de tidlige stadier, avhengig av handlingen av kjerne autofagi gener som
ATG5 Hotell og
ULK1
, doble membraned vesikler dekorert med ubiquitin-lignende proteiner av LC3 /GABARAP familie, kalt autophagosomes, begynner å dannes. Disse gryende autophagosomes vedlegge rundt, og Sequester, cytosol som de forfaller. Avhengig av sammenhengen, kan dette være en ikke-selektiv eller selektiv prosess, idet sistnevnte omfatter lagring av adskilte populasjoner, eller «last», av organeller, proteiner eller andre strukturer, så som bakterier i tilfelle av «xenophagy «. Selektivitet medieres via laste reseptorer som lenker LC3 /GABARAP proteiner til lasten, i antatt multi-molekylære komplekser [12]. Autofagi virkninger på cellen skjebne med både denne selektive deponering av frakte komplekser fra cytosol og via påfølgende lysosomal degradering av innholdet i autophagosome, noe som frigjør metabolitter i cytosol. Dette sistnevnte trinn blir inhibert av lysosomotrophic medikamenter slik som kloroquin. Slike forbindelser er en potensiell klasse av midler for terapeutisk manipulering av autofagi [11], [13].
Rollen autofagi i akutt reaksjon på Ras mutasjon er uklart. Det har vist seg å fungere som en effektor for å overleve, celledød eller senescens [9], [14], [15]. Imidlertid er kontinuerlig basal autofagi entydig nødvendig for proliferasjon og /eller overlevelse av etablerte K-Ras-drevne kreftceller [10], [11], [13]. En rolle autofagi her er direkte regulering av cellenes stoffskifte, via mitokondrie likevekttilstand, protein kvalitetskontroll og /eller ombygging av mobilnettet metabolitten bassenget. Kumulativt, disse mekanismene regulere balansen mellom oksidativ fosforylering og aerob glykolyse [10], [11], [13]. Noen av disse mekanismene er avhengig av lysosomal degradering, slik som vist ved følsomheten av metabolske effekter til lysosomotrophic midler så som klorokin. Men det har ikke vært adressert hvordan autofagi er engasjert nedstrøms K-Ras. Dessuten er det ikke klart om autofagi «avhengighet» kan forklares kun ved direkte metabolske effekter eller hvis lagring av spesifikke proteiner modulerer celle skjebne, via endring av signaloverføring i cellen.
Interessant nok TBK1 har vært implisert i autofagi av cytosoliske
Salmonella spp.
bakterier fra innenfor celler [16]. De nye TBK1-bindende protein og xenophagy last reseptor, Ndp52, gjenkjenner ubiquitinmolekyler, på overflaten av bakterier, og karbohydrat-bindende proteiner på brutte verts vesikler [17], [18]. En ikke-redundante trinnet i denne reaksjonsveien er nylig blitt vist å være den TBK1-mediert fosforylering av en ytterligere ny last reseptor, Optineurin [16]. Relevansen av TBK1 signale utenfor xenophagy er uklart. Men vi viser her at basal autofagi, med noen paralleller til xenophagy og resulterer i omsetningen av frakte reseptorer som Ndp52 og Paraloge protein Tax1bp1 er konstitutivt engasjert i TBK1-avhengige NSCLC celler av kinase aktivitet TBK1. Vi viser en sentral rolle for denne autofagi i å drive ikke-kanoniske NF-kB signale formidlet via relB transkripsjonsfaktor. Vi foreslår at denne veien utfyller direkte metabolske mekanismer i bidraget fra basal autophagy å støtte spredning og /eller overlevelse hos NSCLC celler. Våre funn dermed utvide rolle autophagy avhengighet i K-Ras drevet kreft og vis mekanistisk samspill med TBK1-NF-kB veien.
Resultater
autofagi i K-Ras Dependent Lung Cancer Celler er Nedstrøms TBK1 kinase
for å undersøke hvilken rolle TBK1 i K-Ras drevet basal autofagi vi utviklet et NSCLC kultur modell i K-Ras «avhengige» A549 celler [1]. Vi fant at cytosol av disse inneholdt tallrike punctate strukturer som er merket med GFP-LC3B fusjonsprotein, men ikke med lipid-unconjugatable GFP-LC3BΔG- A (Fig. 1a). Overflod av GFP-LC3B puncta ble dramatisk forhøyet ved klorokin behandling (Fig. 1a). I henhold til metoden for feltet [19], og deretter tok vi disse LC3B puncta å representere en basal, steady-state nivå av autophagosomes. Disse autophagosomes var fraværende når RNAi ble brukt til å knockdown på autofagi gener
ATG5 Hotell og
ULK1 plakater (Fig. 1b-d). RNAi av
TBK1
produsert tilsvarende effekter, posisjonering dette kinase oppstrøms basal autophagosome overflod (Fig. 1b-d). Vi utvidet disse funnene ved hjelp autophagy magnetfelt-analyser i kombinasjon med et medlem av et nylig beskrevet familie av enzymatiske inhibitorer av TBK1 (MRT68601, heretter referert til som TBKi, fig. S1) [20]. Hemmer behandling av A549 tandem-fluorescerende LC3B celler [21] resulterte i reduksjon av både tidlig autophagic ( «grønn + rød «) LC3B puncta og sure sene autophagosomes (» rød «puncta) (fig. 1e, f). Tilsvarende ble klorokin-mediert akkumulering av lipidert LC3B-II eller GABARAP-II, i form av disse proteinene korrelerte med dannelse av autophagosomes, hindres ved inhibitor behandling (fig. 1 g). Samlet utgjør disse dataene viser at TBK1 kinase faktisk fremmer autofagi, som skuespiller i en tidlig trinn i autophagosome formasjon, i stedet for å undertrykke autophagosome modning i det lysosomale sure rommet [19].
A549 GFP-LC3B eller GFP-LC3BΔG – A-celler ble behandlet med PBS eller 5 uM klorokin (CQ) i 8 timer, og cellene avbildes for GFP. b, c) A549 GFP-LC3B-celler ble transfektert med indikert siRNA i 72 timer (
NTC
= ikke-målsøkende kontroll) og b) celleekstrakter blottet for angitte proteiner (α-kar = α-tubulin) eller celler var c) avbildes for GFP-LC3B puncta. d) A549 FLAG-HA-LC3B-celler ble transfektert med angitte siRNA og HA-positive puncta immunfarget, fotografert og telles etter 72 h (n = 3, ± S.E.M., * = p 0,05, ** = p 0,01). e, f) A549 tandem-fluorescerende-LC3B (tfLC3B) celler ble behandlet med DMSO eller 1 uM MRT68601 (TBKi) i 24 timer, og e) avbildes og f) kvantifisert for totalt antall autophagic puncta (grønn + rød) og delmengden av disse puncta med målbart signal GFP (red), som beskrevet i detalj i Materialer og Metoder. g) A549-celler ble behandlet med DMSO eller 10 uM MRT68601 (TBKi) i 24 timer i nærvær eller fravær av PBS eller 5 um (CQ) klorokin og celleekstrakter blottet for angitte proteiner. Skala barer = 50 mikrometer i alle paneler.
Basal Autophagy Målsettinger Cargo reseptorer Ndp52 og Tax1bp1
Bakteriell autofagi (xenophagy) medieres via TBK1 og dets bindingspartnere, den xenophagy last reseptorer Ndp52 og Optineurin [16], [18]. I en parallell til dette, fant vi rekruttering av Ndp52, og Ndp52 paralogue Tax1bp1, til basal autophagosomes i A549 celler (fig. 2a, c). Vi har også vist en konstituerende Ndp52-TBK1 kompleks og bekreftet en tidligere rapport som Tax1bp1 kunne binde TBK1 [22] (Fig. S2A, b). Disse dataene antyder at Ndp52 og Tax1bp1 kan være målrettet for beslaglegging av basal autophagy. Følgelig, klorokin behandling stabilisert Tax1bp1 lik en positiv kontroll, p62 last-reseptoren (fig. 2b), og samtidig med øket Tax1bp1 lokalisering til LC3B-positive vesikler (Fig. 2c). Ubiquitin-lignende proteiner i LC3 og GABARAP underfamilier er i stand til å binde Tax1bp1, med varierende affiniteter (Fig. 2d). Dette tyder på at Tax1bp1 er, som, Ndp52, en
bona fide
last reseptor protein. Ytterligere støtte for dette funnet kommer fra observasjonen at sletting av antatte LC3 /GABARAP familie bindende motiver i Tax1bp1 ablates lokalisering til autophagosomes (Fig. 2e). Disse motivene inkluderer både en «kanonisk» LIR (LC3-samspill region) motiv (W49, V50, G51, I52) og en «ikke-kanoniske LIR «motiv, sistnevnte utledes fra det nylig beskrevet for Ndp52 binding til LC3C (L141, V142, V143) [23] (fig. 2e, se også justeringer i fig. S2C). I samsvar med den rolle TBK1 i de ovenfor angitte fremgangsmåter, ble TBK1 protein også vist seg å lokalisere til basal autophagosomes (fig. 2f).
A549-GFP-LC3B-celler ble farget for Ndp52 og avbildes. b, c) A549-celler ble behandlet med PBS eller 5 uM klorokin (CQ) over natten og b) celleekstrakter blottet for angitte proteiner (α-kar = a-tubulin), eller c) celler ko-farget for Tax1bp1 og LC3B, og avbildes av konfokalmikroskopi. d) 293ft-celler ble transfektert med myc-TAX1BP1 ekspresjonsvektor, eller tom vektorkontroll, og lysater kastet pull-down med angitte fusjonsprotein, som beskrevet i materialer og metoder (- = GST bare, B = GST-LC3B, C = GST-LC3C, G = GST-GABARAP). e) A549 FLAG-HA-TAX1BP1 cellelinjer som stabilt uttrykker de angitte varianter av Tax1bp1 protein (se tekst) ble behandlet med 5 mikrometer klorokin natten og farget for HA puncta. f) A549 GFP-TBK1 mCherry-LC3C celler ble fotografert (piler indikerer colocalisation). Skala barer = 25 mikrometer i alle paneler.
TBK1 Kjører ikke-kanoniske NF-kB Signale av autophagic Sequestration av Ndp52 og Tax1bp1
neste hypotese en kobling mellom TBK1 drevet autofagi og basal NF-kB signalering. Nukleær lokalisering av kanoniske NF-kB pathway subenheter c-Rel eller Rela var ikke påvisbar i A549-cellelinjen (p53 vill-type), men basal nukleær lokalisering av den ikke-kanonisk veien subenheten relB var påvisbar (fig. S3). RelB nukleære lokaliserings var avhengig TBK1 kinase-aktivitet som vist ved tap av nukleær relB flekk (fig. 3a, b) eller tap av oppholds i det nukleære fraksjon (fig. 3c) ved behandling med TBK1 inhibitor. Tax1bp1 har tidligere blitt vist å inhibere kanonisk NF-kB signalering ved kjernedannelse fra en ubiquitin redigering kompleks for kanoniske NF-kB regulatorer TRAF6 og RIP1 [24]. Imidlertid har motstridende rapporter vist en NF-kB potensierende virkning, om enn nedstrøms av feilregulering av Tax1bp1 funksjon av det virale oncoproteinet Tax [25]. Vi fant at RNAi av
ATG5
,
ULK1
,
TBK1, TAX1BP1
eller
NDP52
hemmet relB kjernefysiske lokalisering (Fig. 3d-f), innebærer at en nedstrøms konsekvens av Tax1bp1 og Ndp52 deponering av autofagi er engasjement av ikke-kanoniske NF-kB. Behandlingen med autophagy hemmende forbindelse 3-MA (3-metyl-adenin) også ablateres relB nukleære lokaliserings, ytterligere støtte disse funnene (fig. 3g). Det er ikke klart om autophagic nedbrytning av last i lysosomer, eller bare autophagic lagring av last, er nødvendig for relB signalering. Mens E64d /pepstatin A behandling ikke hadde noen hemmende virkning på relB nukleære lokaliserings, ble en liten, men signifikant effekt ses med høye doser av klorokin og en markert inhiberende effekt ble sett med bafilomycin A1 (fig. S4). For å bekrefte den observasjon at autofagi fremmer relB aktivitet, målt vi endringer i gentranskripsjon. Analyser av potensielle relB målgener vist at
BIRC3
mRNA nivåer ble robust nedregulert av relB hemming (Fig. 3 h, i). Viktigere, RNAi av
ATG5
,
ULK1
,
TAX1BP1 Hotell og
TBK1
tilsvar downregulated
BIRC3
mRNA (fig. 3j) .
A549-celler ble behandlet over natten med DMSO eller 10 uM MRT68601 (TBKi) og a) farget for relB (skala bar = 50 pm), nukleære lokaliserings kvantifisert i b) (n = 3, ± SEM, * * = p 0,01) eller c) atom ekstrakter forberedt og blottet for indikerte proteiner. d-f) A549 celler ble transfektert med angitt siRNA (
NTC
= ikke-måls kontroll) i 72 timer og e) celleekstrakter utslettet for indikerte proteiner eller d, f) celler ble farget og kvantifisert for atom relB (n = 3, ± SEM, * = p 0,05). g) A549-celler ble behandlet med PBS eller 10 mM 3-metyladenin (3-MA) i 24 timer og deretter farget og kvantifisert for atom relB (n = 3, ± S.E.M., *** = p 0,005). H, I) A549 celler ble infisert med angitte lentivirus, og på 72 timer etter infeksjon, h) celleekstrakter utslettet for indikerte proteiner eller i) total RNA kvantifisert for
BIRC3
mRNA (n = 3; ± SD) . j) A549-celler ble transfektert med indikert siRNA i 72 timer og totalt RNA ekstrakter ble underkastet QRT-PCR for
BIRC3
mRNA (n = 3; ± S.D.). k) A549 celler ble infisert med angitte lentivirus og 120 timer etter infeksjon celle nummer regnet som beskrevet i materialer og metoder (n = 3, ± SEM, * = p. 0,05)
relB aktivitet bidrar til TBK1 og Autophagy «avhengighet»
Vi har bekreftet tidligere observasjoner [1], [11] at kronisk stanse av
ATG5
eller
TBK1
ved lentiviral shRNA targeting, førte til en nedgang i celle nummer i A549 celler, som gjorde RNAi av
KRAS plakater (fig. S5a-f). Viktigere, etter lentiviral RNAi av
relB også ført til markert reduksjon i celle nummer (Fig. 3k). Dette tyder TBK1- og autofagi-mediert regulering av relB kan, i hvert fall delvis, til grunn TBK1- og autofagi-avhengighet.
Autophagy og Ndp52 /Tax1bp1-mediert relB Signale kan være uavhengig av Optineurin og Tax1bp1 ikke fremmer kanonisk NF-kB signale~~POS=TRUNC
i A549-celler, den andre autophagy last reseptor tidligere implisert i TBK1 funksjon, Optineurin [16], ser ut til å ha begrenset engasjement i relB-signalering. Det er bare en liten, om enn betydelig reduksjon i relB kjernefysiske lokalisering på
OPTN
RNAi (Fig. 4a, b). Men disse funnene ikke utelukke en rolle for Optineurin i ulike genetiske bakgrunn eller under stress forhold, og disse mulighetene skal tas opp i videre arbeid. I A549-celler, rolle i å fremme Tax1bp1 NF-kB signalering er også spesifikk for den nye autophagy-relB reaksjonsvei som er beskrevet heri. Stimulering av kanonisk NF-kB signalisering av TNFa-behandling, som målt ved kjerne lokalisering av rela, ikke blir perturbert ved
TAX1BP1
RNAi, i det minste for så vidt som ingen reduksjon av TNFa-fremkalt nukleær translokasjon observeres (fig. 4c , d). Dermed stimulerende rolle av Tax1bp1 på NF-KB KB ser ut til å være spesifikk for ikke-kanonisk relB signalering. Det er imidlertid viktig å merke seg at denne analysen ikke ta opp den allerede vel beskrevne hemmende rolle Tax1bp1 av varigheten og størrelsen av kanonisk NF- kB signalering [24].
A549-celler ble transfektert med angitte siRNA (
NTC
= ikke-måls kontroll) i 72 timer og a) celleekstrakter utslettet for indikerte proteiner eller b) celler farget og kvantifisert for atom relB (n = 3, ± SEM, * = p 0,05) . C, D) A549-celler ble transfektert med angitte siRNA (
NTC
= ikke-målsøkende kontroll) og stimulert med 5 ng /ml TNF-α i 3 timer, og c) farget og d) kvantifisert for kjerne rela ( n = 3, ± SEM). Scale bar = 25 mikrometer.
relB Aktivering av Autophagy og Ndp52 /Tax1bp1 er også sett i p53-mutert, K-Ras-avhengige NSCLC Cells
Det er foreslått at det i p53-mutert NSCLC-linjer, for eksempel NCI-H23, er basal kanonisk NF-kB signale mye høyere enn i p53 villtype-linjer, slik som A549. Men i hvert fall i NCI-H23, vi fortsatt finne konstituerende engasjement relB signalering, avhengig av basal autofagi funksjon, noe som tyder på at basal ikke-kanoniske og kanonisk NF-kB signale kan være co-hendelsen (Fig. 5a-e). Vi fant spesielt at NCI-H23 celler hadde konstituerende autofagi, som vurderes med tandem-fluorescerende LC3 markør protein, som ble nedregulert av
TBK1
RNAi (Fig. 5a-c), og at konstituerende kjernefysiske lokalisering av relB i denne cellelinjen var følsom for RNAi-mediert hemming av
TBK1
,
ATG5
,
NDP52
eller
TAX1BP1 plakater (fig. 5d, e) .
NCI-H23 celler ble transfektert med angitt siRNA (NTC = ikke-måls kontroll) i 72 timer og a) celleekstrakter utslettet for indikerte proteiner. b, c) NCI-H23 tandem-fluorescerende LC3B-celler ble transfektert med angitte siRNA og analysert som beskrevet i Materialer og Metoder. d, e) NCI-H23-celler ble transfektert med indikert siRNA i 72 timer og cellene ble d) farget og e) kvantifisert for kjerne relB (n = 3, ± SEM, * = p 0,05, ** = p 0,01) . Scale bar = 50 mikrometer i alle paneler.
En modell for engasjement av Basal relB Signalering i K-Ras-avhengige lungekreft celler
Dataene presentert i dette manuskriptet føre til formulering av følgende modell (fig. 6). Mens aktiviteten av TBK1 bindende last reseptorer Optineurin, Ndp52 og eventuelt Tax1bp1, driver autofagi av bakterieceller under xenophagy, er en lignende TBK1-mediert autophagic lagring av Tax1bp1 og Ndp52 drevet av basal autofagi i K-Ras-avhengige NSCLC celler . Dette fører til innkobling av ikke-kanonisk NF-kB signalering og celleproliferasjon og /eller overlevelse. Enten TBK1 regulerer også den direkte, lysosomal funksjon av autofagi i cellenes stoffskifte er ukjent; Det gjenstår også å se på om denne rollen av autofagi er eksperimentelt disosierbart fra selektiv lagring av Tax1bp1 og Ndp52. Mekanistisk, er det heller ikke klart hvor TBK1 driver autofagi. Men som dette manuskriptet var i sluttfasen av revisjonen, gruppen av Deretic publisert at fosforylering av generell funksjon autofagi reseptor og tilrettelegger for autophagosome biogenesis, p62 /SQSTM1, i ubiquitin-binding (UBA) domene, kan være involvert i en roman rolle for TBK1 i sult-indusert autofagi [26], [27]. Faktisk første resultatene fra dette laboratoriet tyder på at A549 celler har basalt fosforylert p62 som er redusert i overflod ved TBKi behandling (Fig. S6).
Se teksten for nærmere omtale. Ub = ubiquitin.
Diskusjoner
Autophagy er en mangefasettert prosess, vedta endringer i cellen skjebne av både ikke-selektive og selektive mekanismer [12]. Det er sannsynlig at inngrepet av autophagy i kreftceller virker direkte på begge metabolismen [10], [11], [13] og cellesignalisering, i en integrert respons. Det er fristende å spekulere i at xenophagy er koplet til en medfødte immunrespons via signalerings ikke-kanonisk NF-kB, og denne mekanismen er ganske enkelt avvikende inngrep med oncogen-drevet autophagy i NSCLC-celler. Rollen TBK1 i å drive autofagi kan også forklare hvordan autofagi er engasjert, til tross spådd høy basal mTOR aktivitet, i NSCLC celler. Mekanistisk kan p62 fosforylering spille en rolle i denne prosessen [26]. Men spekulerer vi at TBK1 er en promiskuøs kinase med mange underlag, og spår at p62, og faktisk Optineurin (ved siden av LIR motiv) fosforylering [16], representerer bare en undergruppe av funksjonelt relevante mål av TBK1 i autofagi. Det er dermed mulig at forskjellige substrater av TBK1 handle på ulike stadier av autofagi, enten på tidlige trinn, som våre data skulle tilsi, eller på senere modning trinn, som er nylig foreslått [26].
Vanligvis NF-kB signale har vært antatt å ligge oppstrøms av autofagi [28], [29], [30]. Imidlertid har direkte regulering av kanonisk NF-kB signalering av autofagi nylig blitt foreslått. Hypotese mekanismer har tatt med lagring av p62, IκBα, NEMO eller Bcl10 [31], [32], [33], [34], [35]. Mangfoldet av mekanismene for autofagi handling illustrerer de ulike funksjonene i denne prosessen; her legger vi en annen mekanisme av NF-kB regulering, denne gang i reguleringen av den ikke-kanonisk relB pathway. Nylig har avvikende relB aktivitet blitt identifisert i lungesvulster, passer med vår modell [36]. Imidlertid kan p53 villtype NSCLC også være avhengig til en viss grad, ved å kanonisk NF-kB signalering [37], [38]. Faktisk, A549-celler (p53 villtype) er avhengig av c-Rel aktivitet for proliferasjon og overlevelse [1]. Dette er ikke gjensidig utelukkende med våre resultater; en undetectable mengde atom c-Rel kan være nødvendig for spredning /overlevelse, sammen med relB. Faktisk sammenheng med p53-mutert NSCLC, der engasjement av kanonisk NF-kB signalering er mye tydeligere [39], vil være en god arena for å dissekere et slikt samspill. Interessant nok har vi vist i dette manuskriptet at i det minste noen cellelinjer med p53-mutasjoner, og rapporterte fremstående basal kanonisk NF-kB-signalering (for eksempel NCI-H23), som basal, autophagy drevet relB nukleære lokaliserings kan likevel detekteres. Future undersøkelse av autofagi last brakt til autophagosomal membraner ved Tax1bp1 og Ndp52, ubiquitinmolekyler eller på annen måte, vil også belyse den mekanismen som disse laste reseptorer er involvert i formidling av ikke-kanoniske NF-kB signalering. Proteomikk eksperimenter for å fastslå identiteten til disse last er i gang i vårt laboratorium.
Gitt interesse i å utvikle TBK1 hemmere for kreftbehandling, må vi forstå i detalj konsekvensene av tap av veien som er beskrevet her. I
in vivo
innstilling, effektene av relB regulering av autofagi og TBK1 er usannsynlig å være helt celle autonom, gitt veletablert rolle NF-kB signalisering i kontrollerende celle-celle kommunikasjon og betennelse. Interessant,
TAX1BP1
kan regulere tarm tumorgenesen i musemodeller av kreft [40]. Også germline
TAX1BP1
knockout mus viser en organspesifikk inflammatorisk fenotype [41]. Det er mulig at disse observasjonene kan relateres til den rolle for Tax1bp1 er beskrevet her, eller alternativt til den som er beskrevet bedre rolle i å undertrykke kanonisk NF-kB-signalering [24]. Til slutt, målretting av autophagy er også foreslått som et middel for behandling av kreft, i det minste i noen genetiske bakgrunner. Dataene her tyder på forsiktighet i å ekstrapolere resultatene av genetisk hemming av autofagi ved å målrette autophagosome dannelse og lagring, til virkningen av legemidler som er rettet mot lysosomal funksjon, slik som klorokin, proteasehemmere eller bafilomycin A1. Det er ikke klart at midler som disse vil påvirke alle endringer, for eksempel NF-kB aktivitet, som rettet mot de tidlige stadiene av autofagi vil, og
vice-versa
.
Materialer og metoder
Cellelinjer linjer~~POS=HEADCOMP og Plasmider
Alle celler ble dyrket i DMEM (Sigma) + 10% FCS (Sigma) under 5% CO2 ved 37 ° C. HEK293FT celler fra Invitrogen. A549 celler som ble brukt var hentet fra Institute of Cancer Research (London, UK) og identitet verifisert av mikro genotyping (Health Protection Agency, UK). NCI-H23 celler ble kjøpt direkte fra ATCC. A549 og NCI-H23 celler ble derivatisert til å uttrykke ekotropisk Receptor hjelp pEcoR-neo og utvalg i G418. Retrovirus for å lage stabile infektanter ble generert på Phoenix-Eco-celler ved hjelp av standardteknikker. Disse virusene var: pBabe GFP-LC3B puro [42]: rotte LC3B cDNA smeltet N-terminalt til GFP. pBabe GFP-LC3BΔG- A puro: over plasmid som koder for protein avkortet så C-ter Gly utsatt ved behandling av C-terminalen av Atg4 er konstitutivt utsatt. Denne C-ter Gly er mutert til Ala pBabe tfLC3B puro. PBabe puro med tandem fluorescerende LC3B [21] klonet i NheI (sløv) /Sall inn SnaBI /Sall nettstedet. pWZL GFP-TBK1 Hygro: pWZL GFP MÅL IRES hygroskopisk vektor (upublisert) med full lengde TBK1 smeltet til C-terminalen av GFP ved rekombinasjon med pDONR 223 TBK1 (upublisert) ved Gateway teknologi (Invitrogen). pBabe mCherry LC3C BLAST: pBabe Cherry MÅL BLAST vektor (upublisert) med full lengde LC3C smeltet til C-terminalen av mCherry ved rekombinasjon med pDONR 223 LC3C [43] av Gateway-teknologi (Invitrogen). MSCV FLAG-HA-LC3B: Som beskrevet i litteraturen {Behrends, 2010 # 4}. MSCV FLAG-HA TAX1BP1 (WT og LIR mutanter): TAX1BP1 cDNA ble klonet inn pDONR 223 ved hjelp av standard Gateway kloningsteknikker som bruker pcDNA 3,1 myc-TAX1BP1 (nedenfor) som mal. TAX1BP1 cDNA ble deretter Gateway klonet inn MSCV nTrykk IRES PURO [43]. Seterettet mutagenese ble utført i pDONR før rekombinasjon inn i MSCV nTrykk IRES PURO for å fremstille cDNA som koder for TAX1BP1 med mutasjoner i det antatte kanonisk eller ikke-kanonisk LIR motiv (mutasjoner som er beskrevet i teksten). Alle mutageniserte cDNA ble fullstendig sekvensert
Andre plasmider brukt i denne studien var:. PcDNA 3,1 myc-His: Invitrogen, pcDNA 3,1 myc-TAX1BP1: myc-TAX1BP1 full-lengde cDNA (NCBI isoform 1) ble PCR forsterket med følgende primere fra et bilde klone og klonet BamHI-XhoI inn pcDNA 3,1 myc-His: GGA TCC GCC ACC ATG GAG CAG AAG CTG ATT TCC GAG GAG GAC CTG ACA TCC TTT CAA GAA GTC CCA TTG CAG ACT TC og CTC GAG CTA GTC AAA ATT Tags AAC ATT CTG ATC AAA ATG GGT C. den resulterende cDNA koder 307I variant av dette proteinet (vanlig polymorfisme). pDEST15-tom vektor (for uttrykk av GST kontroll protein): skapt ved å sette inn en intern ramme stoppkodon inneholder kassetten inn pDEST15 ved Gateway kloning fra en spesialkonstruert pDONR223 plasmid. pDEST15-LC3B, pDEST15-LC3C og pDEST15-GABARAP (for uttrykk av GST fusjonsproteiner) ble opprettet av rekombinasjon med pDONR 223 LC3B, pDONR 223 LC3C eller pDONR 223 GABARAP [43] av Gateway-teknologi (Invitrogen).
Chemicals
Klorokin ble oppnådd fra Sigma og opprettholdt som en frossen stamløsning i PBS. 3-MA ble oppnådd fra Sigma og friske løsninger laget i DMEM tidligere på arbeids-konsentrasjon før påføring på celler. TNFa ble oppnådd fra Sigma og lagret i frossen delmengder i vandig oppløsning. TBKi (MRT68601, fig. S1) ble oppnådd fra MRC-teknologi og opprettholdt som en frossen stamløsning i DMSO. Bafilomycin A1 ble oppnådd fra Sigma og lagret som en frossen stamløsning i DMSO. Pepstatin A ble oppnådd fra Sigma og lagret som en stamoppløsning i etanol. E64d ble erholdt fra Calbiochem, og lagret som en frossen stamløsning i DMSO
Antistoffer
Antistoffene anvendt i denne studien er som følger:. TBK1 (kanin AOW9 monoklonalt, Millipore), fosfo-Ser172 -TBK1 (BD Pharmingen), ATG5 (for ATG5-12, Rabbit polyklonale, Cell Signal Technology), ULK1 (kanin polyklonale A705, Cell Signal Technology), LC3B (Immunoblot, Rabbit monoklonalt D11, Cell Signal Technology), LC3B (immunfluorescens, mus monoklonalt 2G6, nanoverktøy), GABARAP (kanin polyklonale Ap1821a, Abgent), ERK (kanin polyklonale 9102, Cell Signal Technology), relB (Rabbit monoklonalt C1E4, Cell Signal Technology), Histone H3 (H3, monoklonalt 6-6-2 , Millipore), Tax1bp1 (Rabbit poly HPA024432, Sigma HPA), Ndp52 (Rabbit poly ab68588, Abcam), p62 (mus 3 /p62 monoklonalt, BD Pharmingen), myc tag (Rat JAC6 monoklonalt, Abd Serotec [TBK1 coIP eksperimenter] eller mus 4A6 monoklonalt, Millipore [GST pulldown eksperimenter]), c-Rel (Rabbit polyklonale, 4727, Cell Signal Technology), rela (Rabbit monoklonalt C22B4, Cell Signal Technology), α-tubulin (Musemonoklonalt DM1A, Sigma), HA ( Rat monoklonalt 3F10, Roche), GST (GST-2 mus monoklonalt, Sigma), Optineurin (kanin polyklonale Varenr. 100 000, Cayman Chemical), K-Ras (Musemonoklonalt 3B10-2F2, Sigma). Anti-fosfor-S403-p62 var en slags gave av Nobuyuki Nukina (Riken, Japan). Fosfor-spesifikke antistoffer mot IRF3, Rela og JNK ble hentet fra Cell Signal Technology.
siRNA Transfeksjon
I 35 mm retter, 0,8 × 10
5 A549 eller 1,2 × 10
5 NCI-H23 ble belagt over natten. -Celler ble transfektert i 8 timer med Oligofectamine (Invitrogen) og 10 nM siRNA (A549) eller 20 nM siRNA (NCI-H23), i henhold til produsentens instruksjoner.
