Abstract
EGF-familien av tyrosin-kinase reseptorer aktiverer cytoplasmatiske veier involvert i celleproliferasjon, migrasjon og differensiering i respons til spesifikke ekstracellulære ligander. Foruten disse kanoniske trasé, kjernefysiske lokalisering av ErbB reseptorer i primære svulster og kreft cellelinjer ledet til å undersøke deres rolle som transcriptional regulatorer av kreftgener. Den nukleære lokalisering av ErbB3 har blitt rapportert i ulike kreft vev og cellelinjer, men de nukleære funksjoner og den antatte sammenheng med tumorprogresjon og resistens overfor terapi uklare. Vi først vurderes ErbB3 uttrykk i normale og tumor prostata vev. Atom farging skyldes hovedsakelig en isoform matchende C-terminalen domenet til full lengde ErbB3
185kDa reseptoren. Nukleær farging ble også begrenset til kreftceller, og ble øket i avansert kastrering resistent prostatakreft i forhold til lokaliserte tumorer, noe som tyder det kan være involvert i utviklingen av prostatakreft opp til terminalen kastrering bestandige fase. Spon on-chip eksperimenter ble utført på immortaliserte og tumorcellelinjer er valgt ved karakteriseringen av endogene atom ekspresjon av en ErbB3
80kDa isoform. Blant de 1840 mål arrangører identifisert, 26 ble valgt før ErbB3
80kDa-avhengig genekspresjon ble evaluert av sanntids kvantitativ RT-PCR, som beviser at ErbB3
80kDa utøves transkripsjonen kontroll på de genene. Noen av målene er allerede kjent for å være involvert i sykdomsprogresjon selv om ingen kobling ble som tidligere er etablert med ErbB3 membran og /eller kjernefysiske signalering. Mange andre, ennå ikke er forbundet med prostatakreft, kan gi nye terapeutiske muligheter for pasienter uttrykker ErbB3
80kDa. Oppdager ErbB3
80kDa kunne dermed utgjøre en nyttig markør for prognose og behandlingsrespons
Citation. El Maassarani M, Barbarin A, Fromont G, Kaissi O, Lebbe M, Vannier B, et al. (2016) Integrert og Funksjonell genomanalyse validerer Relevans av Nuclear Variant ErbB3
80kDa i Prostate Cancer Progresjon. PLoS ONE 11 (5): e0155950. doi: 10,1371 /journal.pone.0155950
Redaktør: Zoran Culig, Innsbruck Medical University, ØSTERRIKE
mottatt: 20 juli 2015; Godkjent: 07.05.2016; Publisert: 18. mai 2016
Copyright: © 2016 El Maassarani et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet:. Mikromatrise data er tilgjengelig på ArrayExpress: E-mtab-3499, E-mtab-3504
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av Ligue contre le cancer, LCC PS /2012-13-14 til PS; Groupe Pasteur Gjensidighet til AB; og Ministère de l’Education Nationale de la recherche et des teknologier 2010-2014 til MEM. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
EGF-reseptorer familien består av fire tyrosin kinase (TK) reseptorer (EGFR /ErbB1, HER2 /ErbB2, HER3 /ErbB3 og HER4 /ErbB4) med en ekstracellulær ligand-bindende domene, et transmembrandomene og en intracytoplasmatisk domene. Ved spesifikk ligandbinding ved celleoverflaten, ErbB-reseptorer dimerisere og utløse intracellulære reaksjonsveier som er involvert i celle-proliferasjon, migrering og differensiering [1]. Dereguleringen av ErbB nedstrøms trasé, gjennom tre strømnettet mekanismer -Økt reseptorekspresjon, økes ligand ekspresjon eller aktiverende mutasjon av TK domene- ofte involvert i tumordannelse [2]. I tillegg til deres lokalisering i plasmamembranen, er ErbB-reseptorer også blitt beskrevet i kjernen og forskjellige funksjoner har blitt henført til de translokerte ErbB-reseptorer blant disse er celleproliferasjon, DNA-reparasjon og transkripsjonskontroll [3-8]. I denne forbindelse er det full-lengde ErbB1 reseptoren i kjernen forbundet med økt ekspresjon av proliferative og metastatiske gener [9-11]. Uttrykket av pro-apoptotiske og pro-angiogenic COX-2 protein er modulert på ErbB2-binding på
COX-2
promoter i brystsvulstceller [12]. ErbB2 fungerer også som en transkripsjons co-aktivator av Stat3 protein på
CCND1 plakater (cyclin D1) promoter [13] og samarbeider med ErbB1 å opp-regulere
STAT1
genuttrykk [14] . Den fulle lengde ErbB3
185kDa protein eller kortere isoformer er blitt beskrevet i kjernen av normale mammary epitelceller [15] og Schwannske celler [16] så vel som i forskjellige humane kreftcellelinjer: bryst (SKBR3, MCF-7 ET BT474), lunge (H226 et SCC6) hode og hals (SCC6 et SCC1) og kolon (LoVo et CaCO2) [15, 17-19]. I H358 ikke-småcellet lungekreft (NSCLC) og SKBR3 brystcellelinjer, har ErbB3 vist seg å utøve funksjonen som en co-transkripsjonen aktivator for
CCND1
genuttrykk [17,19]. Den sterke trans potensialet ErbB3 avhengig nesten utelukkende på C-terminal domene av reseptoren [19].
Prostatakreft (PCA) er den vanligste urologisk kreft og den nest største årsaken til kreftdød i de industrialiserte land . Tumor tilbakefall etter kirurgisk ablasjon eller strålebehandling oppstår ofte i en betydelig andel av pasientene som utvikler spres aggressiv sykdom. Som PCA celler stole på androgen reseptor (AR) aktivitet for vekst og spredning, har androgen tilbaketrekking terapi er godkjent i de avanserte tilfeller [20]. Gunstige effekter er observert i ca 24 måneder før pasienten utvikler dødelig kastrering-resistente-prostata-kreft (CRPC). Molekylære mekanismene som er involvert i behandlingen motstand fortsatt uklart. En forklaring på pasientens tilbakefall etter behandling kan komme fra krysstale mellom AR signalering og epitelial vekstfaktor familie av reseptorer (EGFR) trasé [21]. ErbB-reseptorer og deres ligander er uttrykt i normal voksen prostata for å opprettholde homeostase av organet og ErbB1, ErbB2 og ErbB3 blir ofte øket i løpet av PCa progresjon [22]. I CRPC, økt ErbB2 reseptor og /eller ErbB1, ErbB2 eller ErbB3-ligander uttrykket er assosiert med dårlig prognose og metastase [23-25].
Hvis du vil by-pass mekanismene for resistens mot androgen-terapi, ErbB1 og ErbB2 TK-hemmere er testet sammen med hormonbasert terapi hos pasienter med høy klasse, CRPC svulster. Men studiene var ikke vellykket som kreftceller utviklet kompenserende trasé ved å regulere ErbB3 uttrykk og lokalisering [18,26]. Faktisk har flere studier rapporterte kjernefysiske lokalisering av ErbB3 i prostata vev og PCA cellelinjer potensielt korrelert med sykdomsprogresjon [18,27] sikret atom ErbB3 protein kan dermed spille en sentral rolle ved PCA progresjon og terapi motstand, men den molekylære mekanismer involvert fortsatt uoppdaget.
den aktuelle studien viser funksjonelle relevansen av ErbB3 kjernefysiske lokalisering ved PCA og gir nye ledetråder for forståelsen av veier i forbindelse med kreft progresjon og terapi motstand.
Materialer og Metoder
Pasient Tissue microarrays
Skriftlig informert samtykke ble innhentet fra pasienter i samsvar med kravene i den institusjonelle etikk komité av Centre Hospitalo-Universitaire de Poitiers som godkjent studien. 169 formalinfikserte, parafininnstøpte, arkiv vev fra pasienter behandlet ved «Centre Hospitalier Universitaire de Poitiers» for PCA ble inkludert. 137 vevsprøver ble oppnådd fra hormonsensitiv (HS) pasienter som gjennomgikk radikal prostatektomi for klinisk lokalisert kreft, ingen av disse pasientene i hormonmangel behandling før kirurgi. Av disse 97 var scene pT2 og 40 pT3. Den Gleason score var henholdsvis seks på 38 pasienter, 7 i 83 pasienter, og 8 eller mer i 16 pasienter. 32 vevsprøver ble oppnådd ved trans-uretral reseksjon fra CRPC pasienter. Normal vises prostata vev fra 50 pasienter behandlet med radikal prostatektomi ble også inkludert. Farging ble utført ved hjelp av følgende antistoffer: ErbB3 C-ter (kanin polyklonale sc-285, Santa Cruz Biotechnology 1/200), ErbB3 N-ter (Musemonoklonalt Ab-5 Clone H3.105.5, Neomarkers, 1/50), CCND1 (Rabbit monoklonalt, klone EP12, DAKO, 1/50) og Ki67 (Musemonoklonalt, klone MIB-1, DAKO, 1/100). Negative kontroller ble oppnådd ved anvendelse av et irrelevant antistoff. Vev fra mantelen sone lymfom ble brukt som positiv kontroll for Ki67 og CCND1. Slides ble analysert ved 2 observatører i en blind mote. For ErbB3C-ter, CCND1 og Ki67-farging, ble hvert vev kjerne får en kontinuerlig verdi som representerer prosentandelen av tumorceller som oppviser nukleær farging. For hver pasient, ble kjernen med høyest prosent valgt.
Cellelinjer
Menneskelige prostatahyperplasi RWPE celler (ATCC
® CRL11609 ™), normale epitelceller udødeliggjort av HPV-18, ble opprettholdt i keratinocytt serumfritt medium supplert med bovint hypofyseekstrakt (BPE, 0,05mg /ml) og human rekombinant epidermal vekstfaktor (EGF, 5 ng /ml) (Invitrogen). Human prostatisk LNCaP-cellelinjen (ATCC
® CRL1740 ™) avledet fra lymfeknute og PC3 (ATCC
® CRL1435 ™) cellelinje avledet fra beinmetastaser, ble dyrket i DMEM supplementert med 10% føtalt kalveserum og 1% penicillin /streptomycin.
Western blotting
Proteinekstrakter ekstrakter~~POS=HEADCOMP og western blot-analyse ble utført som beskrevet i [17]. Nukleære og ikke-nukleære ekstrakter ble fremstilt som følger: Cellene ble resuspendert i Tris-HCl 10 mM pH 7,5, NaCl 120 mM, og lysert med NP40 til en sluttkonsentrasjon på 0,3%. Etter sentrifugering i 5 min ved 2500 g, ble supernatanter supplert med EDTA 1 mM, DTT 1 mM, SDS 0,1%, PIC 1/50 og 1/100 PMSF for å utgjøre den ikke-nukleær fraksjon. Pelleten tilsvarende kjerner ble vasket tre ganger i Tris-HCl 10 mM pH 7,5, NaCl 120 mM, NP40 0,3% for å eliminere cytoplasmatiske rester, deretter lysert som ovenfor.
chip on-chip
Celler ble behandlet med 1% formaldehyd og kromatin ekstraksjon ble utført med Simple ChIP Enzymatisk chromatin IP kit (Cell Signaling Technology, CST) i henhold til produsentens anbefaling. Den utvinnes kromatin ble fordøyd av Micrococcal nuklease å få kromatin fragmenter rundt 500pb størrelse. På dette trinnet, ble en total DNA-prøve (Input) samlet for senere bruk. Immunoutfelling ble utført ved å bruke anti ErbB3 C-ter antistoffer (sc-285 eller sc-7390, SCBT) eller anti-H3 (positiv kontroll, Histone H3-antistoff ChIP formulert # 2650, CST) og for inkubering med det ikke-relevant normal kanin IgG (ChIP negativ kontroll). Total DNA og chip-DNA ble forsterket ved hjelp av Whole Genome Amplification Kit (WGA-2, Sigma-Aldrich) og henholdsvis merket med Cy-3 eller Cy-5 fluorokromer bruker BioPrime Array Genomisk Merking sett (Invitrogen). Merkede prøver ble hybridisert menneskerettighetspromo Mikromatriser (Agilent Human Arrangøren ChIP-on-Chip Microarray Set 244K, P /N G4489A) i henhold til produsentens anbefaling.
Normalisering og analyse av microarray data
data levert av Agilent høy oppløsning DNA microarray scanner ble analysert ved hjelp Feature Extraction 10,1 programvare (Agilent Technologies). Fluorescens flekker som ikke klarte å passere kvalitetskontrollen ble ekskludert. Signaler om berikelse forhold (chip /Input) knyttet til flettede replikater ble beregnet ved hjelp cocas programvare [28]. ErbB3-beriket partnere fra tre uavhengige eksperimenter ble isolert ved hjelp av topp algoritme i cocas fulgt av berikelse score beregnes ved å måle effektiv toppområdet.
Real-time kvantitativ PCR (qPCR) analyse
qPCR eksperimenter ble utført på ErbB3-immunopresipitert eller IgG-kontroll DNA, ved hjelp av GoTaq qPCR Master Mix (Promega) i henhold til produsentens instruksjoner på en 7500 Fast real Time PCR system (Applied Biosystems). Relativ anrikning ble estimert etter kvantifiseringen av PCR-signal ved å måle forholdet mellom IP ErbB3 /IgG. Liste over chip qPCR primere er gitt i tabell 1.
RNA isolering og RT-qPCR
LNCaP og PC3 cellene ble transfektert med 20pmol av kontroll eller ErbB3 spesifikke sirnas (Eurogentec ) før total RNA ble ekstrahert ved hjelp RNAble (Eurobio). cDNA ble syntetisert fra 2-6μg av total RNA og amplifisert ved qPCR som beskrevet ovenfor. GAPDH ble benyttet som intern kontroll for å normalisere genekspresjon. Liste over cDNA RT-qPCR primere er gitt i tabell 2.
Resultater
ErbB3 uttrykk og lokalisering i normale og tumor prostata vev
137 HS, 32 CRPC og 50 normalt opptrer tumor tilstøtende vev ble analysert ved hjelp av immunhistokjemi (figur 1). I alle prøvene, farging for ErbB3 N-ter, når de er tilstede, ble plassert hovedsakelig på membranen, og ingen nukleær farging ble observert (figur 1A). Alle de 169 prøvene som vises cytoplasma farging med ErbB3 C-ter. (Fig 1B). I motsetning til dette ble nukleær farging observert med ErbB3 C-ter i 60 av de 169 (35%) PCA prøvene, men ikke i noen av de ikke-tumorprøver. Nuclear ErbB3 ekspresjon ble oftest observert i CRPC (17/32, 53%) enn i HS-tumorer (43/137, 31%) (p = 0,03, Chi to test). I tillegg, når til stede, er prosentandelen av PCa uttrykke ErbB3 i kjernen var høyere i CRPC (median 10%, område 2-95%) enn i HS-kreft (median 2%, område 1-20%) (p = 0,007, Mann Whitney test). Median ekspresjon av CCND1 var 15% av HS prostatakreftceller (område 0-70%, som ikke er vist) og 20% av kreftceller i vev CRPC (variasjons 0-80%) (figur 1D og 1G). Median formeringshastigheten bestemt ved Ki67-farging var 1% av PCA-celler i HS vev (område 0-10%, som ikke er vist), og 17,5% i CRPC prøvene (figur 1E og 1 H). I HS, ble det ikke observert signifikant sammenheng mellom kjerne ErbB3, CCND1 (p = 0,09) og formeringshastigheten (p = 0,1, Spearman test). I CRPC ble atom uttrykk for ErbB3 signifikant assosiert med
CCND1
uttrykk, med en positiv korrelasjon (p = 0,01, Spearman test) (fig 1C og 1D vs 1F og 1G). Hvis du vil fortsette, er kjernekraft ErbB3 høyt og ofte uttrykt i CRPC og korrelerer med CCND1 uttrykk, mens ingen signifikant korrelasjon ble observert i HS svulster.
Farging med ErbB3 N-ter antistoff i PCA vev var plassert på membranen, uten kjerne uttrykket (a). Ingen ErbB3 C-ter kjernefysiske farging ble påvist i «normale» prostata vev (b). Nuclear ErbB3 uttrykk ble observert i PCA celler, og oftere i CRPC avanserte svulster sammenlignet med klinisk lokalisert kreft. I CRPC, ble høy nukleær farging forbundet med høy CCND1 uttrykk og en tendens til å være assosiert med høyere spredning (Ki67) (CRPC 1, ce), mens de fleste svulster uten kjernefysiske farging vises lav CCND1 uttrykk og tendens til å vise lavere spredning (CRPC 2, fh).
ErbB3 uttrykk og lokalisering i prostata cellelinjer
Vi neste vurdert endogen ErbB3 uttrykk og lokalisering i prostata cellelinjer med ErbB3 C-ter antistoffer. Ved indirekte immunofluorescens, ErbB3-farging var hovedsakelig tilstede i plasmamembranen og i cytoplasma av RWPE celler mens en høy nukleær farging ble påvist i tumorcellelinjer (figur 2A). Western blot-analyse av totale proteinekstrakter viste at de tre cellelinjene uttrykte tilsvarende nivåer av full-lengde ErbB3
185kDa protein. En ekstra 80kDa protein er spesielt påvist i hormon-sensitive (LNCaP) og hormonresistent (PC3) tumorcellelinjer (figur 2B). Deretter ble Western blotting utført på ikke-nukleær vs kjerneproteinfraksjoner. Kvaliteten av ekstraktene ble validert ved spesifikk påvisning av cytosolisk PAK1 protein i de ikke-nukleære ekstrakter og C23 (nucleolin) protein i de nukleære ekstrakter. Som vist, var ErbB3
185kDa hovedsakelig uttrykt i de ikke-kjernefysiske fraksjoner og var fraværende eller litt påvises i atom fraksjoner av alle celletyper. I stedet 80kDa protein ble nesten utelukkende funnet i de kjernefysiske fraksjoner av LNCaP og PC3 celler (figur 2C). Disse data tyder på at den kjernefysiske protein påvist i PCA celler kan i hovedsak tilsvare ErbB3
80kDa atom isoform tidligere beskrevet i lungekreft cellelinjer [17].
(A) Både RWPE og PC3 cellene vise cytoplasma og membran ErbB3 lokalisering. I tillegg innfødte PC3 celler viser en sterk kjernefysiske lokalisering oppdaget av ErbB3 C-ter antistoff (sc-285, Santa-cruz Bioteknologi). (B) Totalt proteinekstrakter, detekterer ErbB3 C-ter-antistoff i hele lengden ErbB3
185kDa protein i alle cellelinjer og 80kDa-proteinet i LNCaP og PC3 tumorcellelinjer. (C) Den fulle lengde ErbB3
185kDa protein er nesten bare detektert i ikke-nukleære fraksjoner som inneholder plasmamembran og cytoplasmatiske proteiner, mens en sterk 80kDa signal blir observert i de nukleære fraksjoner av de tumorlinjer. (D) En 719 bp amplifikasjonsprodukt er detektert i de tre cellelinjer med primere utformet for å amplifisere både den fulle lengde mRNA (NM_001982.3) og AK300909.1 variant (PCR1), mens PCR2 og PCR3 primere som er spesifikke for AK124710. 1 og AK1250281 henholdsvis, klarte ikke å forsterke en hvilken som helst rekkefølge. (E) Kvantitativ analyse med spesifikke primere for ErbB3 transkripsjoner indikerer at NM_001982.3 og AK300909.1 uttrykkes på sammenlignbare nivåer i LNCaP og PC3 cellelinjer mens AK300909.1 er litt påvises i RWPE celler.
Blant de mulige varianter rapportert i offentlige databaser som kunne transkribert fra
ErbB3
genet, bare tre kunne tilsvare atom ErbB3
80kDa protein. De mangler 5′-sekvensen som koder for det ligandbindende og transmembrane domener av reseptoren og ha forutsagte nukleære lokaliseringssignaler (NLS) [29]. For å skille mellom disse variantene, gjennomførte vi RT-PCR med primere rundt ATG start kodon av mRNA. I de tre cellelinjene, ble et 719 bp PCR-produkt detektert med primere abel (PCR1) som muliggjør amplifikasjon av både den fulle lengde NM_001982.3 og varianten AK300909.1 transkripter som deler den samme nukleotidsekvens. Dette eksperimentet ledet oss til å eliminere AK124710.1 og AK1250281 og å fokusere på AK300909.1 transkripsjon (figur 2D). Denne varianten er spådd til å kode en 699aa protein, hvis sekvens er strengt identisk med intracellulære domenet av ErbB3
185kDa. Til å diskriminere mellom NM_001982.3 og AK300909.1 ekspresjon i cellelinjene, ble RT-qPCR utført ved bruk av primere som amplifiserer begge transkriptene eller primere som er spesifikke for den 5 «kodende sekvens av NM_001982.3 (figur 2E). Som vist, var begge transkripter uttrykt på samme nivå i LNCaP og PC3-celler, mens AK300909.1 var nesten ikke detekterbar i RWPE-celler (figur 2E).
Således, LNCaP og PC3 prostata tumorcellelinjer som koder for to forskjellige protein isoformene ErbB3
185kDa og ErbB3
80kDa, tilsvarende NM_001982.3 og AK300909.1 mRNA transkripter hhv.
Genome-wide analyse av ErbB3-target arrangører i prostatakreftceller
for å identifisere ErbB3-målgener, vi neste utførte chIP-on-chip analyser ved hjelp av chip-validert ErbB3 C-ter antistoffer [17] i henhold til arbeidsflyten beskrevet (figur 3A). ErbB3-bundet genomiske regioner ble først undersøkt ved bruk av frittstående cocas V2.4 programvare [28]. Etter at forhåndsbehandlingstrinn, toppdeteksjonsalgoritmen detektert høy sondesignaler som svarer til vesentlige endringer i Cy3 /Cy5-forhold på anrikede genomiske regioner. I alt 68% av ErbB3-target-probene ble plassert inn i kjernen promotere, mens 30% var innenfor genene og 2% nedstrøms fra transkripsjons-startsetet (TSS). Betydelig beriket prober ble identifisert over en terskel justeres til 0,998, som fører til slutt identifisere 1840 ErbB3-target arrangører fordelt slik: 317 arrangører i RWPE, 606 i LNCaP og 1297 i PC3 celler, hvorav åtte ble funnet i de 3 cellelinjer og 361 ble delt av LNCaP og PC3 cellelinjer (figur 3B). Dataene ble ytterligere bekreftet med Agilent Workbench 7.0. Fordelingen av signalet langs promotorene ble anvendt for å konstruere chip qPCR primere i de regionene som viste den høyeste konsentrasjonen av ErbB3-anrikede prober med høyest log-forholdet (figur 3C). Antallet målet promotorer var signifikant høyere i hormon-resistente PC3-celler enn i hormonsensitiv LNCaP-celler, noe som tyder på involvering av ErbB3
80kDa i PCa progresjon og aggressivitet, i samsvar med de data som oppnås i pasienter (fig 1). Gene lister avledet fra ChIP-on-chip eksperimenter ble videre analysert med DAVID (Database for kommentering, visualisering og integrert Discovery) [30]. Funksjonell merknad bekreftet involvering av ErbB3
80kDa mål i cellulære prosesser svært deregulerte i tumor mekanismer (Fig 3D). Et betydelig antall ErbB3
80kDa mål i PC3 eller PC3 og LNCaP tumorcellelinjer var allerede kjent for å være assosiert med PCA eller andre solide tumorer, noe som tyder på at ErbB3
80kDa kunne regulere på en mer generell måte mekanismene for tumorprogresjon (fig 3D).
(A) Chromatin immunoprecipitation ble utført på endogene forhold. Atom lysater ble fremstilt fra naturlige celler dyrket i komplett medium og uten noen androgen. ChIP-DNA og total DNA (Input) merket med Cy5 og Cy3 fluorophores henholdsvis ble co-hybridisert på Agilent arrangører Tilling arrays. (B) Dataanalyse med cocas programvare førte til å velge 1840 ErbB3-target arrangører i de tre cellelinjer. (C) Agilent Worbench 7.0 programvare analyse illustrerer fordelingen av positive sonder (ErbB3 bundne DNA /røde prikker) og negative sonder (Input /grønne prikker) i hele gener sekvens (X-aksen). Signalintensitet er vist på Y-aksen.
CCND1 Hotell og
MMP7
tilsvarer positive og negative kontroller, henholdsvis. (D) Gene ontologi analyse av ErbB3-mål med DAVID.
ChIP-qPCR validering av atom ErbB3 mål arrangører i prostatakreftceller
Blant de 1840 målene, 26 gener ble valgt for chip qPCR validering (fig 4). Fire ikke-beriket arrangører (
ErbB3
,
EBP1
,
PSA Hotell og
MMP7
) ble brukt som negative kontroller og vises ingen vesentlig forsterkning, mens
CCND1
promoter vises 7-12 berikelse fold i LNCaP og PC3 cellene henholdsvis (fig 4). De tre LNCaP-spesifikke mål oppviste betydelig berikelse fold i LNCaP-celler og ikke i PC3-celler, mens en sterk og spesifikk anrikning ble observert for de 6 PC3-spesifikke mål i PC3 cellelinje (figur 4A vs 4B). Anrikning fold observert for de delte promotorer varieres avhengig av målet og cellelinjen, men var alltid høyere i hormon-resistente PC3-celler enn i LNCaP-celler.
På basis av biocomputing data, 16 tilfeldig utvalgte ErbB3-target partnere fra LNCaP celler (A) og 19 tilfeldig utvalgte ErbB3-målet partnere fra PC3 celler (B) ble testet. Alle viste en betydelig berikelse ErbB3 i forhold til den negative kontroll chip-IgG (verdien normalisert til 1).
CCND1
promoter ble brukt som positiv kontroll, mens ikke-beriket arrangører
ErbB3
,
EBP1
,
PSA
, og
MMP7
ble anvendt som negative kontroller. Dataene er representative for 3 uavhengige eksperimenter og er et middel til triplikate prøver. * P 0,05, ** P. 0,01, ns = ikke-signifikant, Student
t
test
Transkripsjonell regulering av ErbB3 avhengig målgener
gitt strukturen av AK300909.1 transkripsjon, kan ingen sirnas som er spesifikke for denne varianten være utformet. Så, vi adressert transkripsjonelle effekter av ErbB3
80kDa ved subtraktiv analyse: to typer sirnas ble brukt, rettet mot enten den 5 «kodende sekvens av det NM_001982.3
ErbB3
transkripsjon (siErbB3A) eller tre «kodende sekvens av både NM_001982.3 og AK300909.1
ErbB3
transkripsjoner (siErbB3B) som vist på fig 5A. De sirnas ble validert ved RT-qPCR (ikke vist) og western blotting analyse: ErbB3
185kDa uttrykk ble hemmet av begge sirnas, mens ErbB3
80kDa uttrykk ble kun redusert med siErbB3B i LNCaP og PC3 cellelinjer (Fig 5A ). Under disse betingelser, har vi analysert ved ekspresjon av 15 ErbB3
80kDa-målrettet mot gener (figur 5B). Som forventet ble det uttrykk for
CCND1
betydelig redusert i LNCaP og PC3 celler transfektert med siErbB3B vs siErbB3A, vises den sistnevnte ingen forskjell med kontroll siRNA. Det samme gjaldt for
GATA2
,
RUNX2
,
MAP3K14 Hotell og
ErbB2
i de to cellelinjer, og for
ARID1A
i PC3 celler. Motsatt siErbB3B indusert høyere uttrykk for
PPIG Hotell og
MXI1
i de to cellelinjer og for
ID3 Hotell og PC3-bare mål i PC3 celler (figur 5B). For å forenkle dataanalyse, ble prosentandelen av uttrykket gangers endring som kan oppføres på atom isoform beregnet med formelen (relativ genekspresjon ved siErbB3B behandling) /(relativ genekspresjon ved siErbB3A behandling) for hvert mål-genet (fig 5C) . Som vist, ErbB3
80kDa transcriptionally aktiverer
CCND1
,
GATA2
,
RUNX2
,
MAP3K14 Hotell og hemmer
PPIG
MXI1
både LNCaP og PC3 celler, mens det hemmer
TBCC
,
SIN3A
,
ACE
,
ID3
,
RAD52
,
CXCR3
i PC3 celler bare. Western blot analyse utført på ErbB3
80kDa-mål bekreftet transkripsjons effektene av atom ErbB3 isoformen på proteinnivå (S1 figur).
(A) To sirnas ble brukt til å spesifikt hemme NM_001982.3 transkripsjon (siErbB3A) eller både NM_001982.3 og AK300909.1 transkripsjoner (siErbB3B) og validert av western blotting med ErbB3 C-ter antistoff. (B) LNCaP og PC3 cellene ble transient transfektert med siErbB3A eller siErbB3B før mRNA ble revers transkribert og forsterket. RT-qPCR ble utført på et utvalg av ErbB3-målgener. Expression ganger endring ble normalisert til å kontrollere siRNA transfekterte prøver. Transfeksjoner ble utført in triplo, og RT-qPCR resultatene som er rapportert er fra minst tre uavhengige eksperimenter. (C) Ekspresjon ganger endring rad til hemming av ErbB3
80kDa-isoformen i hver cellelinje og for hvert mål gen blir beregnet ved forholdet (relativ genekspresjon ved siErbB3B behandling) /(relativ genekspresjon ved siErbB3A behandling). ErbB3
80kDa avhengig transkripsjonen aktivering av
GATA2
,
RUNX2
,
MAP3K14
,
ErbB2 Hotell og
CCND1 Hotell og inaktivering av
PPIG
, MXI1 var lik i LNCaP og PC3 mens
ARID1A
,
TBCC
,
FYN
,
SIN3A
,
TOR3A
,
ACE
,
RAD52
,
CXCR3A
syntes å være forskjellig regulert i de to cellelinjer. * P 0,05, ** P 0,01, ns = ikke-signifikant, Student
t
test
De data som presenteres her kan integreres å foreslå en modell for atom ErbB3.
80kDa funksjoner i prostata kreft progresjon (fig 6).
Blokkerings RA-avhengige signalering av androgen tilbaketrekking terapi (AWT) først hemmer tumorvekst, men snart alternative proliferative veier er reaktivert indusere tumorprogresjon. Økt ErbB3 uttrykk og etterfølgende reaktivering av PI3K reaksjonsveien i respons til AWT er en viktig mekanisme for tumorresistens. Alternativt, rapporterer vi her atom opphopning av ErbB3
80kDa, en variant mangler ligand-bindende og transmembrane domene av ErbB3
180kDa, avansert PCa motstandsdyktig mot terapi (CRPC). Som en co-regulator for transkripsjon av gener assosiert med celleproliferasjon, differensiering, apoptose, onkogenese, ErbB3
80kDa er sannsynlig å være sterkt involvert i terapi motstand og progresjon til fatal PCa.
DHT
:
dihydrotestosteron; AR
:
androgen reseptor; ER product::.
androgen responsive elementer
Diskusjoner
Målet med denne studien var å få frem molekylære stier som involverer ErbB3 i tumorprogresjon og metastatisk spredning , for å karakterisere nye potensielle terapeutiske mål for prostatakreft. Nye behandlingsformer godkjent for tilbakevendende prostatakreft forsinkelse metastatisk progresjon og forlenge total overlevelse, men likevel ikke klarer å hemme tumorprogresjon til dødelig CRPC. Upassende ekspresjon og /eller aktivering av ErbB-familien av tyrosin-kinase-reseptorer er blitt rapportert i avansert PCa, som fører til vurdere ErbB1, ErbB2 og ErbB3 som potensielle diagnostiske og prognostiske markører [22,31]. Følgelig har øket ErbB3 ekspresjon er rapportert i androgen-avhengige PCa behandlet av androgen uttak og er assosiert med dårlig prognose. Dette overekspresjon korrelerer med cellesyklusprogresjon og reaktiveringen av den transkripsjonelle aktivitet av AR i fravær av androgener [26]. I tillegg har atom compartmentalization av ErbB3 blitt foreslått å spille en rolle ved PCA progresjon men mekanismene som er involvert fortsatt ukjent [18,27,32].
Vi først undersøkt uttrykk for ErbB3 på normal eller svulst prostata vev. Farging for ErbB3 N-ter ble rettet mot membranen, uten atom uttrykk. Ved hjelp av ErbB3 C-ter-antistoff, ble nukleær farging vi observert begrenset til PCA-celler og ble øket i avansert kastrering resistent prostatakreft i forhold til lokaliserte tumorer. Disse dataene styrke engasjementet atom ErbB3 protein ved PCA progresjon opp til terminal kastrering-resistente scenen [18]. Som vi ikke klarte å oppdage kjernefysiske farging i CRPC med anti ErbB3 N-ter antistoffer, antok vi at den kjernefysiske ErbB3 protein kan være en variant, etter modell av de tidligere omtalte ErbB3
80kDa eller ErbB3
50 kDa isoformer [16 , 17]. ErbB3 proteinekspresjon vurderes på normale og tumorprostatacellelinjer bekreftet vår hypotese, med full lengde reseptoren ErbB3
185kDa hovedsakelig uttrykt i det ikke-kjerneproteinfraksjon fra alle cellelinjer og en ErbB3
80kDa isoform hovedsakelig påvist i kjerneprotein fraksjon av tumorcellelinjer. Til dags dato, ble bare den fulle lengde ErbB3
185kDa protein rapportert i kjernen av prostata tumorer og cellelinjer [15,19]. Mekanismene for kjernefysiske lokalisering analysert så langt involvert ruting fra endosomer og /eller membran cleavage følgende reseptor aktivering [5-7, 32-36]. Siden ErbB3
185kDa er tyrosin kinase mangelfull, sin fosforylering skjer ved dimerisering med andre medlemmer av ErbB familien [37].
