Abstract
Siden endringer i basalmembranene er de kritiske indikatorer for å skille normal, forstadier og kreft colonic vev, er avgjørende for tidlig diagnose og behandling av tykktarmskreft direkte visualisering av disse signalene. Her presenterer vi at andre harmoniske generasjon (SHG) mikroskopi kan undersøke endringer av basalmembraner i ulike colonic kreft stadier. Våre resultater viser også evnen til å bruke de kvantitative analyser av bilder for å kvantifisere disse endringene i forskjellige kreft stadier. Disse resultatene tyder på at SHG mikroskopi har potensiale i etikett-fritt avbildning av endringer av basalmembraner for effektivt å skille mellom normale, forstadier, og kreft colonic vev. Så vidt vi vet, er dette den første demonstrasjonen av dynamikken i basalmembran endringer i ulike colonic kreft trinn med helt iboende kilde til kontrast
Citation. Zhuo S, Yan J, Chen G, Shi H, Zhu X Lu J et al. (2012) Etikett-Free Imaging av basalmembraner skiller Normal, Forstadier og Krefttykktarms vev ved Second-Harmonic Generation Mikros. PLoS ONE 7 (6): e38655. doi: 10,1371 /journal.pone.0038655
Redaktør: Mitsunobu R. Kano, University of Tokyo, Japan
mottatt: 13 januar 2012; Akseptert: 8. mai 2012; Publisert: 08.06.2012
Copyright: © 2012 Zhuo et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Prosjektet ble støttet av Program for Changjiang Scholars og Innovativ Research team i University (Grant No. IRT1115), Foundation National Natural Science of China (Grant nr. 60908043, 30970783, 81101209), og Foundation Natural Science of Fujian-provinsen (Grant Nos . 2011J01341, 2010J01136, 2010J01321). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Kolon kreft er en av de viktigste årsakene til sykdom og død hos mennesker [1]. Generelt er det lett behandles dersom diagnosen i en av de pre-invasive stadier [2], [3]. Imidlertid er påvisning av tidlige lesjoner fremdeles en utfordring. Med colonic kreftutvikling, ondartede celler endre basalmembraner (grensesnittene krypten og lamina propria), for eksempel variasjoner i basalmembran størrelse og tetthet, tap av basalmembran [4], [5]. Endringer i kjelleren membranen er blant de viktigste indikatorene for tykktarmskreftutvikling [5], [6]. Men disse signalene har så langt bare vært påvises ved histologisk undersøkelse av biopsier [4], [7]. Derfor, utvikling av nye og ikke-invasiv
in situ
avbildningsfunksjonalitet for undersøkelser disse signalene er av stor medisinsk betydning.
Kolon slimhinnene inneholder krypten, basalmembran, og lamina propria, som vist i fig. 1. Det er også sett i figur 1 at
en face
delen av tykktarmsslimhinnen kan samtidig observere krypten, basalmembran, og lamina propria. Siden krypten består hovedsakelig av søyle epitelceller og slimceller som ikke er effektiv i å generere signaler andre harmonisk generering (SHG) og lamina propria er sammensatt hovedsakelig av kollagen som er i stand til å sende ut kraftige SHG-signaler [8] – [10], SHG mikroskopi kan være nyttig for undersøkelser endringer av basalmembran som ikke er tilgjengelig for andre bildediagnostikk. SHG mikroskopi er en ikke-lineær optisk teknikk og har fordelene ved å være etikett-fri, iboende tredimensjonale oppløsning, nær-infrarøde eksitasjon for overlegen optisk gjennomtrengning, lavere photodamage, og i stand til å gi kvantitativ informasjon [11] – [15]. Til nå er det ingen rapporter å teste potensialet i denne teknikken for etikett-fritt visual basalmembranene som indikatorer for å skille normal, forstadier og kreft colonic vev, og dette er hva som motiverte oss til å utføre dette arbeidet ved hjelp av denne teknikken.
Resultater
patologi Resultater
av de 72 colonic biopsier fotografert, 20 ble diagnostisert som normalt, 28 med adenom, og 24 med adenokarsinom. For statistisk analyse, ble vevsprøver delt inn i normal sak (n = 20), forstadier til kreft (adenom, n = 28), og kreft (adenokarsinom, n = 24).
Bilder SHG
for å undersøke endringene av basalmembraner i forskjellige colonic krefttrinn, er det representative en face SHG bilder fra normal, forstadier, og cancerøse colonic vev henholdsvis vist i fig. 2. Som forventet, kan SHG avbildningsteknikk vel visual omrisset av basalmembraner (røde sirkler). Det fremgår av fig. 2 at store morfologiske forskjellene i omrisset av basalmembranene er observert i ulike colonic kreft stadier. I normalt tilfelle er en honeycomb ordning av firkantformede faste basalmembraner med ensartet størrelse observert. I forstadium for kreft, er de rørformede formede basalmembraner med større størrelse og en nedre befolkningstetthet erholdt sammenlignet med normaltilfellet. I kreft, er basalmembranene som finnes i vanlig tilfelle mangler.
Kvantitativ analyse av basalmembraner
Tabell 1 viser gjennomsnittet og SD av sirkelen lengden av basalmembran og befolkningen tettheten av basalmembraner for normale, forstadier til kreft, og kreft colonic vev. I detalj er den sirkel lengden av basalmembran i normal 342,7 ± 27,2 um (n = 60 områdene 20 biopsier), i forstadium for kreft er 695,8 ± 79,1 um (n = 84 områdene 28 biopsier), og i kreft er 1767,8 ± 166,3 um (n = 72 områdene 24 biopsier). I tillegg er befolkningstettheten av basalmembraner i normal 103,2 ± 10,6 /mm
2 (n = 60 områder av 20 biopsier), i forstadier til kreft er 27,1 ± 6,3 /mm
2 (n = 84 områder av 28 biopsier), og i kreft er 0,3 ± 1,2 /mm
2 (n = 72 områder av 24 biopsier). Disse resultatene presentere sirkelen lengden av basalmembran og befolkningstettheten av basalmembraner variabler som viste signifikante forskjeller (
P
0,05) mellom normal, forstadier og kreft vev kategorier basert på unparired Wilcoxon Rank Sum tester .
Diskusjoner
Dette arbeidet presenterer at SHG mikros effektivt kan undersøke endringer av basalmembraner i ulike colonic kreft stadier. Spesielt gjør SHG mikros identifisering av to morfologiske funksjoner (sirkelen lengden av basalmembran, befolkningstettheten av basalmembraner), som viser signifikante forskjeller i ulike colonic kreft stadier. Disse observasjonene er bestå med immunohistokjemiske Resultatene (vist i fig. 3), og også bekrefter det faktum [4], [16] som før kreft blir invaderende, ved trinn som er kjent som forstadium for kreft, ondartede celler endre omrisset av basalmembranen, men gjør ikke ødelegge kjelleren membran; som kreft blir invasive, ondartede celler (ingen SHG signaler) erstatte kollagenfibre, som fører til tap av basalmembran.
Som nevnt, er SHG mikros stand til etikett-fritt bildebehandling endringer av basalmembraner i forskjellig kolon krefttrinn og, som sådan, kan fungere som en
in situ
histologisk verktøy som er fri fra den merkekravet av konvensjonelle metoder. Videre, basert på bildeanalyse, var vi i stand til å få noen kvantitativ informasjon i ulike kreft stadier. Således gir SHG mikros oss både en morfologisk, så vel som kvantitativt, verktøyet ved å undersøke endringene av basalmembraner i forskjellige koloncancer stadier. Det viktige med denne evne skyldes det faktum at endringer av basalmembran spiller en viktig rolle i kolon kreftutvikling [5], [6], og disse endringene har hittil bare vært påvises ved histologisk undersøkelse av biopsiprøver [4], [7]. SHG mikros gjør det mulig å observere disse variasjonene, og måle dem muliggjør basalmembran størrelse og befolkningstetthet som skal bestemmes. Disse resultatene indikerer løftet av SHG avbildning for klinikker, og som et biomedisinsk forskning verktøy for å studere dynamikken i basalmembran endringer i forskjellige koloncancer stadier. Videre bør det påpekes at selv om de inflammatoriske lesjoner ble ikke ansett i dette arbeidet, må avbildnings SHG være i stand til å skille mellom kreft og inflammatoriske lesjoner på grunn av tap av basalmembraner i cancervev. I denne sammenheng, ser man at SHG mikroskopi har potensiale i etikett-fritt visualisere endringer av basalmembraner som indikatorer for å differensiere normale, forstadier, og kreft i kolon vev.
Som konklusjon, dette arbeidet viser mulighetene for SHG mikros å merke-fritt bilde endringer av basalmembraner, inkludert basalmembran størrelse og befolkningstetthet, de viktigste indikatorene for tykktarmskreftutvikling. Så vidt vi vet er dette første gang for å vise hvordan SHG bildebehandling kan brukes til å kvantitativt visualisere dynamikken i kjelleren membran endringer i ulike colonic kreft stadier. I det videre arbeidet, vil en storstilt undersøkelse skal gjennomføres for å fastslå sensitivitet, spesifisitet, negativ prediktiv verdi, positiv prediktiv verdi i forhold til tradisjonelle histologisk analyse. Fordelen med denne teknikken over konvensjonelle diagnostiske prosedyrer er at vev ikke er pålagt å gjennomgå slicing, parafin embedding, eller fryse-tine prosess, og dermed reservere potensialet i
in vivo
imaging. Med evnen til å kvantifisere de basalmembran endringene som vist i denne studien, er det påregnelig at en SHG-basert endoskopi [17] – [19] kunne legge til rette for og nytte
in vivo
studier og diagnose i årene som kommer.
Materialer og metoder
vevsprøve
i alt 72 friske colonic biopsiprøver ble innhentet fra trettito pasienter gjennomgikk endoskopisk biopsi. Før studere deltakelse, alle pasienter inngikk et informert samtykke, og denne studien ble godkjent av Institutional Review Board of Fujian Provincial Tumor Hospital. Den biopsi prøven ble plassert i Glass Bottom Dish (Mattek, dekkglass: 0,085 til 0,13 mm) for SHG bildebehandling. I dette arbeidet ble prøven fremstilling og SHG avbildning fullføres innen en time etter endoskopisk biopsi.
Imaging Instrumentation
SHG-mikroskopi ble oppnådd ved anvendelse av et ikke-lineært optisk system som er blitt beskrevet tidligere [20] . I korte trekk, ble SHG bilder anskaffet ved hjelp av en kommersiell laser scanning mikroskopisk bildesystem (Zeiss LSM 510 META, Jena, Tyskland) koblet til en femtosecond Ti: safir laser (Coherent Mira 900-F) som opererer på 800 nm. Polarisasjonsretningen av laserlyset er den horisontale polarisasjon. En oljeneddyppingsobjektivet (x 63 og NA = 1,4) ble anvendt for å fokusere den magnetisering strålen i vevsprøver (gjennomsnittlig effekt mindre enn 15 mW) og ble også brukt til å samle de tilbakespredte iboende SHG signaler. Bildene ble tatt på 2,56 mikrosekunder per piksel. En fin fokusering trinn (HRZ 200 stadium, Carl Zeiss) benyttes for å oversette de prøver etter xy skanning av prøvene for å oppnå et stort område bilde, og for å forandre fokuspunktet for opptak av forskjellige optiske seksjoner.
histologi Analyse
etter SHG bildebehandling, vevsprøvene ble fiksert i 10% formalin og forberedt for patologisk undersøkelse ved hjelp av standardprotokoller. H E-fargede seksjoner og seksjoner farget av primære antistoffer mot kollagen IV ble oppnådd fra hver prøve, og gjennomgått av en sertifisert patolog
Kvantifisering av basalmembraner
For ytterligere å kvantifisere endringer. basalmembranene i ulike colonic kreft stadier, tre 415 mikrometer ved 490 nm rektangulære områder i hver biopsi ble valgt for kvantitativ analyse. I dette arbeidet ble to utførte analyser. Først målte vi den sirkel lengden av basalmembran. Videre, for bedre å skildre denne verdi, hvis det er et tap av basalmembraner, sirkelen lengden av basalmembran ble satt til sirkelen lengden av den valgte rektangulært tverrsnitt. For det andre, beregnet vi det totale antall basalmembraner per arealenhet, det vil si befolkningstettheten i basalmembraner. I dette arbeidet ble utført hver kvantitativ analyse på alle de undersøkte biopsier.
Statistiske analyser
Kvantitative data ble oppsummert med gjennomsnitt og standardavvik (SD), vist som «gjennomsnitt ± SD» . Oppsummerende statistikk for sirkelen lengden av basalmembran og befolkningstettheten av basalmembraner (relatert til patologisk besluttsomhet) oppstår fra flere seksjoner fra hver av de 72 colonic biopsiprøver tatt fra trettito pasienter. Ved anvendelse av statistisk analyse, den målinger fra enkelte delene ble antatt å utgjøre uavhengige observasjoner. med dataene i denne studien (preget av tilsynelatende homogenitet av verdier innenfor de diagnostiske kategoriene), ble mer komplekse statistiske teknikker anses unødvendig da de ikke ville endre eksempel midler, og heller ikke ville de fører til større utvalgsstandardavvik. i dette arbeidet ble Wilcoxon rank-sum tester utføres for å fastslå om det er betydelige forskjeller i sirkelen lengden av basalmembran og befolkningstettheten av basalmembraner mellom normal, forstadier og kreft vev (uparet sammenligning ). Metriske Wilcoxon tester ble valgt for uparet sammenligning på grunn av den lille størrelsen på utvalget. Nøyaktig
P
-verdier ble beregnet, og forskjellene ble ansett for å være statistisk signifikant når
P
-verdier var mindre enn 0,05.
Takk
forfatterne ønsker å takke redaktøren og to anonyme lesere for deres konstruktive kommentarer, som var svært nyttig for å styrke presentasjon av dette papiret.
