Abstract
I de senere årene betydelig oppmerksomhet har blitt gitt til bruk av naturlige stoffer som kreftmedisiner. Det naturlig antioksidant dipeptid L-karnosin tilhører denne klassen av molekyler, fordi det har vist seg å ha vesentlig anticancer-aktivitet både in vitro og in vivo. Tidligere studier har vist at L-karnosin inhiberer proliferasjonen av humane tykk- karsinomceller ved å påvirke ATP- og Reactive Oxygen Species (ROS) produksjon. I denne studien identifiserte vi Hypoksi-induserbar faktor 1α (HIF-1α) som et mulig mål for L-Carnosine i HCT-116 cellelinje. HIF-1α protein er overuttrykt i mange typer av kreft hos mennesker, og er den viktigste årsaken til resistens mot legemidler og stråling i faste tumorer. Av spesiell interesse er eksperimentelle data som støtter konseptet at genereringen av ROS gir en redoks-signal for HIF-1α induksjon, og det er kjent at noen antioksidanter er i stand til å undertrykke tumorgenesen ved inhibering av HIF-1α. I denne studien fant vi at L-Carnosine reduserer HIF-1α proteinnivået påvirker dens stabilitet og reduserer HIF-1 transkripsjonen aktivitet. I tillegg viste vi at L-Carnosine er involvert i ubiquitin-proteasome system fremme HIF-1α degradering. Til slutt sammenlignet vi antioksidantaktiviteten av L-karnosin med at av to syntetiske anti-oxidant bis-diaminotriazoles (nemlig 1 og 2, henholdsvis). Til tross for disse tre forbindelser har den samme evne til å redusere intracellulære ROS, 1 og 2 er mer potente passiveringsmidler, og har ingen effekt på HIF-1α ekspresjon og kreftcelle proliferasjon. Disse funnene tyder på at en analyse av L-Carnosine antioksidant veien vil avklare mekanismen bak den anti-proliferative virkningene av dette dipeptid på tykktarmskreftceller. Men selv om den molekylære mekanismen som L-Carnosine ned regulerer eller hemmer HIF-1α aktivitet ikke er ennå klarlagt, kan denne evnen være lovende i behandling av hypoksi-relaterte sykdommer
Citation. Iovine B, Oliviero G, Garofalo M, Orefice M, Nocella F, Borbone N et al. (2014) The Anti-proliferativ effekt av L-Carnosine korrelerer med en redusert uttrykk for hypoksi induserbar faktor en alpha i Human Colon kreftceller. PLoS ONE 9 (5): e96755. doi: 10,1371 /journal.pone.0096755
Redaktør: Sabato D’Auria, CNR, Italia
mottatt: 17 mars 2014; Godkjent: 05.04.2014; Publisert: 07.05.2014
Copyright: © 2014 Iovine et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av «Finanziamento per l’Avvio di RICERCHE originali», Università degli Studi di Napoli Federico II, GO. «Progetti di Ricerca di Rilevante Interesse Nazionale» bevilgning 2009 fra den italienske Minis dell’Università e della Ricerca, GO NB GP. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
L-carnosin (β-Ala-His) er et naturlig forekommende histidin dipeptid, endogent syntetisert og utbredt seg i samme hjerne, muskel, nyre, mage, og, i store mengder, i skjelettmuskel. Dette dipeptid har vist seg å utføre en rekke biologiske funksjoner, inkludert anti-oksydant aktivitet, evne til å chelatere metallioner, hemming av protein glykosylering, anti-inflammatorisk og anti-senescence egenskaper [1]. Et annet aspekt av effekten av L-karnosin dreier seg om sin anti-proliferativ effekt i humane cellelinjer. Nylig har vi vist at L-karnosin inhiberer proliferasjonen av human kolorektal karsinom HCT-116-celler ved å påvirke ATP- og ROS produksjon og ved å indusere cellesyklusarrest i G1 fase [2]. I tillegg har noen forfattere, med en proteomikk tilnærming, støtter den mulighet at dette dipeptid påvirker tumorcellevekst i de humane gliomceller og hemmer tumorvekst in vivo i en NIH3T3-HER2 /neu musemodell via en innblanding i proteinfolding /prosessering og HIF-1α signale [3] – [4]. Egentlig har betydelig innsats vært rettet til oppdagelsen av den kjemiske eller naturlige molekyler som er rettet mot HIF-1α protein og regulere HIF-1α signalveien gjennom en rekke molekylære mekanismer, inkludert transkripsjonsregulering, stabilisering, fornedrelse og trans. Av spesiell interesse er rollen til ROS og antioksidanter molekyler i HIF-1α regulering. Faktisk, en serie av forbindelser, så som rapamicin og resveratrol, har vist seg å være inhibitorer av HIF-1α [5] – [6]. HIF-1α er en komponent av HIF-1-komplekset som spiller en sentral rolle i O
2 homeostase og, faktisk, er ansett som en sentral regulator av tilpasnings responsene til kreftcellene for å hypoksi [7]. HIF-1 komplekset er en heterodimere transkripsjonsfaktor som består av O
2-regulert HIF-1α og konstitutivt uttrykt HIF-1β subenheter. Under normoksisk forhold isoformen prolylhydroksylase PHD2 hydroxylates HIF-1α på to funksjonelt uavhengige prolinresidier, Pro
402 og Pro
564, innenfor ODD (oksygenavhengig nedbrytning) domene [8] – [9]. Hydroksylerte Pro rester fremme rekruttering av HIF-1α av Von Hippel-Lindau tumor suppressor protein (VHL), en erkjennelse modul av E3-ubikvitin-ligase, som er ansvarlig for dens ubiquitinering og påfølgende proteasom-mediert degradering [10]. Under hypoksiske forhold HIF-1α protein rømming til proteolyse, er oppregulert, og danner en heterodimer med HIF-1β i HIF-1-komplekset. Den HIF-1-komplekset gjenkjenner og binder seg til den hypoksi følsomme element (HRE) av hypoksi-induserbare gener, inkludert gener som påvirker angiogenese, jern metabolisme, modulering av glukosemetabolisme, celleproliferasjon, overlevelse, og invasjon, for derved å aktivere deres transkripsjon [ ,,,0],11]. I de senere årene har HIF-1 dukket opp som et lovende mål for kreftbehandling. Faktisk, HIF-1α over-ekspresjon er et felles trekk ved humane kreftformer, hvor det medierer tilpasning til den hypoksiske tumormikromiljøet. I samsvar med disse observasjonene, hensikten med denne studien var å undersøke i HCT-116-cellelinjen virkningene av L-karnosin på ekspresjon av HIF-1α og HIF-1α avhengige gener. I tillegg, i de senere år av særlig interesse har det vært rolle ROS og antioksidant molekyler i HIF-1α regulering [12]. Derfor, for å forstå mekanismene som er ansvarlig for den L-Carnosine effekten vi har også undersøkt hvordan dette dipeptide påvirker ROS intracellulære nivåer sammenlignet med to nye anti-oksiderende bis-diaminotriazole forbindelser (nemlig 1 og 2 henholdsvis) tilgjengelig fra våre laboratorier og som antioksidant aktivitet er upublisert. Til tross for disse tre forbindelser har den samme evne til å redusere intracellulære ROS, har vi funnet at 1 og 2 har ingen virkning på HIF-1α ekspresjon og kreftcelle proliferasjon. Vi antar at antioksidantaktiviteten av L-karnosin opererer med en annen mekanisme enn forbindelsene 1 og 2. Således kan vi konkludere med at en analyse av den L-karnosin antioksydant veien vil klargjøre mekanismen bak effekten av dette dipeptid på tykktarmskreftceller.
Materialer og metoder
Cell Culture
HCT-116 human kolorektal kreft cellelinje ble kjøpt fra American Type Culture Collection (ATCC) USA. Cellelinjen ble dyrket ved 37 ° C og 5% CO
2 i DMEM (Dulbeccos modifiserte Eagle-medium) som er kjøpt fra BioWhittaker klassisk Cell Culture Media, Lonza – VWR International srl, supplert med 10% føtalt bovint serum (FBS) ( Gibco Laboratories, North Andover, Massachusetts) og 1% penicillin /streptomycin (Gibco Laboratories).
Kjemisk Syntese av bis-triazol forbindelser 1 og 2
De to forbindelser ble fremstilt ved en reaksjon av den tilsvarende syre (trans-trans-mukonsyre og fumarsyre, henholdsvis) med diaminoguanidine monohydroklorid i polyfosforsyre som dehydratiseringsmiddel, ved å følge prosedyren som allerede er beskrevet i [13]. De chlorohydrates 1 og 2 ble fremstilt som følger. Hver bis-diaminotriazole ble suspendert i vann. Fortynnet saltsyre (10 ml kons. I 100 ml vann) ble tilsatt, oppvarmet til koking inntil det faste stoffet var fullstendig oppløst. Etter avkjøling til romtemperatur, 2 ble oppnådd som brune, prismeaktige krystaller. I tilfelle av en, den chlorohydrate (blekt brune, prismeaktige krystaller) ble erholdt ved tilsetning av etanol til vannoppløsningen og avkjøling til romtemperatur. Strukturen av de chlorohydrates og protonering ved N-2 atom i ringen, i stedet for på aminogruppene, ble bekreftet ved enkeltkrystall-analyse (arbeid under forberedelse), og er i overensstemmelse med lignende resultater som er rapportert i [13].
behandlinger
L-karnosin, levert av Sigma-Aldrich Canada, ble løst i DMEM uten fenolrødt (Sigma-Aldrich). HCT-116-celler ble sådd ut ved en konsentrasjon på 3,0 x 10
6-celler i 100 mm plater. Etter inkubasjon i én dag ved 37 ° C i 5% CO
2, L-karnosin ble tilsatt fra 0,5 til 100 mM; cellene ble inkubert ved 37 ° C og høstet 24 timer etter. Behandlingen med bis-diaminotriazole forbindelser (1 og 2) ble utført under de samme betingelser ved bruk av konsentrasjoner fra 0,05 til 0,5 mM. For CoCl
2 behandling 100 mM CoCl
2 ble lagt til HCT-116 i 6 timer. MG132, levert av Calbiochem USA ble løst opp i dimetylsulfoksyd (DMSO) og tilsatt til kulturmediet. HCT-116-celler ble inkubert i 1 time før L-karnosin behandling [14]. 24 timer etter L-karnosin behandling ble cellene høstet for protein immunopresipitering.
fluorescensmikroskopi
HCT116-celler ble dyrket på objektglass i 24 timer og behandlet med 100 mM L-karnosin. Etter 24 timer ble cellene vasket med PBS og fiksert med kald 4% paraformaldehyd i PBS ved romtemperatur i 10 min og deretter ble permeabilisert med 0,4% Triton X100 i PBS 1X. Etter 10 minutter ble cellene vasket to ganger med PBS 1X /0,4% bovint serumalbumin (BSA) i en time ved romtemperatur. Cellene ble først behandlet med HIF-1 a-antistoffer (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) i PBS 1X /0,4% BSA i 1 time ved romtemperatur og deretter med Alexa 568 (Molecular Probes «Alexa Fluor 568) sekundære antistoffer i PBS 1X /0,4% BSA i 1 time ved romtemperatur i mørket. Etter vasking med PBS, ble cellene farget med monteringsmedium for fluorescens med DAPI (Vector Laboratories). Resultatene ble undersøkt ved fluorescens mikroskopi på en Zeiss Axiophot på 40X oppløsning.
antioksidantaktivitet Måling av DPPH Method
DPPH (1,1-difenyl-2-picrylhydrazyl) leskende metoden ble benyttet for evalueringen av antioksidantaktiviteten av 1, 2 og L-karnosin [15]. Muligheten av prøvene for å absorbere den DPPH radikal ble målt ved hjelp av Brand-Williams metoden [16]. Aliquoter (60 ul) av 1 mM oppløsning av 1, 2 og L-karnosin ble tilsatt til 3 ml DPPH-oppløsning (6 x 10
-4 M) og absorbansen ble bestemt ved 515 nm (Philips PU 8620 serie UV /synlig spektrofotometer) hver 5 min inntil den stabile tilstand. For hver antioksidant analysen ble en alikvot Trolox brukt til å utvikle en 50-500 mM standardkurve. Alle data ble deretter uttrykt som ekvivalenter Trolox (TE mmol /L).
Analyse for celleviabilitet
MTT-analysen ble utført i henhold til protokollen som tidligere rapportert [17]. HCT-116-celler ble sådd ut i en tetthet på 1 x 10
5-celler i 96-brønners plater. Deretter ble bis-diaminotriazole forbindelser (1 og 2) ble analysert ved bruk av konsentrasjoner fra 0,05 til 0,5 mM. Etter 24 timers inkubering, 10 ul av 3- (4,5-dimetyltiazol-2-yl) -2,5-difenyl-tetrazolium-bromid (MTT) (Sigma Aldrich) (0,05 mg /ml) ble tilsatt til kulturmediet. Etter 4 timer ved 37 ° C i kulturmediet ble fjernet og 200 pl DMSO ble tilsatt for å oppløse saltene av formazan. Absorbansen ble målt med en 96-brønner plate spektrofotometer ved 570 nm. Eksperimentene ble utført tre ganger uavhengig av hverandre, og hvert forsøk inneholdt trippel replikater. Kontrollprøver inneholdende en komplett dyrkingsmedium fritt for celler eller kontrollceller uten L-karnosin ble også inkludert i hvert eksperiment.
klonogene Assay
HCT116-celler ble sådd ut ved en tetthet på 500 celler /brønn i 12-brønners plater i 500 ul friskt kulturmedium inneholdende komplett DMEM med 20-50-100 mM L-karnosin eller bis-diaminotriazole forbindelser (1 og 2) (fra 0,05 til 0,5 mM). Etter 7 dager ble cellene vasket to ganger med PBS 1X og farget med en oppløsning av 0,2% krystallfiolett, 50% metanol og 10% eddiksyre i H
2O i 30 minutter ved romtemperatur. Deretter ble cellene vasket med avionisert H
2o og fotografert.
Måling av reaktive oksygen arter (ROS)
Dannelsen av ROS ble evaluert ved hjelp av 2,7-dichlorofluorescein -diacetate probe (H2DCF-DA) (kjøpt fra Sigma-Aldrich). HCT-116-celler ble sådd ut ved en tetthet på 5 x 10
3 celler /brønn i 96-brønners plater i 100 ul friskt kulturmedium inneholdende DMEM uten fenolrødt. Celler ble tillatt å vokse i 24 timer ved 37 ° C i 5% CO
2, da L-karnosin (fra 0,5 til 100 mM) eller forbindelser 1 og 2 (fra 0,05 til 0,5 mM) ble tilsatt til kulturmediet . ROS tiltaket ble utført i henhold til protokollen som tidligere rapportert [18]. Fluorescens ble overvåket ved hjelp av en LS 55 fluorescens spektrometer (Perkin-Elmer Ltd., Beaconsfield, England). I hvert forsøk ble fluorescensen målt økning i tre replikate kulturer for hver behandling.
Transfeksjon-analysen og luciferase reporter Assay
Cellene ble transfektert med hypoksi responselement (HRE) -luciferase reporter plasmid eller med en vektor inneholdende den oksygenavhengig nedbryting (ODD) domene av HIF-1α, ved hjelp av Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Darmstadt, Tyskland) i det serumfrie OptiMem-1-medium (Lonza, Verviers, Belgia), i henhold til produsentens spesifikasjoner. Kulturer ble holdt ved 37 ° C i 5% CO
2 i 24-48 timer. Luciferase aktivitet ble evaluert av Dual-luciferase reporter analysen system (Promega, Madison WI, USA) og med en Promega GloMax 20/20 Luminometer, i henhold til produsentens spesifikasjoner.
Utarbeidelse av Total, Nuclear og cytosolprotein ekstraktene
Total ekstrakter av HCT-116 ble fremstilt 24 timer etter behandling med L-karnosin fra 0,5 til 100 mM, eller med en eller to fra 0,05 til 0,5 mM. Prøvene ble vasket to ganger med iskald PBS 1X og sentrifugert ved 240 g i 10 min ved 4 ° C. Cellepelleten ble resuspendert i en kald lyseringsbuffer inneholdende 1% Triton X100, 0,1% SDS, 0,1% NaN
3, 100 mM NaCl, 50 mM NaF, 0,1 mM Na
3VO
4, 10 mM Nappis, 0,5 mM PMSF og 10 ug /ml aprotinin, leupeptin og pepstatin ved 4 ° C i 30 min på is. Cellelysatene ble sentrifugert ved 20.000 g i 10 min ved 4 ° C. For cytosolisk og nukleære ekstrakter HCT116-celler ble høstet, vasket to ganger med iskald PBS 1X og sentrifugert ved 240 x g i 10 minutter ved 4 ° C. Cellepelleten ble resuspendert i 100 ul iskald hypotonisk lyseringsbuffer (10 mM HEPES pH 7,9, 10 mM KCl, 1 mM PMSF, 0,1 mM EDTA, 0,1 mM EGTA, 1 mM DTT, 1 mM Na
3VO
4, 10 ug /ml hver av aprotinin, leupeptin og pepstatin) og inkubert med risting ved 4 ° C i 15 min. Deretter ble cellene lysert ved å tilsette 5% NP40. Den cellulære ekstraktet ble sentrifugert i 5 minutter ved 500 x g og supernatanten inneholdende den cytosoliske fraksjon ble deretter oppnådd etter ytterligere sentrifugering i 10 min ved 20.000 x g.
nukleær pellet ble resuspendert i høy salt ekstraksjonsbuffer ( 20 mM HEPES pH 7,9, 0,4 M NaCl, 1 mM PMSF, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 1 mM DTT, 10 ug /ml hver av aprotinin, leupeptin og pepstatin) og inkubert med risting ved 4 ° C i 15 min . Den kjernefysiske Ekstraktet ble deretter sentrifugert i 15 minutter ved 20.000 x g, og supernatanten ble alikvotert og lagret ved -80 ° C. Proteinkonsentrasjonen ble bestemt ved en Bio-Rad proteinanalysesett (Bio-Rad Laboratories). For western blot-analyse ble proteinene erholdt utfordret med antistoffer mot HIF-1α (kanin-polyklonalt antistoff fra Santa Cruz Biotechnology), aldolase A (ABNOVA), aldolase C (kanin-polyklonalt antistoff fra Santa Cruz Biotechnology) og β-aktin (mus monoklonalt fra Santa Cruz Biotechnology). Signalene ble detektert ved hjelp av ECL-sett (GE Healthcare).
Immunoutfelling
HCT-116 celler ble lysert i RIPA-buffer (50 mM Tris-HCl pH 8,0, 250 mM NaCl, 0,1 % SDS, 1% NP-40, 1% natriumdeoksycholat, 5 mM EDTA, og 1 mM DTT) supplementert med proteasehemmere. Prøvene (800 ug) ble forbehandlet med 30 ul protein A /G PLUS-Agarose (Santa Cruz Biotechnology) i 2 timer ved 4 ° C. Den anti-HIF-1α antistoff (kanin-polyklonalt antistoff fra Santa Cruz Biotechnology) ble tilsatt til lysatet og inkubert over natten ved 4 ° C og deretter 30 ul protein A /G PLUS-agarose ble tilsatt til lysatet. Etter 1 time ved 4 ° C proteinene ble gjenfunnet i Laemmli buffer, vedtok 8% denaturering gel og deretter utsatt for immunoblotting.
Real-time PCR-analyse
Total RNA ble fremstilt fra HCT -116 celler ved bruk av RNeasy mini kit (Qiagen), og ble brukt til å syntetisere cDNA med tilfeldige primere og hexanucleotide MultiScribe revers transkriptase (Invitrogen) ved 48 ° C i 1 time. CDNA ble så forsterket i en iCycler iQ real time PCR deteksjon system (Bio-Rad Laboratories) med iQTM SYBR Grønn Supermix (Bio-Rad Laboratories). Real-Time PCR reaksjoner og relativ kvantifisering genuttrykk ble utført som rapportert i [19]. Forholdet mellom 2
-ΔΔ
CT
før behandling med L-karnosin og de som er beregnet for prøvene inkubert med L-karnosin fra 5 til 100 mM blir uttrykt som brette endringer.
statistisk analyse
Resultatene ble uttrykt som gjennomsnitt ± SDS (standardavvik) av tre uavhengige eksperimenter. Den statistiske analysen ble utført ved anvendelse av enveis variansanalyse og ANOVA P-verdi for en multippel sammenligningstest. Nivået av statistisk signifikans ble definert som ** p 0,001, *** p 0,0001 [2]. Analysene ble utført ved hjelp av GraphPad PRISM programvare (versjon 3.0, GraphPad Software, Inc .: La Jolla, CA, USA, 2002) på en Windows-plattform
Resultater
L-Carnosine Reduserer HIF. -1α proteinnivåer som påvirker dens stabilitet i HCT-116 celler
for å kunne fastslå virkningen av dipeptidet L-karnosin på ekspresjon av HIF-1α transkripsjonsfaktor, humane tarm karcinomceller (HCT-116) ble behandlet med forskjellige konsentrasjoner av L-karnosin (fra 0,5 til 100 mM). Spesielt RT-PCR-analyse, 24 timer etter L-karnosin tillegg, viste en stabil tilstand av HIF-1α mRNA nivåer, sammenlignet med ubehandlede kontrollceller (figur 1A). Neste, vi evaluert effekten av L-Carnosine på HIF-1α protein uttrykk i HCT-116 celler ved western blot analyse. De proteinnivåer ble undersøkt både i hypoksi og normoxia, så vel som i nærvær (fra 0,5 til 100 mM) og fravær av L-karnosin. I HCT-116-celler normoksisk, 50-100 mM L-Carnosine redusert ekspresjon av HIF-1α sammenlignet med en kontrollprøve ikke er behandlet med L-karnosin (figur 1B). Vi observerte også at den hypoksi-indusert (ved CoCl
2) ekspresjon av HIF-1α ble redusert etter behandling med 50 eller 100 mM L-karnosin (figur 1C). Blottene ble gjen probet med antistoffer mot β-actin å bekrefte proteinet belastning ekvivalens. For å bekrefte reduksjon av HIF-1α vi utført en immunoprecipitation analyse. Vi fant at den HIF-1α-antistoff immunpresipitatet inneholdt betydelige nivåer av HIF-1α protein bare i kontrollprøven (figur 2A). I tillegg, undersøkte vi effekten av L-karnosin ved HIF-1α proteinsyntese i celler behandlet med cykloheksimid (CHX). Analysen av HIF-1α proteinstabilitet i CHX-behandlede celler viste at nivået av HIF-1α redusert i L-Carnosine behandlede celler (50-100 mM), noe som tyder på at L-karnosin påvirker HIF-1α proteinstabilitet (fig. 2B). Videre undersøkte vi om dette dipeptid kan være involvert i proteasomet nedbrytning av HIF-1α. Derfor har vi undersøkt ved western blot-analyse av effekten av proteasominhibitor MG132 på HIF-1α proteinnivåer etter behandling med 50-100 mM L-karnosin. Som vist i figur 2C, ved behandling med 1 mM MG132 og L-karnosin i 24 timer økte HIF-1α proteinnivå sammenlignet med ubehandlede kontrollceller, eller til celler behandlet med MG132 alene. En ytterligere indikasjon for involvering av L-Carnosine i HIF-1α proteasome nedbrytning ble oppnådd ved transfeksjon av en vektor inneholder ODD domene av HIF-1α. Som vist i figur 2D, redusert luciferaseaktiviteten merkbart 24 timer etter behandling med L-karnosin (100 mM).
(A) HIF-1α mRNA ble målt ved hjelp av sanntids-PCR i en total RNA-preparat fra HCT -116 celler 24 timer etter L-Carnosine behandling. Hvite linjer indikerer brette forandringer av mRNA med hensyn til mengden av HIF-1α mRNA i ubehandlede celler er rapportert som en verdi; (B) Western blot-analyse av totale proteinekstrakter fra HCT-116-celler 24 timer etter L-karnosin og (C) L-karnosin og CoCl
2 behandling probet med HIF-1α og p-aktin-antistoffer. Relaterte histogrammer rapportere densitometriske verdiene av HIF-1α /β-actin ratio. De densitometriske verdier representerer gjennomsnittet ± SDS av tre uavhengige eksperimenter. Forskjellene ble vurdert signifikant på ** p 0,001, *** p 0,0001
(A) Western blotting-analyse undersøkt med anti-HIF-1α antistoff av immunoutfelt proteiner i HCT-116.; (B) western blotting analyse av totale proteinekstrakter fra HCT-116 celler 24 timer etter L-Carnosine (100 mm) eller L-Carnosine (100 mm) pluss 10 mM cycloheximide (CHX) behandling undersøkt med HIF-1α og β-actin antistoffer. Relaterte histogrammer rapportere densitometriske verdiene av HIF-1α /β-actin ratio; (C) western-blotting-analyse av totale proteinekstrakter fra HCT-116-celler 24 timer etter L-karnosin (100 mM) eller L-karnosin (100 mM) pluss 1 mM MG132 behandling probet med HIF-1α og p-aktin-antistoffer. De densitometriske verdier representerer gjennomsnittet ± SDS av tre uavhengige eksperimenter. Forskjellene ble vurdert signifikant på ** p 0,001, *** p 0,0001; (D) Skjematisk fremstilling av ODD-LUC reporter vektor. ODD-LUC Vektoren inneholder den oksygenavhengig nedbryting (ODD) domene av HIF-1α klonet oppstrøms fra luciferasegenet. Luciferase-aktiviteten ble målt 48 timer etter transfeksjon og representerer middelverdien ± SDS av tre uavhengige eksperimenter. Verdiene har blitt rapportert som prosentandeler av luciferase aktivitet sammenlignet med 100% av ubehandlede celler.
L-Carnosine Influence HIF-1α Nuclear Trans redusere transkripsjonen aktivitet av Hypoksi Responsive Element (HRE) og Expression av nedstrøms Gener
Stabilisert HIF-1α protein translocates fra cytoplasma til kjernen hvor det dimerizes med HIF-1β danner transkripsjonelt aktiv HIF-1-komplekset. Derfor er den nukleære lokalisering av HIF-1α essensiell for den transkripsjonelle aktivitet av HIF-1α. Effekten av L-Carnosine på den intracellulære lokalisering av HIF-1α ble analysert ved et første skritt ved western-blotting analyse ved bruk av cytoplasmiske og kjerneproteinfraksjoner, og deretter ved immunofluorescens-analyse. Som vist i figur 3A og 3B, L-karnosin påvirker den translokasjon av HIF-1α fra cytoplasma til kjernen. Faktisk, når HCT-116 celler ble behandlet med L-Carnosine atom protein nivåer av HIF-1α redusert merkbart, mens cytosoliske nivåene ikke ble berørt. Også i immunofluorescens-analyse (figur 3C) den HIF-1α signal i L-karnosin behandlede celler var svakt detekterbar sammenlignet med ubehandlede kontrollceller, eller for å CoCl
2-behandlede celler. I kreftceller, aktivering av HIF-1 kompleks innebærer tilknytningen med HRE motiv i de regulatoriske regioner av målgener som er involvert i glykolysen prosessen. Av denne grunn ble HCT-116-celler transient transfektert med den HRE-luciferase reporter plasmid. Som vist i figur 3D, ved behandling med 100 mM L-karnosin forårsaket merkbar nedgang i luciferase-aktivitet (24 timer etter behandlingen). Deretter vurderte vi mRNA av noen HIF-1a-avhengige gener. Vi målt ved hjelp av RT-PCR-analyse effektene av forskjellige konsentrasjoner av L-karnosin (0,5, 5, 50 og 100 mM) på mRNA-nivåer av aldolase A og PDK-1. Som vist i figur 4B, aldolase A og PDK-1 mRNA-nivåer ble redusert etter behandling med L-karnosin, særlig mellom 50 og 100 mM. Western blot-analyse av aldolase A viste også en reduksjon i proteinnivå (figur 4C). I tillegg observerte vi at ekspresjonen av glut-1-proteinet, så vel som av aldolase C-protein, ble redusert etter L-karnosin behandling (figur 4D og 4E). Aldolase C er en hjerne-spesifikk isoformen av aldolase, men nylig har det blitt demonstrert at mRNA nivået av aldolase C er 30 ganger høyere i humane magecancercellelinjer. Oligonukleotid-sekvensene anvendt i RT-PCR-analyser er gjengitt i figur 4A.
(A) Western blotting-analyse av cytosolisk og (B) kjerneproteinekstrakter fra HCT-116-celler 24 timer etter 20-50-100 mM L-Carnosine behandling undersøkt med HIF-1α, β-aktin og Histone H3 antistoffer. Relaterte histogrammer rapportere densitometriske verdiene av HIF-1α /β-aktin og HIF-1α /H3-forhold. De densitometriske verdier representerer gjennomsnittet ± SDS av tre uavhengige eksperimenter. Forskjellene ble ansett signifikant ved *** p 0,0001; (C) HCT-116 behandlet med CoCl
2 og 100 mM L-Carnosine for 24 timer undersøkt med fluorescens mikroskop ved 40x forstørrelse ved hjelp av filtre for sekundært antistoff mot HIF-1α protein og for 4′-6′-diaminodino-2 -phenylindole (DAPI); (D) Skjematisk fremstilling av HRE-LUC reporter vektor. HRE-LUC-vektoren inneholder ni gjentatte sekvenser av den Hypoksi responselement (HRE) klonet oppstrøms fra luciferasegenet. Luciferase-aktiviteten ble målt 48 timer etter transfeksjon og representerer middelverdien ± SDS av tre uavhengige eksperimenter. Verdiene har blitt rapportert som prosentandeler av luciferase aktivitet sammenlignet med 100% av ubehandlede celler
(A) Tabellen rapporterer primer sekvenser som brukes i Real Time PCR eksperimenter.; (B) aldolase A og PDK-1 mRNA
S ble målt med real time PCR i en total RNA forberedelse fra HCT-116 celler 24 timer etter L-Carnosine behandling. Linjene indikerer fold forandringer av mRNA
S i forhold til mengden av aldolase A og PDK1 mRNA i ubehandlede celler er rapportert som en verdi; (C), (D) og (E) Western-blotting-analyser av det totale proteinekstrakter fra HCT-116-celler 24 timer etter L-karnosin behandling probet med aldolase A, Aldolase C, GLUT-1 og p-aktin-antistoffer. Histogrammer rapportere densitometriske verdier av aldolase A /β-aktin-forhold, aldolase C /β-aktin-forhold og GLUT-1 /β-aktin-forhold. De densitometriske verdier representerer gjennomsnittet ± SDS av tre uavhengige eksperimenter. Forskjellene ble vurdert signifikant på ** p 0,001, *** p 0,0001
antioksidant effekten av forbindelser 1 og 2 Sammenlignet med L-Carnosine
Den generasjonen. reaktive oksygenforbindelser (ROS) under hypoksi gir en redox signal for HIF-1α induksjon. Faktisk noen forfattere definerer ROS som positive regulatorer av HIF-1α [20]. Observasjonen at andre antioksidantene kan påvirke nivået av HIF-1α protein ledet oss til å evaluere antioksidantaktivitet av to nye bis-diaminotriazole forbindelser (1 og 2) (figur 5A), i forhold til at av L-Carnosine, av DPPH analyse. Først målte vi prosentandelen av DPPH inaktivering ved hjelp av en 1 mM konsentrasjon for alle forbindelser, og vi viste at forbindelsene 1 og 2 har en stor aktivitet som ROS åtseletere i forhold til L-Carnosine (se tabell i figur 5B). Deretter undersøkte vi den intracellulære ROS generasjon indusert av L-karnosin (100 mM) i HCT-116-celler og sammenlignet med mengden av ROS som genereres ved behandling av den samme cellelinje med forskjellige konsentrasjoner (fra 0,05 til 0,5 mM) av forbindelsene 1 og 2. Som vist i figur 5C, ved behandling med, 0,1 og 0,5 mM 1 og 2 reduseres den intracellulære ROS generasjon i HCT-116 med omtrent 40-50%, på samme måte som 50-100 mM L-karnosin. Til slutt, evaluerte vi også effekten av forskjellige konsentrasjoner av 1 og 2 (fra 0,05 til 0,5 mM) på HIF1-α ekspresjon og cellelevedyktigheten. Som vist i figurene 6A og 6B, har tilsetning av 1 og 2 ikke påvirker HIF-1α proteinnivåer og heller ikke celleproliferasjon. I tillegg har vi evaluert ved klonogene overlevelses analysen evnen til HCT-116-celler til å proliferere og danne en stor koloni eller en klon i nærvær av L-karnosin, eller 1 eller 2 (figur 6C). 50 mM L-karnosin betydelig redusert antall kolonier i forhold til den ubehandlede kontrollprøven, mens forbindelsene 1 og 2 påvirket ikke cellene evnen til å danne kolonier ved den testede konsentrasjon. En strømningscytometri-analyse (FACS) bekreftet at en og to ikke påvirke cellesyklusen og induserte ikke apoptose i HCT-116-celler (data ikke vist). Den tidlige apoptotiske død hastighet i HCT-116-celler behandlet med de to forbindelser var ikke signifikant forskjellig fra kontrollprøven
(A) Kjemiske strukturer av forbindelser 1 og 2.; (B) Antioxidant aktiviteten av L-karnosin, 1 og 2 målt av DPPH-metoden som beskrevet i avsnitt 1.2.4; (C) ROS produksjon evaluert 24 timer etter tilsetningen av L-karnosin, 1 og 2 i HCT-116-celler ved sonden 2 «, 7»-dichlorofluorescein-diacetat (H2DCF-DA). Alle verdier representerer gjennomsnittet ± SDS av tre uavhengige forsøk og er uttrykt som en prosentandel i forhold til 100% av kontrollceller. Forskjellene ble vurdert signifikant på ** p 0,001, *** p. 0,0001
(A) Western blotting-analyse av det totale proteinekstrakter fra HCT-116 celler etter behandling med forbindelser 1 og 2 analysert med HIF-1α og p-aktin antistoffer. Histogrammer rapportere densitometriske verdiene av HIF-1α /β-actin ratio. De densitometriske verdiene representerer gjennomsnitt ± sikkerhetsdatablad av tre uavhengige forsøk; (B) den celleformering ble målt ved MTT-analyse i HCT-116-celler 24 timer etter behandling med forbindelser 1 og 2. Alle verdiene representerer gjennomsnitt ± SDS av tre uavhengige forsøk og er uttrykt som en prosentandel i forhold til 100% av kontrollcellene ; (C) klonogene overlevelsestest hos HCT-116 etter behandling med L-karnosin (50 mM) eller forbindelsene 1 og 2 (0,5 mM) i forhold til ubehandlede celler.
diskusjon
i denne studien evaluerte vi virkningen av L-karnosin behandling på HIF-1α aktivitet i humane tarmkreftceller. [28].
