Abstract
microRNAs (Mirs) er en ny klasse av små RNA-molekyler, kan feilregulering som bidrar til kreft. En kombinatoriske tilnærming ble brukt til å identifisere Mirs som fremmer prostatakreft progresjon i et unikt sett av prostatakreftcellelinjer, som stammer fra foreldre p69 cellelinje og utvide til en svært tumorigent /metastatisk M12 underlinjen. Sammen er disse cellelinjene antatt å etterligne prostatakreft progresjon
in vivo
. Forrige nettverksanalyse og MIR arrays antydet at tapet av HSA-MIR-125b sammen med overekspresjon av HSA-MIR-22 vil kunne bidra til prostata tumorgenese. Den feilregulering av disse to Mirs ble bekreftet i humane prostata tumorprøver i forhold til tilstøtende godartet kjertel epitel samlet gjennom laser capture mikrodisseksjon fra radikale prostatectomies. Faktisk, endringer i HSA-MIR-125b uttrykk syntes å være et tidlig hendelse i tumorigenesis. Omvendt fase microarray proteomikk analyser viste ErbB2 /3 og nedstrøms medlemmer av PI3K /AKT og MAPK /ERK stier samt PTEN å være protein målene forskjellig uttrykt i M12 svulst celle i forhold til sin foreldre p69 cellen. Relevante luciferase + 3′-UTR uttrykk studier bekreftet en direkte interaksjon mellom HSA-MIR-125b og ErbB2 og mellom HSA-MIR-22 og PTEN. Restaurering av HSA-MIR-125b eller hemming av HSA-MIR-22 uttrykk via en antagomiR resulterte i en endring av M12 svulst celle atferd
in vitro
. Dermed dual action av HSA-MIR-125b som en tumor suppressor og HSA-MIR-22 som en oncomiR bidratt til prostata tumorigenesis av modulasjoner i PI3K /AKT og MAPK /ERK signalveier, hovedveier kjent for å påvirke prostata kreft progresjon.
Citation: Budd WT, Seashols-Williams SJ, Clark GC, Weaver D, Calvert V, Petricoin E et al. (2015) Dobbel handling av MIR-125b Som en tumor suppressor og OncomiR-22 Fremmer Prostate Cancer tumorigenesis. PLoS ONE 10 (11): e0142373. doi: 10,1371 /journal.pone.0142373
Redaktør: Natasha Kyprianou, University of Kentucky College of Medicine, USA
mottatt: 9 juli 2015; Godkjent: 21 oktober 2015; Publisert: 06.11.2015
Copyright: © 2015 Budd et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Datatilgjengelighet: Data fra fullt mikroRNA rekke skjerm av disse prostata cellelinjer har blitt levert av SJS-W som en doktorgradsavhandling til Virginia Commonwealth University bibliotek (VCU10886). Dataene er tilgjengelige fra NCBI Gene Expression Omnibus og tilgjengelig gjennom GEO som tilgangsnummer GSE49520
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av National Cancer Institute, Grant Antall R21CA152349 til ZEZ. Den Funder gitt støtte i form av lønn for KOH, men ikke har noen ekstra rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere eller utarbeidelse av manuskriptet. De spesifikke roller denne forfatteren er artikulert i «forfatterens bidrag» -delen
Konkurrerende interesser:. Midlene støtten endret ikke forfatternes tilslutning til PLoS ONE politikk på deling av data og materialer
Innledning
Transformation, vekst og bloduttredelse av kreftceller resultater fra en rekke genetiske og epigenetiske modifikasjoner. I det siste tiåret har det vært en økende mengde litteratur rapporterer at avvikende uttrykk for microRNAs (Mirs) bidrar til utvikling av flere kreft hos mennesker [1-8]. Mirs er en viktig klasse av ikke-kodende RNA som påvirker post-transkripsjonelle proteinnivåer, og i nærvær av ytre signaler og miljømessige belastninger, har evnen til å fremkalle raske forandringer i proteome slik at cellen til å reagere i en mer nøyaktig og energi effektiv måte [2-5]. En rekke cellulære prosesser er påvirket av Mirs, inkludert differensiering, vekst /hypertrofi, cellesykluskontroll og apoptose [5,6].
feilregulert Mirs har vist seg å bidra til onkogenesen av tapet av tumorundertrykkende Mirs eller økt uttrykk for oncomiRs [1,9,10]. Enten tap av tumor suppressors eller økt uttrykk av oncomiRs slutt resulterer i økt cellevekst, spredning, invasivitet eller metastasering. Avvikende ekspresjon av en eneste MIR har potensialet til å påvirke et stort antall av cellulære prosesser, som hver MIR kan påvirke flere hundre nedstrøms proteiner, som fortrinnsvis regulerer viktig nøkkel-cellesignalering noder og transkripsjonsfaktorer [11]. Nettverk analyse viser at målene for Mirs har en betydelig høyere node grad enn tilfeldig valgte gener [11,12]. Forstyrrelse av disse svært sammenvevd molekyler påvirker celle helse fører til sykdom.
Derfor synes det nødvendig å integrere flere kilder til biologisk informasjon for å forstå de forstyrrelsene som ligger til grunn en gitt patologi fra en systemnivå. Høye throughput teknologier som DNA microarray, genomsekvensering, reversfaseemulsjoner proteomikk, og QRT-PCR profilering tillate samtidig kjøp av tusenvis av datapunkter. Skjæringspunktet mellom flere datakilder øker sannsynligheten for å identifisere viktige veier som er involvert i kreft initiering, progresjon og metastasering. Dette arbeidet beskriver et unikt kombinatorisk tilnærming for å forstå effekten av MIR feilregulering på prostatakreft progresjon. Selv om Mirs har blitt observert å være assosiert med prostatakreft, er det ikke en klar enighet om spesifikke Mirs som bidrar til onkogenesen [7,8].
A novel isogene prostatakreft-cellelinje progresjon modellen ble brukt som det er tenkt å nøye etterligne tumorprogresjon som det skjer
in vivo product: [13,14,15]. Integrering av MIR kvantifisering profiler og proteomikk data har potensial til å øke suksessen med å identifisere nye Mirs påvirker tumorigenesis. Derfor data generert fra MIR arrays, Reverse Phase Mikromatrise (RPPA) proteomikk, sammen med informasjon fra en tidligere nettverk analyse ble brukt for å rangere feilregulert Mirs i vår prostatakreft progresjon modell [12,16-18]. Antatte dysregulerte Mirs ble ytterligere bekreftet i RNA isolert fra pasientenes radikale prostatektomi tumorprøver ved hjelp av laser capture mikrodisseksjon [LCM] [19,20]. Flere feilregulert Mirs som potensielt driver prostatakreft progresjon ble identifisert [18,21]. Av disse Mirs, ble viktigheten av HSA-MIR-125b (MIR-125b) og HSA-MIR-22 (MIR-22) til tumorigenesis ytterligere bekreftet av
in vitro
eksperimenter. MIR-125b og MIR-22 kan være nyttig som relevante biomarkører for å identifisere og stadium prostatakreft.
Materialer og metoder
Utledning av Prostata cellelinjer og cellekultur
p69 , M2182, og M12 celler var en gave fra Dr. Joy Ware, Virginia Commonwealth University, Richmond VA, og autentisert bruker STR-analyse [13,14]. Disse cellelinjer ble avledet ved immortalisering av en ikke-neoplastisk prostata epitel med SV40 stort T-antigen [13]. Foreldre (P69) cellelinje er dårlig tumorigent, og ikke-metastatisk med et lavere modal kromosom nummer enn de fleste andre prostatakreft cellelinjer vanligvis isolert fra metastaser (LNCaP, DU145 og PC3). En
in vivo
utvelgelsesprosessen ble brukt til å lage celler med økt tumorigenicity og metastatisk potensial. Etter tre runder med subkutane injeksjoner i mannlige atymiske nakne mus, en svært tumorigen og metastatisk variant (M12) ble isolert, som rutinemessig metastasizes på intra-prostatahyperplasi injeksjon [14]. Den M2182 cellelinjen ble avledet etter to runder med
in vivo
utvalg og representerer derfor en mellom fenotype som er mindre tumorigent enn M12 celler og er ikke-metastatisk. Celler ble holdt i kultur ved 37 ° C i mindre enn to måneder i RPMI1640 medium med L-glutamin (Gibco), supplert med 5% føtalt bovint serum, 0,05 mg /ml gentamycin, 5 ug /ml insulin, 5 ug /ml transferrin, og 5 mikrogram /ml selen (ITS fra Collaborative Research Bedford, MA) [13,14,19]. M12-celler som stabilt transformert med en pSIREN plasmid vektor (Clontech) uttrykker Mir-125b (M12 + MIR-125b) ble opprettholdt med puromycin (100 ng /ml) [19,22]. M12-celler som stabilt transformert med en miARREST
™ miR22-3p inhibitor (M12 + MIR-22i) uttrykk plasmid (pEZX-AM03) fra GeneCopoeia (HmiR-AN0332-AM03) ble opprettholdt med hygromycin (200 mikrogram /ml). Etter trypsinering (0,25% i EDTA), ble cellene pelletert, vasket med PBS, flash-frosset i flytende nitrogen, og lagret ved -80 ° C inntil den ble brukt.
cellepellet RNA ekstraksjon
Total RNA ble ekstrahert fra frosne celle pellets ved hjelp av Mirvana
™ Mir isolasjonsmetoden (ambion-Life Technologies) i henhold til produsentens instruksjoner. Etter isolering ble RNA konsentrasjon beregnes ved hjelp av en Biorad
® Smart Spec
™ 3000 spektrofotometer, fortynnet til en konsentrasjon på 100 ng /ml og lagret ved -80 ° C.
Cell Pellet DNA Extraction
DNA ble ekstrahert fra frosne celle pellets bruker QIAamp DNA mini kit fra Qiagen (kat. nr 51304) etter produsentens anvisninger. Etter ekstraksjon DNA-konsentrasjon ble målt som ovenfor.
Onco Bibliotek og sekvense metode
DNA-bibliotekene ble generert fra cellelinjer ved hjelp av Ion AmpliSeq
™ Bibliotek Kit 2.0 og Ion AmpliSeq
™ Cancer hotspot Panel v2 (kat. nr 4480441 og 4475346). Kreft Hotspot Panel er et enkelt fragment pool som forsterker 207 amplikonene dekker over 2800 COSMIC mutasjoner fra 50 kjente onkogener og tumorsuppressorgener. Hver prøve ble fremstilt ved 10 ng av innspill DNA i henhold til Ion AmpliSeq
™ Bibliotek Forberedelse protokollen (Publication delenummer MAN0006735 Revisjons A.0). Ion Xpress
™ Strekkode Adaptere 1-16 Kit (Cat. No. 4,471,250) ble benyttet for enkelt prøve barcoding og adapter ligering. Agencourt AMPure XP magnetiske kuler (kat. Nr A63882, Beckman) ble benyttet som angitt i Ion AmpliSeq
™ Bibliotek Forberedelse brukerhåndboken. Eksempel på bibliotekene ble kvantifisert ved hjelp av qubit 2,0 fluorometer og High Sensitivity dsDNA Assay Kit (Cat. No. Q32851) og normalisert til en konsentrasjon på 100 pM. Emulsion PCR ble utført på Ion OneTouch
™ 2 Instrument (kat. Nr 4474778) som angitt i Ion PGM
™ Mal OT2 200 Kit (publikasjonsnummer MAN0007220 Revision 5.0.) Ved hjelp av Ion PGM
™ mal OT2 200 Kit (Kat. nr 4480974). Normaliserte 100 pM eksempelbiblioteker ble slått sammen og kombinert med OT2 reagenser og Ion Sphere Partikler (ISP). Reaksjonen ble kjørt på OT2 ved bruk av 200 bp-protokollen. Prøvene ble deretter behandlet for berikelse på Ion OneTouch
™ ES. Anriking av leverandører ble oppnådd ved hjelp av Ion PGM
™ Mal OT2 200 Kit (Kat. Nr 4480974) og DYNABEADS MyOne streptavidin C1 perler (Kat. Nr 65001 Life Technologies) i henhold til produsentens protokoller (Ion PGM
™ Mal OT2 200 Kit brukerhåndbok). De streptavidin C1 kuler binder seg spesifikt til beriket leverandører, slik at alle andre å vaskes bort, etterfulgt av eluering med en natriumhydroksyd og Tween smelte løsning. Den Ion Torrent Personal Genome Machine (PGM) ble initialisert med Ion PGM
™ Sequencing 200 Kit v2 i henhold til produsentens anbefalinger (Ion PGM
™ Sequencing 200 Kit v2: Publikasjonsnummer MAN0007273 Revision 3.0). Kontroll perler ble tilsatt i den anrikede perle prøven, ble sekvenseringsprimere glødet til Internett-leverandører og polymerase lagt. ISPer ble sekvensert utnytte en Ion Torrent Ion 318
™ Chip. Den Ion Torrent PGM ble kjørt i henhold til Ion Torrent 200 Kit v2 spesifikasjoner utnytte 500 nucleotide strømmer, etterfulgt av justering til HG19 referanse og analysert av Ion Torrent Variant Caller plugin.
TaqMan
® basert MIR analyse
Verifisering av modne MIR uttrykk ble bekreftet ved hjelp av TaqMan
® Mir metodikk (Life Technologies, Grand Island, New York). cDNA ble syntetisert i en 25 ul reaksjonsvolum fra total RNA (20 ng) ved å benytte TaqMan
® mikroRNA Reverse Transcription kit. Reaksjoner ble inkubert ved 16 ° C i 30 min, 42 ° C i 30 minutter, og inaktivert ved 85 ° C i 5 minutter. Hver cDNA ble analysert i tre eksemplarer av kvantitativ PCR (QRT-PCR) med sekvensspesifikke primere HSA-MIR-125b-1 (ID 000449), HSA-MIR-22-3p (ID 000398) eller RNU48 (ID 001006) i en Applied Biosystems 7300 real-time PCR instrument (Life Technologies). Hver enkelt assay ble utført i en 20 ul reaksjonsvolum med 1,33 mL av cDNA, 1,0 ul spesifikk MIR assay, 10 ul TaqMan
™ Universal Master Mix PCR II uten AmpErase UNG og 7,67 mL av nuklease fritt vann. Reaksjoner ble inkubert ved 50 ° C i 2 minutter, etterfulgt av 10 minutter ved 95 ° C og 40 sykluser med denaturering i 15 sekunder ved 98 ° C, og annealing /forlengelse for 60 sek ved 60 ° C. Data ble analysert ved hjelp av SDS programvare v1.3.1 (Life Technologies). Terskel og baseline innstillingene ble angitt i henhold til protokoll anbefalinger, med baseline korreksjon mellom sykluser 3 og 12 og en automatisk terskel.
Statistisk analyse av QRT-PCR data
Relative mengder Mir nivåer ble bestemt ved hjelp av to
-ΔΔCT metode for Livak et al etter normalisering med RNU48 som en standard referanse [23]. Alle prøver ble utført i triplikat og gjennomsnittet syklus grensen (C
T) -verdien ble bestemt fra C
T-verdier i området fra 25 til 35. Den gjennomsnittlige C
T ble normalisert ved å subtrahere den gjennomsnittlige C
T av RNU48 (A C
T). Alle prøver ble sammenlignet med den parentale cellelinje P69 ved å subtrahere den eksperimentelle A C
T fra A C
T verdien for p69-cellelinjen som kalibrator. Data er presentert som gjennomsnitt ± standardavvik av 3 uavhengige eksperimenter. Statistiske analyser ble utført i Microsoft
® Excel programvare-plattform, ved hjelp av en uavhengig t-test, forutsatt lik varians mellom de to gruppene. Statistisk signifikans ble definert som p ≦ 0,05.
Laser Capture mikrodisseksjon (LCM)
svulst og godartet prostata vev ble oppnådd fra radikal prostatektomi prøver, etter godkjenning fra Virginia Commonwealth University (VCU), Kontor for forskning og innovasjon, Institutional Review Board (IRB), Panel A. Fire prøver ble frosset vev fra VCU vev og datainnsamling og analyse Kjerne (TDAAC på https://www.pathology.vcu.edu/research/TDAAC) og en arkiv FFPE prøven var fra VCU Department of Pathology [19,22]. Menneskelig vev, pasient samtykker, og kliniske data ble levert av VCU TDAAC kjernefasiliteten og Institutt for patologi med pasient samtykker. Alle pasientprøver ble avidentifisert å beskytte pasientens konfidensialitet. Slides (10-20) ble generert og gjennomgått av et styre sertifisert patolog (ED) med kompetanse innen prostatakreft diagnose for å identifisere prostata adenokarsinom foci versus normal kjertel epitel samt hyperplastisk kjertel epitel (BPH), prostata intraepitelial neoplasi (PIN) og stroma fra en unik pasientprøve. Prostatic adenokarsinom ble gradert i henhold til Gleason gradering systemet [24]. Kort sagt ble 8 um vevssnitt plassert på uladede glass, dehydrert med progressivt økende konsentrasjoner av etanol, og farget med hematoksylin og eosin (H Dako Cytomation Carpinteria, CA) koblet med den katalyserte signalforsterkningssystem (CSA; Dako Cytomation Carpinteria, CA), en kommersielt tilgjengelig tyramide-baserte avidin /biotin amplifisering kit, ble anvendt for å forsterke påvisning av signalet. Fluorescerende deteksjon ble oppnådd ved å bruke IRDye 680RD streptavidin (LI-COR biovitenskap, Lincoln, NE) i henhold til produsentens anbefaling. Antistoff og Sypro Ruby fargede objektglass ble skannet på en Tecan laserskanner (TECAN, Mönnedorf, Sveits) med 620 nm og 580 nm vekt lengde kanal hhv. Bilder ble analysert med MicroVigene Programvare versjon 5.1.0.0 (Vigenetech, Carlisle, MA) som tidligere beskrevet [16]. Totalt sett, cellular lysat ble oppdaget på 111 lysbilder og hver inkubert med en unik antistoff. Data ble returnert på et Microsoft Excel-regneark som inneholder hver celletype analysert med hvert antistoff av interesse.
Statistisk analyse av RPPA data
Microsoft Excel ble brukt til å utføre en to-utvalgs lik varians T -test for å sammenligne protein expression data mellom M12 og p69 cellelinjer. Totalt 45 verdier ble gjennomsnitts-beregnet for hvert antistoff probet proteinprøven. En streng sannsynlighetsverdi av p = 0,001 ble anvendt for å korrigere for variasjon blant flere prøver, og til å identifisere virkelig vesentlige endringer. De rapporterte signifikante endringer ble omdannet til brette endringer ved å dividere den gjennomsnittlige ekspresjon av proteinet i M12-cellelinje ved den gjennomsnittlige ekspresjon av proteinet i den sammenlignende p69-cellelinjen.
Resultatene
Neste Generation Sequencing av prostatakreft cellelinjer
p69, M2182, og M12 cellelinjer representerer et unikt sett av genetisk relaterte prostatakreftcellelinjer foreslått som en progresjon modell duplisere de molekylære hendelser som oppstår i løpet av prostata tumorgenesis
in vivo product: [13,14,15]. M12 cellelinjen er en svært tumorigent /metastatisk variant avledet fra foreldre p69 cellelinje med M2182 cellelinje som viser en mellomliggende, men ikke-metastatisk fenotype. I motsetning til andre etablerte menneskelige prostata cellelinjer som Du145 eller PC3 representerer cellulære endepunkter avledet fra sekundære svulster og dermed kan ikke sees på som en progresjon modell.
Neste generasjons sekvensering (NGS) analyse ble gjennomført for å identifisere potensielle nukleotidvariasjoner i gener som er kjent å være assosiert med kreft progresjon som kan ta hensyn til de fenotypiske forskjeller som vises av disse cellelinjene. Over 200000 lesninger ble oppnådd for hver sublinje med en midlere les lengde på ~ 110 nts i lengde (tabell 1). Katalog av somatiske mutasjoner i Cancer (COSMIC) beskriver over to millioner kodesekvensen punktmutasjoner identifisert i ulike kreftformer. Men det var bare tre COSMIC genmutasjoner identifisert i alle underlinjer (STK11-COSM29005, PGFRA- COSM22413 og APC-COSM19099) (tabell 2). Interessant, alle de kosmiske mutasjoner pluss ytterligere 11 nye mutasjoner var konsistente på tvers av alle medlemmer (P69, M2182 og M12) av prostata kreft celle progresjon modell. Det var en enkel overgang fra en tymidin til en cytosin i STK11 * genet, som ikke var til stede i M12 cellelinje, men siden dette er ikke en mutasjon kjent for å relatere til kreftrisiko, er det lite sannsynlig at det er ene og alene ansvarlig for de unike egenskapene til denne underlinjen. Dermed NGS analyse viste at det var ingen tidligere kjent kreft genmutasjoner som kunne står for de store forskjellene i tumorigenicity og metastase vises av disse relaterte cellelinjer.
Analyse av MIR Expression in prostatakreft cellelinjer
for å identifisere gener som kan bidra til de ulike tumorigen /metastatiske egenskapene til disse cellene, en Mir matrise skjerm med miRCURY LNA
™ Universal RT mikroRNA PCR system (Exiqon, Danmark) var utført i duplikat [18,21]. Selv om flere Mirs ble funnet å være dysregulerte, mest bemerkelsesverdige var differensial uttrykk for MIR-125b og MIR-22 [18,21]. Som prostata cellelinjer ble mer tumorigent videre fra foreldre p69 til M2182 og til slutt M12 celle, nivået av MIR-125b kraftig redusert, ≈ en 6-fold nedgang i uttrykk (Fig 1). I motsetning til dette, MIR-22 sannsynlig fungerte som en oncomiR med nivået på MIR-22 økte 3,5-ganger som cellene ble mer tumorgene og til slutt metastatisk. Interessant, i begge tilfellene skjedde mesteparten økningen i de tidlige fasene av tumorigenesis fra P69 til M2182 med bare små ytterligere endringer i overgangen fra M2182 til M12 celler.
Sammenligning av MIR-125b (grå) og Mir -22 (svarte) nivåer i RNA hentet fra p69, M2182 og M12 cellelinjer ved SYBR basert QRT-PCR som beskrevet i materialer og metoder. Brett forskjell ble beregnet som gjennomsnittet av tre uavhengige eksperimenter analysert i triplikat og normalisert til RNU48 (A C
T) som en intern kontroll, og uttrykt i forhold til den paren p69 cellelinje ved hjelp av sammenlignende C
T-metoden [23] . ANOVA testen viser en betydelig forskjell med en P-verdi 0,05.
MiR Expression i svulstvev RNA Hentet av LCM
For å bekrefte disse funnene observert med prostatakreft cellelinjer, ble Mir feilregulering vurdert i humane tumorer som oppnås etter radikal prostatektomi. Bestemmelse av molekylære endringer bidrar til patogenesen i prostata kompliseres av heterogenitet av vevet. Ofte er tumor i varierende Gleason score omgitt av normal kjertelvevet alt innebygd i stroma som nevnt (fig 2). Rene cellepopulasjoner kan bare oppnås fra et slikt heterogent vev med teknikker som LCM [19,20,25-29], noe som gjør det mulig for direkte visualisering og samling av utvalgte celler, noe som ga en ren kilde for RNA for nedstrøms analyser.
