Abstract
Menneskelig Nanog1 er en 305-aminosyre (aa) homeodomain holdig transkripsjonsfaktor avgjørende for pluripotency av embryonale stamceller (ES) og embryonal karsinom (EF) celler. Somatiske kreftceller hovedsakelig uttrykker en retrogene homolog av Nanog1 kalt NanogP8, som er ~99% lik Nanog på AA-nivå. Selv om spådd M.W av Nanog1 /NanogP8 er ~35 kD, har begge blitt rapportert å migrere, på Western blotting (WB), ved tilsynelatende molekylmassene 29-80 kD. Hvorvidt alle disse rapporterte proteinbåndene representerer autentisk Nanog proteiner er uklart. Videre har detaljerte biokjemiske studier på Nanog1 /NanogpP8 vært mangelfull. Ved å kombinere WB bruker 8 anti-Nanog1 antistoffer, immunoprecipitation, massespektrometri, og studier med rekombinante proteiner, her gir vi
direkte
bevis på at Nanog1 protein i NTERA-2 EC-celler eksisterer som flere MW arter fra ~22 kD til 100 kD sammen med en større 42 kD bånd detekterbar på WB. Vi deretter vise at rekombinant NanogP8 (rNanogP8) proteiner laget i bakterier ved hjelp av cDNA fra flere kreftceller også migrere, på denaturerende SDS-PAGE, på ~28 kD til 180 kD. Interessant, ulike anti-Nanog1 antistoffer utviser differensial reaktivitet mot rNanogP8 proteiner, som spontant kan danne høy M.W protein arter. Til slutt viser vi at de fleste langtids dyrkede cancercellelinjer ser ut til å uttrykke meget lave nivåer av endogen eller forskjellig NanogP8 protein som ikke lett kan påvises ved immunutfelling. Til sammen denne studien avdekker unike biokjemiske egenskaper Nanog1 i EC celler og NanogP8 i somatiske kreftceller
Citation. Liu B, Badeaux MD, Choy G, Chandra D, Shen jeg, Jeter CR, et al. (2014) Nanog1 i NTERA-2 og rekombinant NanogP8 fra Somatic kreftceller Adopter Flere Protein konformasjoner og migrere på flere M.W Species. PLoS ONE 9 (3): e90615. doi: 10,1371 /journal.pone.0090615
Redaktør: Rajvir Dahiya, UCSF /VA Medical Center, USA
mottatt: 12 januar 2014; Godkjent: 29 januar 2014; Publisert: 05.03.2014
Copyright: © 2014 Liu et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet delvis med tilskudd fra NIH (R01-CA155693), Department of Defense (W81XWH-13-1-0352), CPRIT (RP120380), den MDACC Senter for Cancer epigenetikk og RNA Senter Laura John Arnold Foundation Grant (D.G. Tang), og etter to senter Grants (CCSG-fem P30 CA166672 og ES007784). C. Jeter, M. Person, og C. Liu ble støttet delvis av CPRIT RP120394, CPRIT RP110782, og DOD post-doc (PC121553), henholdsvis. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:. Dr. Dhyan Chandra er en PLoS ONE Editorial styremedlem. Dette endrer ikke forfatternes tilslutning til PLoS ONE redaksjonelle retningslinjer og kriterier.
Innledning
Nanog1 (ofte kalt Nanog) er kodet av
Nanog
genet ligger på Chr . 12p13.31 (fig. S1A). Genet har 4 eksoner og koder for en homeodomain transkripsjonsfaktor som er avgjørende for den selvfornyelse av embryonale stamceller (ES) celler [1], [2]. Nanog1 overekspresjon i mus ES-celler (mESCs) overvinner behovet av leukemi-inhiberende faktor for å opprettholde pluripotency [1], [3], mens avbrytelse av
Nanog
resulterer i Mesc differensiering til extraembryonic endoderm [4]. Nedregulering av Nanog1 i humane ESCs (hESCs) fører også til tap av pluripotency og differensiering til extraembryonic celle-linjer [5]. Videre er det i forbindelse med andre reprogrammerings faktorer, overvinner Nanog1 reprogrammerings-barrierer og fremmer somatisk celle reprogrammerings [6], [7]. Dermed er Nanog1 en kjerne iboende element av transkripsjons nettverket for å opprettholde selvfornyelse av ESCs.
Menneske Nanog1 protein har 305 aminosyrer (aa) og 5 funksjonelle underdomener, dvs. N-terminal domene (ND ), homeodomain (HD), C1-terminalt domene (CD1), tryptofan-rik domene (WR) og C2-terminale domene (CD2) [8] – [11] (figur 1A).. ND er involvert i transkripsjon forstyrrelser og C-terminale regionen inneholder transkripsjonen aktivator. HD-domene er nødvendig for Nanog nukleære lokaliserings og transaktivering og WR-regionen medierer dimerisering av Nanog protein, noe som er nødvendig for pluripotency aktivitet [12], [13]. Av interesse, har menneskelig
Nanog
11 pseudo [14], blant annet
NanogP8
, som ligger på Chr. 15q14 har en fullstendig åpen leseramme [14], [15] (fig. S1B) som besitter et Alu element i 3′-UTR homolog med en i
Nanog1
gen, noe som tyder på at
NanogP8
er en retrogene snarere enn en pseudogen. NanogP8 har minst 6 konservert nukleotid (nt) forskjeller i forhold til Nanog1, noe som kan resultere i noen aa endringer [15].
(A) Skjematisk fremstilling av det humane Nanog protein og 8 anti-Nanog Abs anvendt i denne studere. Vist i parentes er epitoper av individuelle Abs. ND, N-terminale domene; HD, homeodomain; CD1 og CD2, C-terminale domene 1 og 2; WR, tryptofan-rik domene. Stjernen i ND indikerer Leu61 rest gjenkjent av eBioscience mAb (pil) kartlagt fra våre nåværende studier. (B-H) WB analyse i NTERA-2 NE (N, to forskjellige grupper) eller cytosol (C) med 8 anti-Nanog Abs. Individuell Ab er indikert på bunnen og M.W til venstre. Svart pilspiss, det spådd 35 kD Nanog protein; rød pilspiss, hoved 42 kD bånd; . Grønne pilene, flere band (spesielt etter lengre eksponeringer)
Interessant, mange somatiske kreftceller har blitt rapportert å uttrykke Nanog mRNA og /eller protein [15] – [46]. Flere begrensninger er forbundet med mange av disse studiene.
First
, på mRNA-nivået, grundige studier som anvender differensial RT-PCR i kombinasjon med sekvensering eller forskjellig sensitivitet til restriksjonsenzymet AlwN1 [15], [17], [31], [32], [34] [46], har vist at somatiske kreftceller fortrinnsvis uttrykke transkripsjon av
NanogP8
genet (fig S1B, jf. nedenfor) i stedet for
Nanog1
. Faktisk har vi observert at
nanog1
locus er forstummet i enkelte somatiske kreftceller [15]. Vår sekvense analyser viser at embryonal karsinom (EF) NTERA-2 celler uttrykker
Nanog1
men ikke
NanogP8
mRNA mens alle somatiske kreftceller (6 forskjellige typer inkludert primær prostata svulst-avledet celler) viser 5 av de 6 nt forskjeller som er spesifikke for
NanogP8 product: [15]. Blant de 5 konserverte nt endringer i
NanogP8
, en (nt759) bør resultere i en en endring (Q253H) selv om noen kreftceller vise andre ikke-konserverte nt endringer (dvs. polymorfismer) som også kan føre til aa endringer (f.eks L61P for HPCa6) [15]. Å gjøre skillet mellom Nanog1 og NanogP8 er viktig fordi de to transkripsjoner er hentet fra egen genomisk loci og har forskjeller ved NT sekvens nivåer.
Second
, mange tidligere studier har vært bare trene seg uten sondering funksjonelle betydningen av NanogP8 ekspresjon i kreftceller. Ved hjelp av human prostatakreft (PCA) som en modell, har vi vist [15] som: 1) NanogP8 protein blir uttrykt som en gradient i PCA-celler med lett påvisbar atom NanogP8 i bare en liten brøkdel av PCA-celler; 2) NanogP8 protein-uttrykke celler øker i primær PCa sammenlignet med matchende godartet vev; 3)
NanogP8
mRNA og NanogP8 protein er beriket i CD44
+ og CD44
+ CD133
+ primære PCA celler; 4) shRNA-mediert knockdown av
NanogP8
hemmer tumor regenerering av prostata, bryst og tykktarm kreft celler; og 5) den tumor-hemmende effekter av
NanogP8
knockdown er forbundet med inhibering av celleproliferasjon og klonal ekspansjon av tumorceller og avbrytelse av differensiering. Våre nyere studier viser at induserbar NanogP8 uttrykk i bulk PCA celler er tilstrekkelig til å gi kreftstamcelle (CSC) egenskaper og fremme androgen-uavhengig PCa vekst [34] og at NanogP8 er beriket i udifferensiert (PSA
– /lo) PCa celler og dens knockdown forsinker utvekst av kastrering-resistente PCa [41]. Våre studier [15], [34], [41] peker på potensielle pro-onkogene funksjonene NanogP8.
Tredje
, den anslåtte Nanog1 og NanogP8 proteiner er ~99% identisk [15 ]. Følgelig er uttrykket «Nanog «ofte brukt generisk for å referere enten protein (som også er tilfelle i dette papir). Likevel, det spesielle ved de fleste kommersielt tilgjengelige anti-Nanog antistoffer (som alle ble reist mot Nanog1, tabell 1) for Nanog1 og spesielt for NanogP8 fortsatt uncharacterized. Derfor er det uklart om de antatte Nanog proteinbåndene vist på Western blotting (WB), hvor ofte bare et beskåret stripe vises, eller Nanog protein flekker vist i immunhistokjemi (IHC) virkelig representerer Nanog protein.
Endelig
, intrigere, selv om betinget molekylvekt på Nanog protein (for både Nanog1 og NanogP8) er ~35 kD, mange studier har rapportert mulige Nanog proteiner som migrerer, på SDS-PAGE, på tilsynelatende molekylvekt på 29 80 kD i ES, EC, og somatiske kreftceller (tabell 1) [2], [5], [17], [24] – [26], [46] – [59]. Enda mer puzzlingly, synes det samme antistoff ofte til å oppdage ulike «Nanog «proteinbåndene (tabell 1). Hvorvidt alle disse rapportert antatte Nanog proteinarter er sanne Nanog proteiner har ennå til å være
direkte
bestemt.
Denne studien ble gjennomført for å møte de to siste spørsmålene. Vi tilbyr første direkte bevis på at Nanog1 protein i NTERA-2 EC-celler migrerer på 30 til ca. 100 kD. Vi viser at rekombinante NanogP8 proteiner kan også overføre på ~28 kD til ~180 kD. Disse resultatene tyder på at Nanog1 /NanogP8 proteiner sannsynlig vedta flere konformasjoner. Vi endelig vise at de langsiktige dyrkede somatiske kreftceller synes å uttrykke svært lave nivåer av eller biokjemisk divergerende endogen NanogP8 slik at det ikke kan være lett immunopresipitert ned av de 8 kommersielle anti-NanogP8 antistoffer.
Materialer og Metoder
Cells og reagenser
Ulike menneskelige kreftcellelinjer, inkludert prostatakreft (PC3, Du145, LNCaP), brystkreft (MCF-7), tykktarmskreft (Colo320), og føflekkreft (WM -562) celler, ble erholdt fra ATCC (American Type Culture Collection, Manassas, VA) og dyrket i de anbefalte medium inneholdende 10% varme-inaktivert FBS (føtalt bovint serum). Teratokarsinomceller celler (NTERA-2, klone D; CRL-1973) ble kjøpt fra ATCC og dyrket i mTeSR ™ en medium (STEMCELL Technologies, Vancouver, Canada). Nuclear utvinning kit var fra Thermo Scientific (Rockford, IL). Åtte anti-Nanog primære antistoffer (ABS) ble oppnådd fra kommersielle selskaper (Tabell 1, Fig. 1A). Sekundær og kontroll Abs ble kjøpt fra Santa Cruz Biotechnology. ECL reagenser ble kjøpt fra PerkinElmer, Inc (MA, USA). Den nåværende forskning ikke involverer dyreforsøk eller mennesker (dvs. levende individer eller identifiserbare privat informasjon). Alle andre studier presentert her var de etterforsker initierte og ikke krever godkjenning fra andre kontrollorganer.
siRNA- og shRNA-mediert Nanog knockdown eksperimenter
For de siRNA knockdown eksperimenter (Fig. 2 ), brukte vi siGENOME SMARTpool siRNA mot humant Nanog1 og siCONTROL ikke-targeting sirnas hentet fra Dharmacon (Lafayette, CO). Celler belagt 24 timer tidligere på seks-brønns retter ble transfektert med sirnas bruker Lipofectamine 2000. 48 timer senere ble cellene høstet for WB eksperimenter.
(A) Nanog siRNA eksperimenter i NTERA-2 celler. NTERA-2-celler ble transfektert med en pool av Nanog-spesifikke sirnas i 48 timer, høstet, og brukes til å isolere NE for WB med Kamiya Ab. Den venstre og høyre panel representerer kort- og langtidseksponering (SE og LE, henholdsvis) filmer (Merk at nedre venstre panelet er den korteste eksponert film for å illustrere den betydelige knockdown av 42 kD band). Lamin A /C var lasting kontroll. UT, utransfekterte; NC siRNA, negativ kontroll (siCONTROL ikke-targeting) sirnas; Nanog siRNA, SMARTpool siRNA mot Nanog. Rød, svart og blå pilspisser viser de store 42 kD, mindre 35 kD og 48 kD protein band, henholdsvis som ble redusert ved Nanog knockdown. De grønne pilene viser til flere band som også viste reduksjon. (B) Den WB ble utført med CS anti-Nanog kanin pAb.
For shRNA Nanog knockdown eksperimenter, lentiviruses inkludert pLL3.7, Nanog-shRNA og TRC-shRNA ble produsert i 293ft emballasje celler (Clontech Laboratories, Mountain View, CA) med de modifiserte protokoller tidligere beskrevet [15], [60]. I korte, Geneticin valgt, tidlig-passasje 293ft celler (6 × 10
6/15 cm parabol) ble transfektert med RRE (6 mikrogram), REV (4 mikrogram) og VSVg (4 mikrogram) emballasje plasmider, sammen med en lentiviral vektor (6 pg) ved anvendelse av Lipofectamine 2000 for å utføre transfeksjon. Ved 36-48 timer ble virusinneholdende medium oppsamlet og friskt medium tilsatt. Etter ytterligere 12-24 timer av kultur, ble virussupernatantene igjen samlet, samlet, og ultrasentrifugert å produsere konsentrerte viral aksjer. Individuelle titere ble bestemt for GFP-merket virus ved hjelp av HT1080 celler. Den ikke-GFP merket TRC-shRNA-virus ble fremstilt i parallell og er tilordnet styre (pLL3.7) titer. Målceller ble sådd 24 timer tidligere og infisert på ca 50% celletetthet og høstet for
in vitro
eller
in vivo
eksperimenter 48-72 timer etter infeksjon.
Bakteriell uttrykk og rensing av rekombinante Nanog (rNanog) proteiner
NanogP8
eller
Nanog1
cDNA i kultivert NTERA-2, MCF-7, og LNCaP celler eller i primære humane PCa prøvene (HPCa1, HPCa5, og HPCa6) ble amplifisert ved RT-PCR ved anvendelse av LDF1 /LDR1 primere (LDF1 5′-TCTTCCTCTATACTAACATGAGT-3 «, 5′-LDR1 AGGATTCAGCCAGTGTCCA-3») og klonet inn i pCR2.1 [15]. De EcoRI /Noti- eller BamHI /Sall fragmentene inneholder Nanog kodende sekvens ble deretter subklonet inn i de samme områdene i enten Dyre 28a (+) eller Dyre 28b (+) bakteriell ekspresjonsvektor å generere His-merkede fusjonsproteiner. Etter at innsatsen verifisering ved restriksjonsenzymoppslutning analyse og DNA-sekvensering, ble plasmidene brukes til å transformere BL21 (DE)
3 kompetente bakterier for å uttrykke fusjonsproteinene. Nanog protein ble indusert med 0,5 mM IPTG i 3-6 timer ved 37 ° C og bakterielle pellet ble holdt ved -80 ° C. For rensing ble bakterie pellets inneholdende His-tagget Nanog protein lysert i lyseringsbuffer (50 mM NaH
2P0
4, pH 8,0, 300 mM NaCl, 10 mM imidazol, protease inhibitor cocktail, og 1 mg /ml lysozym ), lydbehandlet i 10 sekunder (en puls). Hans-merket Nanog i supernatanten ble renset ved nikkel perler per produsentens anvisninger (Qiagen).
WB ved hjelp av rekombinante proteiner (rNanog), helcelle lysat (WCL), eller kjerneekstrakt (NE)
rNanog proteiner ble oppnådd og renset som beskrevet ovenfor. WCL og NE (fra dyrkede celler) ble fremstilt som tidligere beskrevet [15]. 50-80 ug proteiner (rNanog og NTERA-2-NE) ble analysert ved 12,5% SDS-PAGE og gelene ble overført på en Immobilon-P overføring membran (Millipore, Bedford, MA). Membranen ble blokkert med 5% ikke-fett tørrmelk i TBST (10 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl og 0,1% Tween-20) i 1 time ved romtemperatur, og inkubert over natten ved 4 ° C med primært antistoff. Membraner ble vasket tre ganger med TBST-buffer og deretter inkubert i 1 time med 1:2000 sekundært antistoff, og utviklet med ECL Plus WB deteksjonsreagensen (PerkinElmer).
Immunoutfelling (IP)
Rekombinant proteiner (500 ug) eller NE (800 ug eller avhengig av eksperimentelle formål) ble inkubert med de angitte anti-Nanog antistoff over natten ved 4 ° C. Deretter ble oppløsningen inkubert med protein A /G-agarose (Sigma, MO, USA) i ytterligere 1 time ved 4 ° C. Etter inkubering, ble kulene vasket tre ganger med RIPA-buffer. Proteiner bundet til protein A-agarose ble eluert med SDS-PAGE lasting buffer og kokes i 8 minutter og utsatt for SDS-PAGE.
Dialyse refolding eksperimenter
For å isolere og rense store mengder rNanog, bakterielle pellet ble sonikert 6 ganger med 10 sekunders pulser. Ultralydbehandlingsoppløsningen ble sentrifugert ved 10.000 rpm i 15 minutter ved 4 ° C. Pelletene ble vasket med kald PBS tre ganger. Det utfelte materialet var inkluder kroppen av rNanog protein. Å oppløse inklusjonslegeme, var en buffer inneholdende 7 M urea brukes, og deretter ble oppløsningen ble underkastet dialyse mot bufferne på 1,5 M, 0,6 M, 0,3 M og 0,1 M urea (i 1,5 M NaCl, 10 mM Tris-HCl, pH 7,0). Dialyseoppløsningen ble underkastet SDS-PAGE for å bestemme eksistensen av oppløselig Nanog protein.
Nanog protein identifikasjon (ID) ved massespektrometri (MS) analyserer
Tre sett med MS-baserte protein ID-eksperimenter ble utført på enten rNanog proteiner eller NE fremstilt fra NTERA-2-celler. I
første
ID eksperiment, immunopresipitert vi en stor mengde NTERA-2 cell NE (ca. 2 mg totalt) med R D geit pAb. Etter vasking (3 ganger) med RIPA-buffer, ble proteinene bundet til protein G-agarose eluert med SDS-PAGE ladningsbuffer og kokt i 8 minutter og underkastet SDS-PAGE. Gelen ble så farget med SYPRO Ruby løsning. Gel skiver /områder som inneholder bånd av interesse ble kuttet ut, proteiner ble eluert og underkastet trypsin fordøyelse. De tryptiske fordøyer ble analysert ved LC-MS /MS bruker Dionex Ultimate 3000 RSLCnano LC koblet til Thermo Orbitrap Elite. Før HPLC separasjonen ble peptider avsaltet ved Millipore U-C18 ZipTip pipette tips å følge produsentens protokoll. En to cm lang × 100 mikrometer innvendig diameter C18 5 um felle kolonne (Proxeon LETT kolonne) ble etterfulgt av en 75 um I.D. × 15 cm lang analytisk kolonne pakket med C18 tre mikrometer materiale (Dionex Acclaim PepMap 100). Buffer A var sammensatt av 0,1% maursyre i vann, og buffer B 0,1% maursyre i acetonitril. Data ble ervervet for 35 min ved anvendelse av en HPLC-gradient fra 5% B til 45% B over 30 min med en strømningshastighet på 300 nl /min. FT-MS oppløsningen er satt til 120 000, og topp 20 MS /MS er ervervet i CID ionefelle modus. Rådata ble behandlet ved hjelp SEQUEST innebygd i Proteome Discoverer v1.3 ved hjelp av følgende parametere: fullt trypsin fordøye med inntil 2 tapte skillelinjer, fast modifikasjon carbamidomethylation av cystein, variabel modifikasjon oksidasjon av metionin og deaminidation av asparagin og glutamin, søker menneske referansen proteome fra Uniprot fra mars 2012 (80990 oppføringer). Massen nøyaktighet for forløpere ble satt til 10 ppm monoisotopic masse, for fragmentioner var 0,8 Da monoisotopic masse. En lokke databasen ble generert fra Uniprot humane databasen og brukes av peptid validator og stillaset for beregning av falske positive verdier. X! Tandem søk i databaser (GPM, thegpm.org, versjon CYCLONE (2010.12.01.1)) ble utført innebygd i Stillas 3 Q + (Proteome programvare) ved hjelp av de samme søkeparametre som SEQUEST. Stillaset ble brukt til validering av peptid og protein identifikasjoner med tillit filtrering av 95% sikkerhet for to peptider, og 99,9% protein tillit cutoff. Falske positive peptid og protein verdier ble beregnet som 0,02% og 0,1% henholdsvis Stillas.
I
andre
sett av eksperimenter ved hjelp av NTERA-2 cell NE, utførte vi tandem IP ved hjelp den Kamiya pAb etterfulgt av R New Formål) med mobile faser av A (0,1% maursyre i vann) og B (0,1% maursyre i metanol) ble anvendt, med en gradient fra 5-95% av fase B i løpet av 45 minutter etterfulgt av 95% av fase B i 5 minutter ved 200 nl /min. Peptidene ble direkte electrosprayed til (LTQ Oorbitrap Velos (Thermo Scientific) ved anvendelse av et nanospray kilde. Den LTQ ble operert i dataavhengig modus for å erverve fragmentering spektra av de 20 sterkeste ionene i direkte kontroll av Xcalibur programvare (Thermo Scientific). Erholdes MS /MS spektra ble søkt mot mål-lokkedue Menneskelig refseq database i Proteome Discoverer 1.2-grensesnitt (Thermo Fisher) med Mascot algoritme (Mascot 2.1, Matrix Science). Variabel modifikasjon av acetvlering (lysin), di-Glycine (lysin), Fosforylering ( Serine og Threonine) og Oksidasjon (metionin) var tillatt. også statisk modifikasjon av DeStreak (cystein) var tillatt. Forløperen masse toleranse ble begrenset innenfor 10 ppm med fragment masse toleranse på 0,5 dalton og maksimalt to tapte splittelser tillatt. Assigned peptider ble filtrert med 5% falske oppdage hastighet og under manuelle kontroller.
i
tredje
ID eksperiment, rNanog1 /rNanogP8 proteiner var renset og gel skiver som inneholder ulike proteinbånd ble brukt i MALDI -TOF /TOF identifikasjon som beskrevet tidligere [62]. Tryptiske fordøyer ble analysert ved hjelp av en 4700 Proteomics Analyzer MALDI-TOF /TOF (AB Sciex, Foster City, California). Prøvene ble avsaltet med μC18 ZipTips (Millipore, Billerica, Massachusetts) med eluering direkte på MALDI målet ved hjelp av matrise α-cyano-4-hydroxycinnamic syre ved 5 mg /ml i 67% acetonitril /0,1% trifluoreddiksyre. MS og MS /MS spektra ble ervervet automatisk ved hjelp av 4000-serien Explorer V 3.0 RC1. Opp til 20 topper med S /N 20 ble valgt ut for MS /MS fragmentering, unntatt matrise, trypsin, og keratin topper. Tilleggs topp behandling og database søk ble utført ved hjelp av GPS Explorer v3.5. MASCOT V2.0 eller V2.2. Spektra ble søkt mot Swiss-Prot database inkludert menneskesekvenser (1 september 2009, 20495 oppføringer). Søkeparameterne valgt var spalting av trypsin /P med opptil to savnet splittelser, fast modifisering av carbamidomethylation av cystein og variable modifikasjoner av protein N-terminal acetylering, metionin oksidasjon og pyroglutaminsyre modifisering av peptid N-terminale glutamin rester. Databasen søk brukt 50 ppm masse toleranse for monoisotopic MS massene og 0,2 Da for MS /MS, opp til 100 topper med minimum S /N 15 ble valgt for MS, og opp til 65 fragmentioner med minimum S /N 3. søk utgang kombinerer resultatet fra MS søke og MS /MS søk ved hjelp av en sannsynlighets MOWSE algoritme. Maskoten poengsum er definert som -10 * logP, hvor P er sannsynligheten for at den observerte kampen er en tilfeldig hendelse. Maskoten scorer 56 som tilsvarer p. 0,05 velges som cutoff for en betydelig hit, og de proteiner som overstiger verdien cutoff rapporteres
Resultater
Syv av de åtte anti-Nanog antistoffer oppdage, på WB, den store 42 kD og mindre 35 kD band i NTERA-2 NE
Menneske
Nanog1
genet (GI 13376297), lokalisert på Chr. 12p13.31 og hovedsakelig uttrykt i ES og EC-celler, og har en 915-bp åpen leseramme (fig. S1A). Det koder for et 305-aa protein som blir ofte referert til som Nanog (Fig. 1A). Humant Nanog1 protein forventes å ha en molekylvekt på ~35 kD. Forbløffende nok har antatte Nanog proteiner som migrerer på tilsynelatende molekylmassene 29-80 kD på WB blitt rapportert i ES, EC, og somatiske kreftceller (tabell 1). Det er imidlertid uklart om disse rapporterte Nanog protein arter virkelig representerer Nanog proteiner. For å løse dette problemet, og for å direkte bestemme molekylvekt (e) til endogen Nanog protein, må vi først utført omfattende WB analyser i EF NTERA-2 celler ved hjelp av åtte kommersielle anti-Nanog (dvs. anti-Nanog1) antistoffer (Abs) rettet mot forskjellige regioner av det humane Nanog proteinet (figur 1A;. Tabell 1, de første 8 Abs). Blant de 8 anti-Nanog Abs, er fire [Kamiya Rb pAb, SC (Santa Cruz) geit pAb N17, Cell Signaling (CS) Rb pAb og Rb mAb] rettet mot ND, to (SC Rb pAb H-155 og R D geit pAb) til den C-terminale ende, og en (BioLegend Rb pAb) til HD (homeodomain), mens en annen (eBioscience mAb) heves mot full-lengde human Nanog1 protein (figur 1A)
WB resultatene viste at forskjellige antistoffer vises tydelig reaktivitet og hvert antistoff påvist flere band i NTERA-2 NE (vi fokusert på kjernefysisk uttrykk som Nanog er en kjernefysisk transkripsjon faktor) med MW alt fra ~28 kD til ca. 100 kD (fig . 1B-H). Spesielt resultatene viste at:. 1) eBioscience mAb viste
reneste Hotell og mest
bestemt
reaktivitet, oppdager bare en sterk gjeng ~42 kD (figur 1B, rød pilspiss) og et svakt bånd på ~35 kD (fig. 1 B, sort pilhode) i NE uten immunoreaktive bånd i cytosolen med 3 min eksponering av filmen (fig. 1B). På den annen side, mAb eBioscience oppviste den laveste følsomheten blant de 8-antistoffer. Den 35 kD band og en annen ~65 kD bandet i NE ble klart etter lengre eksponeringstid (15 min, Fig. 1B). 2) Kamiya pAb viste
den andre reneste
reaktivitet (Fig. 1C). Ved kortvarig eksponering (10 sek), det oppdaget et sterkt band på 42 kD med et meget svakt bånd på 35 kD i NE (Fig 1C,. Rød og svart pilspisser, henholdsvis). I cytosol, det oppdaget at 42 kD-båndet og flere andre bånd (Fig. 1C). Ved lengre eksponering (2 min), den Kamiya pAb også oppdaget tre øverste band på -48 kD, ~65 kD og ~90 kD både NE og cytosol (Fig. 1C, grønne pilene i panelet til høyre). 3) Både CS Rb pAb og mAb var
de mest sensitive
antistoffer slik at de oppdaget de prominente 42 kD og 35 kD band med bare 1-5 sek eksponering (Fig. 1 D). Begge antistoffer også oppdaget flere andre band (Fig. 1D, grønne piler). 4) SC geit Pab (N17) oppdaget en åpenbar 42 kD band og en svak 35 kD band, sammen med to øvre bånd ~55 kD og ~58 kD (Fig. 1E). 5) Biolegend Rb pAb var den «skitneste» Ab og oppdaget en rekke sterke band i cytosol og bare svak 42 kD bandet i NE (Fig. 1F, rød pil). 6) Den SC Rb Pab (H-155) detekteres den åpenbare 42 kD-båndet og det svakere 35 kD bånd (fig. 1G, rødt og sort pilspisser, henholdsvis), sammen med flere andre bånd på 100 kD, 70 kD, 58 kD og ~28 kD (fig. 1G, grønne piler). 7) Til slutt, R .. D geit pAb oppdaget en tilsynelatende band av 42 kD og et mindre bånd på 35 kD (fig 1 H, rød og svart pilspisser, henholdsvis), sammen med flere andre band (fig 1 H, grønne pilspisser) .
i sammendraget, denne omfattende WB analyse ved hjelp av 8 anti-Nanog Abs og NTERA-2 NE har avdekket at: 1) med unntak av BioLegend Ab, de andre 7 anti-Nanog Abs alle
vanligvis
gjenkjenne en stor 42 kD og en mindre 35 kD protein bandet; 2) Tre antistoffer dannet mot N-terminalen, dvs. Kamiya Rb pAb, CS pAb og CS mAb, gi rene WB resultater på kort eksponering av filmer; 3) med lengre eksponering, alle antistoffer gjenkjenne ytterligere proteinbånd som strekker seg fra ~28 kD til 100 kD. Men forskjellige Abs oppdage ulike mønstre av reaktivt protein band; 4) Med hensyn til følsomhet, CS mAb og CS pAb er de mest følsomme, etterfulgt av Kamiya Ab mens eBioscience mAb er den minst følsomme; 5) Den BioLegend anti-Nanog Ab oppdager ikke de 42 kD som hovedproteinbåndet i NTERA-2 NE; og 6) Ulike antistoffer kan fortrinnsvis gjenkjenne ulike proteinbånd. For eksempel, Kamiya pAb, men ikke CS pAb eller mAb omsatt med 48 kD-båndet.
siRNA-mediert knock-down avslører 42-kD-proteinbånd som det dominerende Nanog protein isoform i NTERA-2- celler
Siden den antatte Nanog protein er ~35 kD, kan vi antyde at den mindreårige 35 kD proteinbåndet vanligvis oppdaget på WB mest sannsynlig er Nanog protein. For å bekrefte dette slutning, og for å avgjøre om den dominerende 42 kD og noen av de ekstra band er også Nanog proteiner, utførte vi siRNA knock-down eksperimenter NTERA-2 celler. Som vist på fig. 2A, det Kamiya Rb pAb gående detekteres den sterke 42 kD-proteinbånd, som ble redusert som svar på Nanog siRNA. I tillegg er det mindre 35 kD-båndet og flere andre svakere bånd migrerte ved 48 kD, 65 kD, 75 kD og 90 kD alle redusert i Nanog siRNA-behandlede celler (Fig. 2A). Når vi utførte WB bruker CS Rb adressebok, Nanog sirnas også slått ned på 42 kD og 35 kD band (Fig. 2B). I tillegg ble den øvre 65 kD-båndet også redusert (fig. 2B). Legg merke til at CS pAb ikke oppdage 48 kD eller andre øvre bånd bortsett fra 65 kD bånd (Fig. 2B), i samsvar med de tidligere WB resultater med CS pAb og mAb (fig. 1 D). Kollektivt, siRNA knock-down eksperimenter tyder på at
Nanog protein i NTERA-2 celler synes å migrere, på denaturerende SDS-PAGE, på flere molekylmasser inkludert ca
35
, etter
42
, etter
48
, etter
65
, etter
75
, og Selge
90
kD med 42-kD bandet som dominerende «isoformen»
.
Karakterisering av Nanog protein arter i NTERA-2 celler ved immunoprecipitation (IP), etterfulgt av massespektrometri (MS) identifikasjon (ID)
for å underbygge siRNA knockdown resultater, vi spilte to sett med MS-baserte protein ID eksperimenter.
I første
, utførte vi IP-eksperimenter med 500 mikrogram av NE fra NTERA-2 og somatiske kreftceller og med fem anti-Nanog Abs, dvs. eBioscience mAb, Kamiya pAb, CS Rb mAb, SC pAb H155 , og R . fig. S2A-B; data ikke vist). Alle 5 antistoffer immunoutfelte 42 kD Nanog bandet i NTERA-2 NE. For eksempel når IP ble gjort med Kamiya pAb fulgt av WB hjelp av enten eBioscience mAb (Fig 3A, kjørefelt. 9) eller R D geit Pab (Fig. S2A, lane 10), ble 42 kD protein immunoutfelt. IP med CS Rb mAb, også rettet mot N-terminalen av Nanog, dro ned 42 kD band (WB bruker R D geit pAb Fig. 3B, fil 9). Når IP ble gjort med den SC pAb H-155, rettet mot den C-terminale ende av Nanog, fulgt av WB hjelp av enten eBioscience mAb (fig 3C, spor 8). Eller R
