Abstract
Angiogenese under vev vekst, utvikling og sårheling. Det er også nødvendig for tumorprogresjon og representerer en rasjonell mål for terapeutisk intervensjon. NBM-T-BMX-OS01 (BMX), avledet fra semisynthesis av osthole, en aktiv ingrediens isolert fra kinesisk urt
Cnidium monnieri product: (L.) Cuss., Ble nylig vist å forbedre læring og hukommelse hos rotter . I denne studien karakteriseres vi antiangiogene aktiviteter NBM-T-BMX-OS01 (BMX) i et forsøk på å utvikle nye hemmere for å undertrykke angiogenese og tumorvekst. BMX inhibert vaskulær endotelial vekstfaktor (VEGF) -indusert proliferasjon, migrering og endotel-rør-dannelse i human navlestreng endotelceller (HUVECs). BMX også dempes VEGF-indusert microvessel spirende fra Aortaringene
ex vivo Kjøpe og redusert HCT116 tykktarmskreftceller angiogenese
in vivo
. Videre BMX hemmet fosforylering av VEGFR2, FAK, Akt og ERK i HUVECs eksponert for VEGF. BMX ble også vist å hemme HCT116 celle proliferasjon og for å undertrykke veksten av subkutane transplantater i HCT116-celler
in vivo
. Tatt sammen, gir denne studien bevis for at BMX modulerer vaskulær endotelial celle-remodellering, og fører til hemming av tumor angiogenese. Disse resultatene støtter også rollen BMX som en potensiell narkotika kandidat og garanterer den kliniske utviklingen i behandling av kreft
Citation. Yang HY, Hsu YF, Chiu PT, Ho SJ, Wang CH, Chi CC, et al. (2013) Anti-Cancer aktivitet av en Osthole Derivative, NBM-T-BMX-OS01: Targeting vaskulær endotel vekstfaktor reseptor signalisering og angiogenese. PLoS ONE 8 (11): e81592. doi: 10,1371 /journal.pone.0081592
Redaktør: Masuko Ushio-Fukai, University of Illinois i Chicago, USA
mottatt: 5 juni 2013; Godkjent: 15 oktober 2013; Publisert: 27.11.2013
Copyright: © 2013 Yang et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av stipend fra National Science Council of Taiwan [NSC98-2320-B-038-007]; innvilge [99TMU-WFH-02-4] fra Taipei Medical University-Wan Fang Hospital, Taipei, Taiwan; og gi [LSH-2012-04] fra Landseed Hospital, Taoyuan, Taiwan. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:. NatureWise Biotech Medicals Corporation er utbygger og patenthaver på BMX og dets derivater i flere land. Patent navn: CINAMIC forbindelser og derivater derav for inhibering av histondeacetylase. Patent nummer: US7994357. Shiau-Jing Ho Chi-Wang, Chih-Chin Chi Cheng Feng Lee og Ying-Shiuan Li er ansatt NatureWise Biotech Medicals Corporation. Det er ingen ytterligere patenter, produkter under utvikling eller markedsført produkter å erklære. Dette endrer ikke forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikk på deling av data og materialer, som beskrevet på nettet i veiledningen for forfatterne.
Innledning
Angiogenese er en kompleks prosess som ny skipene er dannet av allerede eksisterende blodkar. Den bidrar ikke bare til forskjellige fysiologiske prosesser, men spiller også en viktig rolle i den tumorprogresjon og metastatisk spredning av tumorer [1] – [3]. Tumor vascularity er vanligvis korrelert med dårlig resultat. Tumor-initiert angiogenese har således vært et attraktivt mål for utviklingen av anti-cancer-terapier [4]. Under den første avascular tumorvekst, kreftceller vokser begrensning av diffusjon avstand til nærliggende blodårer og blir hypoksisk. Balansen mellom angiogene og anti-angiogent signale forskyves mot blodkardannelse [5]. Denne angiogene bryteren aktiverer deretter en oppstilling av genet transkripsjonene og initierer angiogenese [6]. Tallrike angiogene faktorer, inkludert vaskulær endotelial vekstfaktor (VEGF) [7], basisk fibroblast vekstfaktor (bFGF) [8], [9], epidermal vekstfaktor (EGF) og Angiopoietin [10] har vært implisert i tumorangiogenese. Blant disse angiogene regulatorer, VEGF-A, et medlem av VEGF-familien, er den mest kritiske og spesifikk mediator som fremmer angiogenese [11], [12]. VEGF-A er nødvendig for kjemotaksi og differensiering av endoteliale forløperceller, endotelcelleproliferasjon, vaskulogenese og angiogene remodellering [13]. Cellulære responser på VEGF-A blir mediert av reseptor-tyrosin-kinase VEGFR2 (også kjent som KDR eller Flk-1) på overflaten av endotelceller [14]. Aktivering av VEGFR2 slår på signaleringskaskader inkludert ekstracellulære signalregulerte kinase (ERK), Akt (også kjent som proteinkinase B), fokal adhesjonskinase (FAK) og Src-familie-kinaser [15]. Den Akt signalveien regulerer endotelceller migrasjon, spredning og apoptose [16]. ERK-reaksjonsveien aktiveres av VEGF har vært implisert i en rekke cellulære aktiviteter som proliferasjon, differensiering, celle motilitet og overlevelse [17]. FAK bidrar også til tumor malignitet [18]. Av disse grunner, er VEGF og VEGFR2 anerkjent som attraktive mål for terapeutisk intervensjon av kreft [19]. Mange strategier for å hemme VEGF signale blir nå vurdert i kliniske studier. Disse inkluderer løselige reseptorer som binder VEGF [20], antistoff rettet mot VEGF eller VEGFR [21] og små molekyl hemmere av VEGFR2 [22]. Videre har noen små molekyl hemmere som sorafenib og sunitinib allerede blitt godkjent av USAs Food and Drug Administration for behandling av bestemte typer kreft [23].
Cnidium monnieri plakater (L. ) Cuss. har lenge vært mye brukt i orientalsk medisin for å bedre immunitet og for å lindre hepatitt. Osthole, et bioaktivt komponent hentet fra frø av
Cnidium monnieri product: (L.) Cuss., Forventes dermed å ha immunmoduler aktiviteter. Nylige studier har også vist at osthole besitter nevrobeskyttende [24], [25] hepatobeskyttende, anti-diabetiske [26], og anti-kreft aktivitet [27], [28]. Gitt osthole brede spekter av biologiske aktiviteter, synes det å være en lovende lead compound for medisiner. Nylig ble NBM-T-BMX-OS01 (BMX) (fig. 1), et derivat semisynthesized fra osthole, identifisert som en potent histondeacetylase-inhibitor og ble vist å forbedre læring og hukommelse hos rotter [29]. I et forsøk på å oppdage kreft angiogenesehemmere, evaluert vi dermed antiangiogene egenskaper BMX. I denne studien viste vi at BMX hemmet VEGF-indusert celleproliferasjon, migrasjon, og rør dannelse i menneskelige umbilical endotelceller (HUVECs). VEGF-indusert fosforylering av VEGFR2, Src, ERK, Akt og FAK ble også undertrykkes i HUVECs utsatt for BMX. Ved bruk av HCT116 kolorektal kreftceller xenograft modell angiogenese, ble BMX videre vist å undertrykke tumor-assosiert angiogenese. Videre BMX betydelig hemmet HCT116 tykktarmskreft celleproliferasjon og undertrykte tumorvekst i en xenograft tumor modell. Samlet utgjør disse resultatene tyder på potensialet i BMX som et terapeutisk middel med dual aktivitet mot både tumor spredning og angiogenese.
Materialer og metoder
Reagenser
3 – [4, 5-dimetyltiazol-2-yl] -2, 5-difenyltetrazoliumbromid (MTT), toluidin blå O, og McCoy5A medium var fra Sigma (St. Louis, MO). Medium 199 (M199), føtalt bovint serum (FBS), og alle cellekultur reagenser ble innkjøpt fra Invitrogen (Carlsbad, CA). Antistoffer mot CDK4, VEGFR2, VEGFR2 fosforylert på tyrosin 1175 (Y1175), VEGFR2 fosforylert på tyrosin 1214 (Y1214), ERK1 /2, ERK1 /2 fosforylert ved treonin 202 /tyrosin 204 (T202 /Y204), Akt, Akt fosforylert på serin 473 (S473), FAK og FAK fosforylert på tyrosin 397 (Y397), Src og Src fosforylert på tyrosin 416 (Y416) ble kjøpt fra Cell Signaling (Danvers, MA). Antistoffer spesifikke for p21 ble kjøpt fra Santa Cruz Bioteknologi (Santa Cruz, California). Antistoffer mot GAPDH, α-tubulin, Survivin og cyclinD1 og anti-mus og anti-kanin IgG konjugert peroksydase-antistoffer ble innkjøpt fra GeneTex Inc (Irvine, CA). Den forbedrede kjemiluminescens deteksjon kit var fra GE Healthcare (Lille Chalfont, UK). Cell Proliferation ELISA, BrdU analysen kit ble kjøpt fra Roche (Indianapolis, IN). Alle materialer for immunoblotting ble kjøpt fra GE Healthcare (Lille Chalfont, UK). Alle andre kjemikalier ble oppnådd fra Sigma (St. Louis, MO).
NBM-T-BMX-OS01 (BMX)
BMX, (
E
) -2 – (4-metoksybenzyloksy) -3-prenyl-4-metoksy
N
-hydroxycinamide, ble gitt av NatureWise Biotech Medicals Corporation (Taipei, Taiwan), og deres renhet (mer enn 99%) ble bekreftet ved
1 H-NMR-analyse og HPLC.
1H NMR-spektra ble registrert på et Bruker Avance DRX 500 MHz-Fourier-transform-spektrometer ved romtemperatur.
1 H NMR (DMSO-
d
6
, 500 MHz) δ: 7,70 (1H, d,
J
= 16,0 Hz), 7,46 (1H, d,
J
= 8,5 Hz), 7,40 (2H, d,
J
= 8,5 Hz), 6,97 (2H, d,
J
= 8,5 Hz), 6,87 (1 H , d,
J
= 8,5 Hz), 6,38 (1H, d,
J
= 16.0 Hz), 5.11 til 5.5 (1H, m), 4,65 (2H, s), 3,82 (3H, s), 3,78 (3H, s), 3,28 (2H, d,
J
= 7,0 Hz), 1,64 (3H, s), 1,60 (3H, s). Anal. HPLC
t
R = 9,57 min (renhet 99,3%). Analytisk HPLC UV renhet ble vurdert ved hjelp av et JASCO LC-2000Plus system og den følgende metode. For fremgangsmåten ved 210 nm, en Phenomenex Luna 5 um, 250 mm x 4,60 mm C18 (2)-kolonne ble benyttet med en strømningshastighet på 1,0 ml /min og en mobil fase av metanol /vann (v /v = 80:20 ) over 30 min.
Etikk uttalelse
Denne studien ble utført i henhold til anbefalingene i guide for omsorg og bruk av forsøksdyr av National Institutes of Health. Protokollene som beskrevet nedenfor ble godkjent av Taipei Medical University Laboratory Animal Care og bruk Committee (Permit Number: LAC-100-0097). Alle operasjoner ble utført under natrium pentobarbital anestesi, og alle anstrengelser ble gjort for å minimere lidelse.
Cell kultur
Menneske navle vaskulære endotelceller (HUVECs) ble innhentet fra Bioresource Collection og Research Center ( Hsinchu, Taiwan). Celler ble opprettholdt i M199 medium inneholdende vaskulær endotelial celle-vekstsupplement (ECGS) (Millipore), 10% FBS, 5 U /ml heparin, 20 mM HEPES, 100 U /ml penicillin G og 100 ug /ml streptomycin i en fuktet 37 ° C inkubator. HCT116 tykktarmskreft cellelinje ble innhentet fra Bioresource Collection og Research Center (Hsinchu, Taiwan). Cellene ble opprettholdt i McCoy5A inneholdende 10% FBS, 100 U /ml penicillin G og 100 ug /ml streptomycin i en fuktet 37 ° C inkubator.
Celleviabilitet assay
Celleviabilitet ble målt ved kolorimetrisk 3- (4,5-dimetyltiazol-2-yl) -2,5-difenyl-tetrazolium-bromid (MTT) analyse som beskrevet tidligere [30].
laktat-dehydrogenase (LDH) slipper assay
LDH lekkasje ble målt for å kvantifisere cytotoksisiteten med en CytoTox96 ikke-radioaktive cytotoksisitet assay kit (Promega). Supernatantene i kultur ble analysert basert på produsentens retningslinjer. Absorbans ble målt ved 490 nm i en mikroplateleser. Lyseringsbuffer tilsatt i 10 minutter ble anvendt som en positiv kontroll for fullstendig cellenekrose. Data ble beregnet som prosentandelen av lyseringsbuffer-behandlede gruppen.
celleproliferasjonsanalyse (BrdU-inkorporering assay)
HUVECs (2 x 10
4 per brønn) ble sådd ut i 96 -vel vevskulturplater og inkubert i 24 timer. Cellene ble så sultet i M199 medium inneholdende 2% FBS i fraværet av endotelial celleveksttilskudd for ytterligere 16 timer. Etter sult, cellene ble forbehandlet i 30 minutter med forskjellige konsentrasjoner av BMX, etterfulgt av stimulering med VEGF (20 ng /ml) i ytterligere 24 timer. Celleproliferasjon ble deretter bestemt ved hjelp av en Cell Proliferation ELISA, BrdU (kolo) kit (Roche) basert på kolo deteksjon av inkorporering av BrdU, etter produsentens anvisninger.
flowcytometrisk analyse
HUVECs ble sultet med 2% FBS M199 i fravær av endotelial celleveksttilskudd i 16 timer. Cellene ble deretter inkubert med BMX ved indikerte konsentrasjoner i 30 minutter etterfulgt av behandling med VEGF (20 ng /ml) i ytterligere 24 timer. På slutten av forsøkene ble apoptotiske celler detektert ved propidiumjodid (PI) og annexin V-FITC merking som tidligere beskrevet [31]. Den doble Merkingen ble utført ved 37 ° C ved å behandle cellene med PI (50 ug /ml) og annexin V-FITC (2 ug /ml) i 15 min i mørket.
Sår bunnen migrering assay
etter sult i M199 medium som inneholder 2% FBS for 16 timer, monolags HUVECs ble såret ved å skrape med pipettespisser og vasket med PBS. Cellene ble deretter behandlet med forskjellige konsentrasjoner av BMX i fravær eller nærvær av VEGF (20 ng /ml) i ytterligere 16 timer. Celler ble fotografert ved hjelp av fasekontrastmikroskop med digitalt kamera med 0 t og 16 timer etter VEGF behandling. Frekvensen av cellemigrering ble bestemt ved telling av antallet migrerte celler under en invertert fase kontrast mikroskop (Nikon, Japan).
Transwell invasjon assay
Migrering-analysen ble utført som beskrevet tidligere [32 ]. I korthet, ble bunnflaten av filteret i transwell plate (Corning, NY, USA) belagt med 0,2% gelatin. De nederste kamre ble fylt med M199 medium inneholdende 2% FBS i nærvær av VEGF (20 ng /ml) og HUVECs (10
4 celler per brønn) i 200 pl M199 medium (uten vekstfaktorer) ble sådd ut i den øverste kamre. Den øverste kammer inneholdt kjøretøy eller ulike konsentrasjoner av BMX. Celler ble tillatt å migrere i 16 timer. Non-migrerte celler (på oversiden av filter) ble skrapt med en bomullspinne, og migrerte celler ble fiksert og farget med 0,5% toluidinblått i 4% paraformaldehyde. Cellene ble fotografert og kvantifisert ved å telle antallet fargede celler under en invertert fase kontrast mikroskop (Nikon, Japan).
Matrigel rør dannelsesbestemmelsen
Røret-analysen ble utført som beskrevet tidligere [32]. Matrigel, en basalmembran matrise (Becton Dickinson, Mountain View, CA), ble polymerisert ved 37 ° C i 30 minutter. HUVECs suspendert i M199 medium inneholdende 2% FBS i nærvær eller fravær av VEGF (20 ng /ml) ble sådd ut på Matrigel. De ble deretter behandlet med bærer eller BMX ved indikerte konsentrasjoner. Etter 16 timer ble cellene fotografert ved hjelp av fasekontrastmikroskopi.
immunoblotanalyse
Immunoblotanalyse analyser ble utført som tidligere beskrevet [30]. I korthet ble cellene lysert i en ekstraksjonsbuffer inneholdende 10 mM Tris (pH 7,0), 140 mM NaCl, 2 mM PMSF, 5 mM DTT, 0,5% NP-40, 0,05 mM pepstatin A, og 0,2 mM leupeptin. Prøver av like mengder protein, ble underkastet SDS-PAGE og overført på en NC membran som deretter ble inkubert i en TBST-buffer inneholdende 5% ikke-fettholdig melk. Proteiner ble synliggjort ved inkubering med spesifikke primære antistoffer, etterfulgt av pepperrot-peroksidase-konjugert sekundært antistoff. Immunoreaktivitets ble oppdaget basert på økt chemiluminescence per instruksjonene fra produsenten. Kvantitative data ble oppnådd ved bruk av et densitometer databehandling med et vitenskapelig avbildningssystem (Biospectrum AC System, UVP).
Aorta ring spirende assay
-analysen ble utført som beskrevet tidligere [32]. Aortabuen ble dissekert fra 8 til 10 uker gamle Sprague-Dawley-rotter. Etter å ha fjernet de omkringliggende fibro-adipose vev og grundig skylling med M199 kulturmedium ble Aorta skåret i 1 mm ringsegmenter. Aortaringene ble neddykket i Matrigel i brønnene av 48-brønners plate. VEGF (20 ng /ml) med eller uten BMX ble deretter tilsatt til brønnene. Aortaringene ble dyrket i 37 ° C med 5% CO
2 og det dyrkede mediet ble skiftet hver 3. dag. Økende spirer av endotelceller ble observert og fotografert på dag 8. Bildene ble fotografert i henhold mikroskop, og spirende området ble bestemt på data digitalisert bilder med Bilde-Pro Plus (Media Cybernetics) programvare. Analysen av spirende området ble gjort av en observatør som var blindet for behandlingsgruppen. Alle protokoller ble godkjent av Taipei Medical University Laboratory Animal Care og bruk komité.
Tumor celle-indusert angiogenese Matrigel plugg analysen
3-5 uker gamle naken
nu /nu mus var innhentet fra BioLasco (Taipei, Taiwan) og plassert i rene spesifikk patogen gratis (SPF) rom. HCT116-celler ble høstet og resuspendert i PBS. Celler (5 x 10
6 celler) i et volum på 150 ul i nærvær av heparin (20 U) ble blandet med Matrigel (150 ul) og deretter injisert subkutant inn i høyre flanke av hver mus. Etter implantasjonen ble dyrene randomisert i kontrollgruppen og behandlingsgruppene, som mottok BMX 20 mg /kg /dag. Behandlingen ble administrert intraperitonealt en gang daglig i 10 dager. Ved slutten av behandlingen ble dyrene avlivet, Matrigel pluggene ble fjernet og det omkringliggende vevet trimmet. Hemoglobinnivåer på Matrigel pluggene ble evaluert med Drabkins reagenssett (Sigma-Aldrich) i henhold til produsentens instruksjoner. Konsentrasjonen av hemoglobin ble beregnet basert på et sett av hemoglobin standarder. I tillegg ble det parafininnstøpte delene farget med et CD31-spesifikt antistoff (Santa Cruz) for å detekteres fartøyet tetthet i Matrigel plugg som tidligere beskrevet [33]. Alle protokoller ble godkjent av Taipei Medical University Laboratory Animal Care og bruk komité.
Mus xenograft modell
3-5 uker gamle naken
nu /nu mus ble oppnådd fra BioLasco (Taipei , Taiwan) og plassert i rene spesifikk patogen gratis (SPF) rom. HCT116-celler ble høstet og resuspendert i PBS, og 5 x 10
6-celler i et volum på 0,3 ml ble injisert subkutant inn i høyre flanke av hver mus. Når tumoren nådde ca 150 mm
3, ble dyrene randomisert i kontrollgruppen og behandlingsgruppen mottok BMX 20 mg /kg /dag. Behandlingen ble administrert intraperitonealt en gang daglig i 22 dager. Svulster ble målt hver dag av en digital caliper. Tumor volum ble beregnet ved hjelp av formelen
V plakater (mm
3) = [
ab
2] × 0,52, der
en
er lengden og
b
er bredden av svulsten [34]. Ved slutten av behandlingen ble dyrene avlivet og tumorene ble fjernet og veiet. Alle protokoller ble godkjent av Taipei Medical University Laboratory Animal Care og bruk komité.
Statistisk analyse
Resultatene er presentert som gjennomsnitt ± S.E. fra minst tre uavhengige eksperimenter. Én-veis analyse av varians (ANOVA) ble etterfulgt av Newman-Keuls test, når det er hensiktsmessig, for å bestemme den statistiske signifikans av forskjellen mellom middel. En
p
verdien av 0,05 ble ansett som statistisk signifikant
Resultater
BMX hemmer VEGF-indusert celleproliferasjon i HUVECs
endotelcelleproliferasjon er. et viktig skritt i utviklingen av angiogenese. For å vurdere den anti-angiogene aktivitet av BMX (fig. 1), ser vi først evaluert dens hemmende virkning på celleformering i VEGF-stimulert HUVECs. Cellene ble sultet med 2% FBS inneholdende medium i 16 timer og deretter stimulert med VEGF (20 ng /ml) i nærvær eller fravær av BMX i ytterligere 24 timer. Som vist på fig. 2A, behandling av celler med BMX konsentrasjonsavhengig redusert cellelevedyktighet på VEGF-stimulert HUVECs som bestemt ved MTT-analyse. BrdU merking analyse ble deretter ansatt for å bekrefte om BMX-indusert minsk i celle levedyktighet var knyttet til hemming av celleproliferasjon. Fig. 2B viser at prosentandelen av BrdU-merkede celler signifikant økt etter en 24 timers VEGF-behandling sammenlignet med de bærerbehandlede gruppe. BMX inhiberte signifikant VEGF-indusert celleproliferasjon i en konsentrasjonsavhengig måte. For å avgjøre om BMX utøves noen cytotoksisk effekt i HUVECs eksponert for VEGF, ble en LDH analyse ansatt. Som vist på fig. 2C, behandling av celler med BMX på 10 mikrometer for 24 timer var ikke signifikant økning LDH utgivelse. Vi har også brukt flow-cytometrisk analyse med propidiumjodid (PI) og annexin V-FITC merking for å detektere apoptose i VEGF-stimulerte celler i nærvær av BMX. Som vist på fig. 2D, BMX ikke vesentlig endre andelen av annexin V
+ PI
– celler (nedre høyre kvadrant, tidlig apoptotiske celler) og annexin V
+ PI
+ celler (øvre høyre kvadrant , avanserte apoptotiske celler og /eller nekrotiske celler). Disse resultatene antydet at BMX kan utøve anti-proliferativ aktivitet uten å forårsake cytolytiske eller apoptotisk virkning i HUVECs eksponert for VEGF.
(A) HUVECs ble sultet i 2% FBS inneholdende medium uten ECGS i 16 timer. Etter sult, ble celler forbehandlet med indikerte konsentrasjoner av BMX etterfulgt av stimulering med VEGF (20 ng /ml) i ytterligere 24 timer. Cellelevedyktigheten ble deretter bestemt ved MTT-analyse. Hver kolonne representerer gjennomsnitt ± SEM av fem uavhengige eksperimenter utført in duplo *
p
0,05, sammenlignet med gruppen behandlet med VEGF alene. (B) HUVECs ble behandlet som i (A), og celle proliferasjon ble bestemt som beskrevet i avsnittet «
Materialer og Metoder
» -delen. Hver kolonne representerer gjennomsnittet ± SEM for fem uavhengige eksperimenter utført i duplikat. *
p
0,05, sammenlignet med gruppen som ble behandlet med VEGF alene. (C) HUVECs ble behandlet som i (A), og cytotoksisitet av BMX ble bestemt ved LDH assay. Celler ble også behandlet med cellelyseringsbuffer (total lysis) for å tjene som positiv kontroll. (D) HUVECs ble behandlet som i (A), ble andelen av apoptotiske celler deretter analysert ved flow-cytometrisk analyse som beskrevet i «
Materialer og Metoder
» -delen. Den nedre venstre kvadrant av hvert panel (annexin V
-PI
-) viser levedyktige celler, som utelukker PI og er negative for annexin V bindende. Den nedre høyre kvadrant (annexin V
+ PI
-) representerer begynnelsen av apoptotiske celler, annexin V positiv og negativ PI, viser cytoplasmatiske membranintegritet. Den øvre høyre kvadrant (annexin V
+ PI
+) inneholder avanserte apoptotiske celler og nekrotiske celler, som er positivt for annexin V binding og for PI-opptak. Resultatene som vises er representative for fire uavhengige eksperimenter.
BMX hemmer VEGF-indusert migrering og kapillær struktur dannelse av HUVECs
endotelceller migrasjon er en sentral skritt for angiogenese [35]. Effekten av BMX på HUVEC motilitet ble bestemt av såret scratch migrasjon og Transwell invasjons analyser. Som vist på fig. 3A, BMX betydelig hemmet VEGF-indusert HUVEC migrasjon i en konsentrasjonsavhengig måte. BMX ved 5 uM også signifikant redusert antall migrerte celler gjennom transwell membranen barrieren ved bruk av VEGF som kjemotiltrekkende (Fig. 3B). Angiogenese er en kompleks prosess og det rørformede dannelsen av endotelceller er også et nøkkeltrinn i angiogenese. For å vurdere effekten av BMX på den rørformede dannelsen av endotelceller, HUVECs sådd på overflaten av Matrigel i nærvær av VEGF ble behandlet med enten BMX eller bærer som kontroll. Celler i den bærer-behandlede gruppe ble langstrakt og dannet kapillar-lignende struktur innen 16 timer. VEGF økt kapillær-lignende nettverk betraktelig. Imidlertid behandling av BMX konsentrasjonsavhengig måte undertrykkes dannelsen av kapillær-lignende nettverk (fig. 3C). Vi neste utforsket de potensielle effektene av BMX på VEGF-indusert angiogenese ved hjelp av en rotte aorta ring microvessel spirende analysen. Som vist på fig. 3D, VEGF i betydelig grad utløses microvessel spirende, som fører til dannelsen av et komplekst nettverk av mikrokar rundt aortaringer, mens behandling med BMX (5 uM) motvirket spiringsprosessen. Disse resultatene indikerer at BMX kan fremvise anti-angiogen aktivitet ved hemming av celleproliferasjon, migrasjon og rør dannelse av endotelceller.
(A) HUVECs ble sultet i 2% FBS inneholdende medium uten ECGS i 16 timer. Celle monolag ble så skrapet og behandlet med bærer eller indikerte konsentrasjoner av BMX i nærvær av VEGF for ytterligere 16 timer. Antallet migrerte celler ble deretter bestemt. Hver kolonne representerer gjennomsnitt ± SEM av fire uavhengige eksperimenter. *
p
0,05, sammenlignet med gruppen som ble behandlet med VEGF alene. (B) Når sult som beskrevet i (A), Cellene ble deretter sådd i øvre kammer i fravær eller nærvær av BMX (5 um) ved bruk av VEGF som kjemoterapi-lokkemiddel. Etter 16 timer, invaderte celler gjennom gelatin-belagte membran ble farget og kvantifisert. Hver kolonne representerer gjennomsnitt ± SEM av fire uavhengige eksperimenter. *
p
0,05, sammenlignet med gruppen som ble behandlet med VEGF alene. (C) HUVECs ble sådd på Matrigel i nærvær av VEGF (20 ng /ml) med eller uten BMX ved indikerte konsentrasjoner. Cellene ble så fotografert under fase-kontrastmikroskopi etter 16 timer. Søylediagram viser samlet data om gjennomsnittlig spire erke tall (n = 4). *
p
0,05, sammenlignet med gruppen som ble behandlet med VEGF alene. (D) Rotte aortaringer ble plassert i Matrigel og behandlet med VEGF (20 ng /ml) i nærvær eller fravær av BMX (5 uM). Effekten av BMX på dannelsen av fartøy spire fra ulike aorta prøvene ble undersøkt på dag 8. Bar grafer viser samlet data av gjennomsnittlig microvessels området (n = 4). *
p
. 0,05, sammenlignet med gruppen som ble behandlet med VEGF alene
BMX hemmer VEGF-indusert ERK og Akt fosforylering
VEGF signaliserer via VEGFR2 er den viktigste reaksjonsveien for å indusere endotelisk celleformering, migrering og rør dannelse, som fører til angiogenese [36]. VEGF binding til VEGFR2 induserer VEGFR2 dimerization og senere autofosforylerings på sine tyrosinrester. Takahashi et al viste at tyrosinrester 1175 og 1214 er de to store VEGF-avhengige autofosforyleringsaktivitet områder av VEGFR2 [37]. Vi dermed avgjøres om BMX påvirker VEGFR2 Y1175 og Y 1214 fosforylering i VEGF-stimulert HUVECs. Vi har også undersøkt fosforylering status av Src, Akt, ERK og FAK, som er de grunnlegg proteinkinaser som er involvert i VEGFR2 signalering. Som vist på fig. 4, BMX hemmet VEGFR2 Y1175 og Y1214 phosphorylations i VEGF-stimulert HUVECs (Fig. 4B). BMX ble også vist å undertrykke fosforylering av Src (fig. 4C), FAK (fig. 4D), Akt (fig. 4E) og ERK (fig. 4F) i VEGF-stimulert HUVECs. Sammen viser disse resultatene at BMX utøvet sin aktivitet ved å hemme angiogenese VEGFR2 aktivering og blokkering av VEGFR2-mediert signaliserings kaskader.
Celler ble forbehandlet med indikerte konsentrasjoner av BMX til 30 (20 ng /ml) i en annen 5 (VEGFR2 og Src) eller 30 (FAK, Akt og ERK1 /2) min. Fosforylering status av VEGFR2, Src, FAK, Akt, og ERK1 /2 ble deretter bestemt ved immunblotting. Tallene som er vist i (A) er representative for fire uavhengige forsøk med lignende resultater. De kompilerte Resultatene av VEGFR2 Y1175 og Y1214 (B), Src Y416 (C), FAK Y397 (D), Akt S473 (E), og ERK1 /2 T202 /Y204 (F) phosphorylations er vist. Hver kolonne representerer gjennomsnitt ± SEM av fire uavhengige eksperimenter. *
p
0,05, sammenlignet med kontrollgruppen; #
p
. 0,05, sammenlignet med gruppen som ble behandlet med VEGF alene
BMX øker p21
CIP /Waf1 uttrykk, men reduserer cyclinD1, CDK4 og Survivin uttrykk
passasjen gjennom cellesyklusen reguleres av cyklin-CDK-komplekser, heterodimere proteinkinaser [1] – [3]. Mange studier har vist at induksjon eller ektopisk ekspresjon av p21
CIP /Waf1, en negativ regulator av CDK hemmer celleproliferasjon og forårsaker differensiering i flere celletyper. p21
CIP /Waf1 er derfor en viktig regulator av spredning under utvikling, differensiering og tumorigenesis [38]. I tillegg Survivin, en inhibitor av apoptose (IAP) familiemedlem, ble funnet å være over-uttrykt i humane kreftformer og ble rapportert å spille en avgjørende rolle i regulering av cellesyklusutvikling, apoptose, og tumorigenesis [39] – [42] . Siden BMX trykt HUVEC spredning uten å forårsake apoptose som beskrevet ovenfor, undersøkte vi om BMX påvirker protein nivåer av p21
CIP /Waf1 og survivin i HUVECs. Nivåene av cellesyklusregulerende proteiner som cyclinD1 og CDK4 ble også bestemt i BMX-stimulerte HUVECs. Som vist på fig. 5, behandling av HUVECs med BMX i 24 timer førte til en økning i proteinnivået av p21
CIP /Waf1 (Fig. 5B). I motsetning til dette protein nivåer av Cyclin D1 (fig. 5C), CDK4 (fig. 5D) og Survivin (fig. 5E) ble redusert i BMX-stimulert HUVECs. Disse resultater antyder at BMX-inhiberte celleproliferasjon i HUVECs kan også være mediert gjennom endringer i protein nivåene av p21
CIP /Waf1, cyclinD1, CDK4 og Survivin.
Cellene ble behandlet med den angitte konsentrasjon av BMX for 24
CIP /Waf1, cyclinD1, CDK4 og survivin ble deretter bestemt ved immunoblotting. Tallene som er vist i (A) er representative for fire uavhengige forsøk med lignende resultater. De kompilerte resultatene av p21
CIP /Waf1 (B), cyclinD1 (C), CDK4 (D), og Survivin (E) nivåer er vist. Hver kolonne representerer gjennomsnitt ± SEM av fire uavhengige eksperimenter. *
p
0,05, sammenlignet med kontrollgruppen
BMX trykt tumorindusert angiogenese i nakne mus
Deretter brukte vi en tumorindusert angiogenese modellen til å undersøke hvorvidt BMX hemmer tumorindusert angiogenese. HCT116 kolorektal kreft celler ble blandet med Matrigel og injisert inn i flankene av mus. Gel plugger ble høstet 10 dager etter implantasjon. Som vist på fig. 6A, HCT116 cellene dypt indusert blodkardannelse i pluggen (fig. 6A). Imidlertid blek farge på pluggene fjernet fra musene administrert intraperitonealt med BMX (20 mg /kg /dag) indikerte at HCT116-celler indusert neovaskularisering mindre over hele 10-dagers perioden. Vi utførte CD31 immunhistokjemisk farging for å påvise microvessel tetthet i plugger. Som vist på fig. 6B, plugger avledet fra BMX-behandlede mus viste en reduksjon i microvessel tetthet sammenlignet med de fra bæremiddelbehandlede kontrollmus. Vi har også kvantifisert nivået av angiogenese ved å bestemme hemoglobininnholdet av pluggene. En markert reduksjon i neovascularization ble vist i plugger fra BMX-behandlede mus sammenlignet med de fra (Fig. 6C) behandlede kontrollmusene.
