Abstract
Blære kreft viser ofte genetiske avvik i phosphatidylinositol 3-kinase signalveien. Her har vi undersøkt for mutasjoner i
PIK3R1
, som koder p85α, en av de regulatoriske subenheter av PI3K. To hundre og sekstifire blæren svulster og 41 blære kreftcellelinjer ble screenet og 18 mutasjoner ble oppdaget. Tretten mutasjoner var i C-terminal domener og er spådd å påvirke samspillet mellom p85α og p110α. Fem mutasjoner var i BH domenet av PIK3R1. Denne regionen har vært innblandet i p110α uavhengig roller p85α, for eksempel binding til og endre aktiviteter PTEN, Rab4 og Rab5. Uttrykk av disse muterte BH-p85α former i mus embryonale fibroblaster med p85α knockout indikerte at alle former, bortsett Avkortings mutanter, kunne binde og stabil p110α men økte ikke AKT fosforylering, som tyder på at BH mutasjoner fungere uavhengig av p110α. I et panel av 44 blæretumorcellelinjer, var 80% redusert PIK3R1 mRNA-ekspresjon i forhold til normale urotelialceller. Dette, sammen med mutasjon av
PIK3R1
kan endre BH domene fungerer. Våre funn tyder på at mutante former av p85α kan spille en rolle i onkogent blærekreft, ikke bare via tap av evne til å regulere p110α men også via endret funksjon av BH domene.
Citation: Ross RL, Burns JE, Taylor CF, Mellor P, Anderson DH, Knowles MA (2013) Identifikasjon av mutasjoner i forskjellige regioner av P85 Alpha i uroteliale kreft. PLoS ONE 8 (12): e84411. doi: 10,1371 /journal.pone.0084411
Redaktør: Karl X Chai, University of Central Florida, USA
mottatt: 30 september 2013; Godkjent: 18 november 2013; Publisert: 18.12.2013
Copyright: © 2013 Ross et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Økonomisk støtte levert av Yorkshire Cancer Research (https://yorkshirecancerresearch.org.uk/) (L362) og University of Leeds MRC student (MK, RR), kanadiske Institutes of Health Research (http: //www.cihr-irsc.gc. CA /e /193.html) (MOP84277) (DA), og Saskatchewan Helse Research Foundation Fellowship (https://shrf.ca/)(PM). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K) signalveien spiller en avgjørende rolle i regulering av cellevekst, spredning og overlevelse [1] og mutasjoner som fører til avvikende aktivering av veien finnes i nesten alle typer kreft. I urothelial karsinom (UC) av blæren, har flere genomiske forandringer som fører til deregulering av veien blitt identifisert. Disse inkluderer inaktivere mutasjoner i
PTEN Hotell og
TSC1 Hotell og aktiverende mutasjoner i
PIK3CA Hotell og
akt1 product: [2,3,4,5,6, 7,8]. Tidligere viste vi at flere av disse hendelsene er ikke-redundante, noe som tyder på at mutasjon av mer enn en sti medlem kan ha additive eller synergistiske effekter [4]. Disse endringene er funnet både i lav grad, ikke-invasiv og muskel-invasiv UC, noe som indikerer at denne veien spiller en avgjørende rolle i UC utvikling og som tyder på at det er en viktig terapeutisk mål i disse kreftformene.
PI3 kinaser fosforylere det 3` stilling på inositol ring av phosphinositol-4,5-bifosfat (PIP2) for å generere lipid andre messenger phosphinositol-3,4,5-trifosfat (PIP3) som aktiverer AKT nedstrøms signalering. Klasse IA PI3Kαis en obligat heterodimer bestående av p110αcatalytic subenheten (p110α), kodet av
PIK3CA
genet, og en regulatorisk subenhet, kodet av en av tre gener,
PIK3R1, PIK3R2 Hotell og
PIK3R3
. De regulatoriske subenheter er avgjørende for stabiliteten av p110α og i hviletilstand undertrykke dets katalytiske aktivitet [9]. Hver har to SH2-domener som kan binde aktiverte membranbundne vekstfaktor reseptorer eller adapter molekyler, endre sin konformasjon, lindrende hemming av p110α og la p110α å fosforylere PIP2 [10].
Mutasjoner av
PIK3R1
, koding p85α, er rapportert hos noen kreftformer. I en muslymfom indusert av X-bestråling, en avkortet (p65) form som bare inneholder aminosyrer 1-571 ble identifisert og vist seg å gi økt
in vitro
kinase aktivitet på p110α [11]. Denne avkortet form av p85α ble senere vist å mangle den kritiske inter-SH2 (iSH2) region som er nødvendig for inhibering av p110α aktivitet [12]. En tilsvarende avkortet form ble rapportert i en menneskelig Hodgkins lymfom cellelinje [13] og 4 mindre slettinger, innenfor eksoner 14 eller 15 som koder for iSH2 regionen, i eggstokkene og tykktarm kreft [14]. To skjøte mutasjoner ble også identifisert, som begge førte til hoppe av exon 15. Ekspresjon av en av disse mutante former med en delesjon av exon 13 resulterte i konstitutiv aktivering av PI3K reaksjonsveien i celler, noe som gir bevis for at mutant P85 kan fungere som en onkogen i menneskelig kreft. En 9 bp sletting som omfatter exon-intron krysset av ekson 12 [15] og 9 andre mutasjoner, hvorav åtte var i iSH2 regionen ble identifisert i glioblastomas [16] og 15 mutasjoner ble funnet i tykktarm kreft, de fleste av disse var vist seg å redusere dens p110α-hemmende aktivitet mens de har beholdt evnen til å stabilisere komplekset [17]. En enkelt
PIK3R1
mutasjonen ble nylig rapportert i en studie av UC som vist eksoner 12, 14 og 15, ( 1% frekvens) [18]. I motsetning til disse lave mutasjonsfrekvenser, har det nylig blitt rapportert at 20 – 40% av endometrioid livmorkreft inneholde
PIK3R1
mutasjoner, de fleste i nSH2 og iSH2 domener [19,20].
Vår tidligere funn av mutasjoner i flere komponenter av PI3K veien i UC, og funn av
PIK3R1
mutasjoner i andre krefttyper, bedt oss om å søke etter mutasjoner i
PIK3R1
. Som bevis har dukket opp som at N-terminal domener av p85α har onkogene funksjoner, valgte vi å skjerme hele den kodende sekvensen av
PIK3R1
, snarere enn å fokusere på eksoner 12, 14 og 15. Her rapporterer vi en rekke mutasjoner i UC-avledede cellelinjer og primære UC tumorer, omfattende delesjoner i iSH2 region og en serie av missense mutasjoner, flere i knekkpunktet klynge region homologi (BH) domene, som har GTPase aktivitet overfor Rab5 [21] og kan binde PTEN [22,23]. Våre funn tyder på at mutante former av p85α kan spille en rolle i onkogent blærekreft, ikke bare via tap av evne til å regulere p110α men også via endret funksjon av BH domene.
Materialer og metoder
Etikk uttalelse
Studiet ble godkjent av Leeds East forskningsetiske komité (99/156) og skriftlig informert samtykke ble innhentet fra alle pasienter.
Pasientprøver og DNA Isolation
Kalde cup biopsi av 264 uroteliale karsinom (UC) ble samlet, snap-frosset og lagret i flytende nitrogen. Resten av vevet ble innstøpt i parafin for diagnostisk vurdering. Svulsten panel besto av 10 pTaG1, 42 pTaG2, 24 pTaG3, 7 pT1G1, 27 pT1G2, 57 pT1G3, 2 pT2G1, 13 pT2G2, 54 pT2G3, 5 G1, 8 G2 og 4 G3 svulster uten underliggende stroma (PTX) og 11 svulster uten informasjon [24,25]. Alle var overgangsordning celle carcinoma. DNA ble ekstrahert fra frysesnitt og venøse blodprøver som beskrevet tidligere [4].
urothelial cellelinjer
Førti-fire UC cellelinjer (253J, 5637, 639V, 647V, 92-1 , 94-10, 96-1, 97-1, 97-18, 97-24, 97-7, BC-3C, BFTC905, BFTC909, CAL29, DSH1, HT1197, HT1376, J82, JMSU1, JO’N, KU -19 til 19, LUCC1, LUCC2, LUCC3, LUCC4, LUCC5, LUCC6, LUCC7, LUCC8, MGH-U3, RT112, RT4, scaber, SD, SW780, SW1710, T24, TCCSUP, U-BLC1, UM-UC3, VM -CUB-en, VM-CUB-2 og VM-CUB-3) ble undersøkt (tabell S1). LUCC1-LUCC8 linjer ble etablert i forfatternes laboratorium fra blæren tumorvev oppnådd med skriftlig informert samtykke. Cellelinje identitet ble bekreftet av kort tandem repeat DNA-typing ved hjelp Powerplex 16 kit (Promega). Profiler ble sammenlignet med offentlig tilgjengelige data (ATCC, DSMZ) eller der ingen referanse profilen var tilgjengelig, ble bekreftet som unik. DNA ble ekstrahert som beskrevet tidligere [4].
Mutasjon analyse
Hele kodende sekvens av
PIK3R1
ble undersøkt i 18 fragmenter av høy oppløsning smelter analyse som beskrevet [26 , 27]. DNA fra matchet blodprøver ble analysert for å bekrefte somatisk mutasjon status. Primersekvenser er gitt i Tabell S2. Mutasjoner ble registrert med referanse til NM_181523.
Allele-spesifikk PCR (AS-PCR) ble utført for å fastslå den fase av parene av mutasjoner i cellelinjen LUCC3 og i tumorprøve 2 (tabell 1). En frem primer er designet spesielt for å forsterke mutant allel på 5` mutasjon området og ble matchet med en omvendt primer posisjonert til å inkludere andre mutasjon i PCR-produkt (tabell S3). Produktene ble kjørt på en agarosegel for å identifisere vellykket amplifikasjon fra tumor /cellelinje DNA og ikke bare forsterkning fra blod og WT-DNA. PCR produktene ble sekvens-verifisert
Sample
Grade /scene
Exon
nukleotid endre
Forut aminosyre forandring
1TaG32
1c..409G . AE137K2TxG35c.652GT E218 * 6c.862ACK288Qintron 12c.1426-49 G Aunknown3T4G35c.710_727del18W237-Y242del4T1G35c.785GCR262T5TaG310
2c.1072CT R358 * 14c.1735_1740del6Q579-Y580del6T1G3 11c.1131TGN377K7TaG312c.1322ATN441I8T1G113c.1441ATR481W
3LUCC3 T2G313 c.1519GC E507Q 14c.1670GCR557P9T2G313c.1552GCE518Q10T1G314c.1585GAD529N11TaG214c.1696_1734del39I566-D578del12T1G216c.1934CTT645I13TaG2Exon 17 spleise acceptorc.1986-1 G Cunknown Tabell 1. Mutasjoner i PIK3R1 identifisert i blæren svulster og cellelinjer
1cDNA referansesekvens. NM_181523;
2 mutasjon i bare en mindre bestand av sekvenser;
3cell linje. CSV Last ned CSV
Expression vektorer og transduksjon av cellelinjer
Kloning av innskudd som koder full lengde villtype (WT) menneskelige p85α og storfe p85α R274A mutant inn pGEX-6P (GE Healthcare og biovitenskap) har blitt beskrevet [21]. Mutanter E137K, R162 *, E218 *, Δ237_242, R262T, K288Q ble opprettet ved seterettet mutagenese bruke QuikChange metoden (Stratagene, CA, USA) og klonet inn PFB Hyg [28] i-ramme med en N-terminal HA tag ved hjelp av infusjon metode (Clontech, CA, USA).
Kontroll cDNA, N564D og p85Δ, ble vennlig levert av Genentech [17] og subklonet inn PFB Hyg etter samme metode. Alle plasmider ble sekvens-verifisert. Konstruksjonene ble transfektert inn i Phoenix A celler ved hjelp Transit 293 (Mirus, Madison, USA). Muse embryonale fibroblaster (MEFs) med knockout av p85α, β, δ (en slags gave fra Lewis Cantley, Harvard Medical School), NIH3T3 musefibroblastere og Rat1 rotte fibroblaster, ble inkubert med retroviral supernatant inneholder 8 mg /ml polybrene og valgt med 500 , 200 og 250 mikrogram /ml hygromycin, henholdsvis.
Funksjonell karakterisering av BH domene mutanter
Celler ble lysert og protein hentet ved hjelp CelLytic Mammalian Cell Lysis Reagent (Sigma-Aldrich, Dorset, UK) i henhold til produsentens instruksjoner og kvantifisert som tidligere beskrevet [29]. Anti-HA Immunpresipitasjon Kit (Sigma-Aldrich) ble brukt i henhold til produsentens instruksjoner for co-immunoprecipation eksperimenter. Immunoblottet proteiner ble inkubert med primære antistoffer; anti-p85α (Abcam, Cambridge, UK), anti-p110α, anti-Pakt (Ser473), anti-panAKT (Cell Signaling Technology, Boston, UK) og anti-tubulin alfa (ABD Serotec, Kidlington, Oxford, UK). Bundet primære antistoffer ble oppdaget ved hjelp av HRP-konjugert sekundære antistoffer og Luminata Forte Western HRP substrat (Millipore, Watford, UK). Anchorage-uavhengig vekst ble utført som beskrevet tidligere [29] og kolonier med en diameter ≥ 50 mikrometer ble telt innen 2,5 mm
2.
Analyse av PIK3R1 mRNA og protein uttrykk i UC
PIK3R1 mRNA expression data for 105 blære tumorprøver og 52 normale blæreprøver rapportert av Sanchez-Carbayo et al [30] ble åpnet. PIK3R1 protein uttrykk ble undersøkt i 44 UC cellelinjer og samlet normale menneskelige urotelialceller (NHU-pool) av western blotting og normalisert til tubulin.
Resultater
Identifikasjon av somatisk
PIK3R1
mutasjoner
Vi skjermet hele den kodende sekvensen av
PIK3R1
for mutasjoner i 264 UC tumorvev og 41 UC cellelinjer. De tre kjente isoformer av PIK3R1, p85α p55α og p50α inneholde ulike eksoner. Eksoner 1-6 er unike for p85α, er ekson 7 til stede bare i p50α og ekson 8 bare i p55α. Eksoner 9-17 er tilstede i alle isoformer, men bruken av en kryptisk spleisesete innenfor ekson 16 resulterer i genereringen av cDNA som varierer i lengde fra 8 kodoner [31], som begge var dekket av denne skjerm. Atten mutasjoner ble identifisert i 13 svulster. En tumor (tumor 2) inneholdt tre og en (tumor 5) inneholdt to mutasjoner (tabell 1). Alle ble bekreftet som somatiske mutasjoner ved sitt nærvær i tumor-avledede DNA, men ikke pasientens blod. En tumoravledet cellelinje (LUCC3) inneholdt to mutasjoner, og disse ble også bekreftet som somatisk opprinnelse. Alle mutasjoner ble bekreftet ved gjentatte PCR presiseringer for å utelukke PCR gjenstander. Arten og fordelingen av de mutasjoner er vist i forhold til p85α proteinstrukturen i figur 1. Fem ble plassert i BH domene (figur S1). Ingen var i eksoner som er unike for p50α eller p55α, men flere ble plassert i eksoner 2, 5 og 6, som er unike for p85α. Det er ingen mutasjoner ble identifisert i området av ekson 16 som er alternativt spleiset.
Allele spesifikke PCR (AS-PCR) ble benyttet for å bestemme hvorvidt de 2 mutasjoner i cellelinje LUCC3 (c.1519GC og c.1670GC, E507Q og R557P) og 2 exonic mutasjoner i svulst 2 (c.652GT og c.862AC, E218 * og K288Q) var til stede i
cis
eller i
trans
. I LUCC3, en mutasjonsspesifikk primer for c.1519C vellykket amplifisert et PCR-produkt fra ekson 13 til 14 i (fig S2A). Sekvensering av produktet bekreftet tilstedeværelsen av mutasjonen c.1670C, noe som indikerer at begge iSH2 domene mutasjoner er på samme allel. AS-PCR analyse av tumor 2 også bekreftet at de 2 exonic mutasjoner (BH domene E218 * og K288Q mutasjoner) var tilstede på samme allel (figur S2B).
I tumor 5, sekvens profiler indikerte at en av mutasjonene (R358 *) var til stede som bare en mindre populasjon av molekyler, mens den andre (Q579_Y580del) først heterozygot. Den genomiske avstanden mellom eksoner 10 og 14 gjorde det umulig å utvikle en allel-spesifikk PCR-analyse for å bestemme hvorvidt disse mutasjonene var på samme allel. Den lille signalet fra R358 * mutasjon kan tyde på at det var til stede som bare en mindre sub-klonal hendelsen. Dette viste seg å være tilfelle, som analyse av vev fra en påfølgende tilbakefall av sykdommen i denne pasienten viste bare Q579_Y580del.
Forut Effekt av mutasjoner på Protein Function
Posisjonene til de missense muterte rester som er representert i den tilgjengelige krystallstrukturen er vist i figur 2. To mutasjoner, R358 * og N377K, ble identifisert i den nSH2 domene. Nyere funn tyder på at denne regionen p85α fungerer som et stillas for p110α – p85α kompleks, med samhandling med C2, spiralformede og kinase domener av p110α og med p85α iSH2 [32]. R358 * avkorter protein på nSH2 phosphopeptide bindingssetet (FLVRDAS). Den samme mutasjonen ble nylig rapportert i 5 endometriekreft prøver der det representerte 5% av alle identifiserte mutasjoner [20]. Arginin 358 har blitt identifisert som å danne en saltbro med E542 i p110α [32] og det konstruert mutasjonen R358A ble vist å avskaffe phosphopeptide binding [9]. Således er tapet av R358 og avkutting på dette tidspunkt vil sannsynligvis resultere i ødeleggelse av phosphopeptide binding og vekselvirkning p85α med den skruelinjeformede domene av p110α og kan etterligne effekten av p110α skrueformede domene mutasjoner. Vi har tidligere vist at de spiralformede domene mutasjoner E542K og E545K er langt den vanligste mutasjonene som finnes i
PIK3CA
i blærekreft [4] og er mer potent enn H1047R i indusere signaliserer nedstrøms AKT og spredning ved samløpet og under betingelser med næringsutarming når det uttrykkes i normale urotelialceller [29]. Som R358X trunkering mutant fjerner både iSH2 og cSH2 regioner av proteinet, er interaksjon med C2-domenet av p110α tapt og effekter kan etterligne de som er beskrevet for mutasjoner og trunkeringer påvirker disse domenene [33]. Fra sekvensdata, og kunnskap om at det var minimal forurensende normalt vev i prøven, denne mutasjonen syntes å være heterozygot. Således antas det at i tillegg til det avkortede protein, ikke-mutert protein som var tilgjengelig for p110α binding og stabilisering i denne tumor.
A. Bånd diagram av strukturen av komplekset ifølge p110α med niSH2 regionen p85α (PDB-kode 2RD0) som viser residuer mutert i UC. B. Forholdet mellom p85α nSH2 å p110α C2 domene viser nærhet av N377 i nSH2 til C2 domene rest E365. C. Forholdet mellom iSH2 domenet p85α med C2 domenet p110α viser nærhet av R557 til N345 i C2. D. Space fyller modell som viser R481 og R557 rester i iSH2 av p85α i kontakt med C2 av p110α. E. Oppbygging av P85 dimer (PDB kode 1PBW) som viser plasseringen av PIK3R1 punkt-mutert rester E137, R262 og K288 og regionens slettet (W237-Y242) i UC i forhold til rester som er involvert i P85 dimerization (M176, mørk grønn /lys cyan, L161, I177 og V181, lys grønn /cyan). Posisjonen til residuet R274 (magenta), som er innblandet i Rab-GAP-aktivitet er også vist. I tillegg er tre glutaminsyrerester (E266, E284 og E291) som samhandler med R262 angitt, med E291 også i samspill med K288.
N377, som ble mutert til lysin, ligger ved siden av G376, som ble funnet tidligere for å være mutert til arginin i 3 tilfeller av glioblastom [16,34]. Begge rester er innenfor en region (374-377) som er spådd til å samhandle med rester 364-371 i C2 domenet av p110α [32]. I krystallstrukturen av p110α i kompleks med p85niSH2, både G376 og N377 er innen hydrogen-binding avstand fra E365 i p110α C figur 2B.
Seks missense mutasjoner og to i-frame slettinger ble identifisert i iSH2 domene. Dette er området der de fleste mutasjoner er funnet i andre kreftformer, selv om ingen av de endringer som finnes her er identiske med de som er rapportert tidligere [14,16,17,19,20]. Denne regionen av proteinet er involvert i interaksjon med adapter-bindende region av p110α og i stabilisering og inhibering av dets katalytiske aktivitet i den basale tilstand via interaksjon med C2-domenet. Den antatte effekten av enkelte mutasjoner i iSH2 er å forstyrre grensesnittet med p110α C2 [16,33]. For eksempel, p85α rester, N564, er innenfor hydrogenbinding avstand av N345 i p110α C2 (figur 2C), er en rest som er blitt funnet mutert i p110α [35]. D560Y rapportert i glioblastom [16] er også innenfor hydrogen-binding avstand fra N345 og begge disse er anslått derfor å etterligne den onkogene N345 mutasjonen. Her fant vi en ny mutasjon, R557P som også er nær N345 av p110α (figur 2C). R481, som ble funnet mutert til tryptofan, er også i umiddelbar nærhet til C2 domenet p110α figur 2D).
De to i-frame sletting identifisert i iSH2 (I566_D578del og Q579_Y580del) fjerne aminosyreresiduer som har vist seg å bli slettet i eggstokkene og kolorektal kreft [14,17] og glioblastom [16] og er spådd til å forstyrre den spiralformede sekundær struktur i denne regionen og forstyrre samhandlingen med p110α C2. Mutasjonen Q579_Y580del har blitt rapportert å binde og stabilisere p110α men har redusert evne til å regulere den lipid-kinase-aktiviteten til p85α p110α holoenzyme [17]. Nylig, ni av nSH2 og iSH2 mutasjoner funnet i andre krefttyper ble uttrykt i kylling embryo fibroblaster og alt indusert transformasjon, målt ved fokus dannende aktivitet, økt spredning og økt signalering via PI3K [36]. Spesifikke inhibitorer av p110α, men ikke inhibitorer av p110β p110γ, eller p110δ avskaffet fenotypiske effekter av to av disse tumor-avledede mutante former (KS459delN, DKRMNS560del), noe som indikerer at den onkogene aktiviteten til disse mutantene er unikt mediert av p110α.
den mest N-terminale iSH2 mutasjon identifisert, N441I, i et linkerområde mellom nSH2 og iSH2, og ligger nær enden av den andre alfaheliks av iSH2. Denne regionen er ikke løst i de publiserte krystallstrukturer og dens virkning er ikke klart. T654I i cSH2 domenet er nær flere rester som er mutert i kolorektal kreft [17] og er rett ved siden av FLVRES motiv (rester 646-651) som kreves for fosfotyrosin engasjement. En serin eller treonin rest i denne posisjon er funnet i SH2-domenene til et bredt spekter av proteiner. Flere mutasjoner i dette domenet er blitt rapportert i kolorektal kreft [17], men ikke i glioblastom [16,34], øke muligheten for at det kan være vevsspesifikke forskjeller.
Interessant nok har vi funnet fem mutasjoner innenfor BH domene av PIK3R1 (28% av mutasjoner funnet) (figur 1. Figur S1). Tidligere mutasjon skjermer har identifisert bare syv mutasjoner i denne regionen (K142fs, E160 *, R162 *, I177N, E217K, N285H, E297K) i mer enn 1550 prøver av andre svulster rapportert hittil [14,16,17,18,19, 20,34] ( 0,5%). Alle missense mutasjoner i denne regionen (E137K, R262T og K288Q) er i svært konserverte rester (Figur S3). Strukturen til denne regionen av proteinet (aminosyrene 105-319) som en homodimer er blitt rapportert [37]. Grensesnittet mellom BH domener ble vist å involvere interaksjon av M176 fra en monomer med L161, V181 I177 og på den andre. De tre punktmutasjoner og sletting identifisert her er fjernt fra denne regionen av interaksjon (figur 2E).
P85α BH domene mutanter samhandle med og stabilisere p110α
For å avgjøre om BH domene mutante proteiner har p110α avhengige effekter, testet vi deres evne til å samhandle med og stabilisere p110α. p85α, β δ knockout (pan-P85 null) MEFs ble omformet med retrovirale ekspresjonsvektorer som koder N-terminale HA-merket p85α cDNA som koder BH domene mutante former identifisert i UC (E137K, E218 *, Δ237_242, R262T, K288Q), andre mutante former som kontroller (R162 *, p85Δ, R274A-storfe, N564D), villtype (WT) eller tom vektor. R162 * mutant p85α er en BH domene mutasjon tidligere identifisert i kreft [17] og som p85Δ mangler p110α bindende regionen (n-iSH2) [38]. Begge har tidligere vist seg ikke å samhandle med p110α [17]. N564D iSH2 mutant p85α ble anvendt som en positiv kontroll som det tidligere har blitt vist å binde p110α, øke PI3K og AKT-aktivitet, og indusere celleoverlevelse, forankrings-uavhengig vekst og transformasjon messige fenotyper som var p110-avhengig [17]. Det ble også brukt her for å vurdere potensielle forskjeller mellom BH og iSH2 domene mutante former av P85. R274A er en konstruert BH domene mutant form av bovin p85α som tidligere er blitt vist å inhibere P85-GAP-aktivitet og var onkogen [21,39].
Ekspresjon av p85α ble bekreftet ved Western-blotting (figur 3A). Avkortet p85α protein var synlig i det R162 * -MEF (18 kDa), men i den E218 * -MEF, ble det avkortede protein (24 kDa), uttrykt ved et meget lavt nivå. Tre uavhengige transductions med E218 * virus konsekvent indusert lav protein uttrykk som tyder på at dette proteinet kan være ustabil. Interessant, R162 * -MEF uttrykte også en liten mengde av full-lengde p85α protein.
A. Immunoblot viser p85α protein uttrykk nivåer i transduced celler. B. Samtidig immunoprecipitation av HA-merkede proteiner etterfulgt av immunoblot med p85α og p110α å bestemme P85-P110 bindende. C. immunoblotanalyse av PI3K signale (nivåer av Pakt (Ser473)) i serumholdig medium og stolpediagram viser kvantifisering av normalisert Pakt til total AKT forhold til kontroll. D. immunoblotanalyse av Pakt (Ser473) i serumholdig medium og stolpediagram viser kvantifisering av normalisert Pakt til total AKT forhold til kontroll.
Pan-P85 null MEFs har lave nivåer av p110α, som kan gjenopprettes ved ekspresjon av villtype p85α [40]. Vi bekreftet dette og viste at alle mutante former unntatt E218 *, R162 * og p85Δ hadde samme effekt (data ikke vist). Co-immunopreciptation av HA-merkede proteiner P85 ble brukt for å vurdere p110α binding (figur 3B). Resultatene indikerte at alle P85 proteiner, bortsett fra E218 *, R162 * og p85Δ kunne binde p110α.
BH og iSH2 domene mutanter av p85α viser ulike effekter på AKT aktivering og forankringsuavhengig vekst
p85α C-terminal domene mutante former som påvirker p110α aktivitet normalt føre til aktivering av AKT. Dette har blitt demonstrert i flere p85α mutanter som kan binde p110α [17,19,20]. I pan-P85 null MEFs rekonstituert med vill-type og mutante former av p85α, har vi funnet at bare den N564D mutant induserte økte nivåer av fosfo-AKT (Ser473), både i serumholdig medium (figur 3C), og under forhold med serum -deprivation (data ikke vist). Dette ble også sett i NIH3T3 som uttrykker villtype og mutante former av p85α når det holdes i serum-supplert betingelser (figur 3D). Dette er i overensstemmelse med den foregående funn i NIH3T3 at bovint R274A ikke påvirker fosforylering av AKT etter stimulering med PDGF [21]. Dette mønsteret ble reflektert i sprednings priser av MEF og NIH3T3 celler når det holdes i serumholdig medium og ved vurdering av forankringsuavhengig vekst av NIH3T3 celler (data ikke vist). Analyse av forankrings-uavhengig vekst av Rat1 celler som uttrykker villtype og mutante former av p85α viste at mens BH domene mutanter induseres noen kolonidannelse i forhold til villtype p85α, N564D hadde den største effekt (figur S4).
Forholdet til andre mutasjoner i PI3K pathway gener
Tidligere skjermet vi de analyserte prøvene her for
PIK3CA
mutasjon [[4] og upubliserte data]. Bare to prøvene inneholdt både
PIK3R1
og
PIK3CA plakater (E545K) mutasjoner og en av disse var svulsten som hadde en BH domene mutasjon (E137K) i
PIK3R1
. Totalt 61 av svulstene skjermede inneholde
PIK3CA
mutasjoner (23%). Dermed
PIK3CA
mutasjonen ble underrepresentert i den delen som hadde
PIK3R1
mutasjon (en observert, 5 forventet). Dermed
PIK3R1
mutasjoner ikke i BH domenet ser ut til å være gjensidig utelukkende med
PIK3CA
mutasjon i UC. Det var ingen signifikant sammenheng med
PIK3CA
eller
PIK3R1
mutasjon med tumor grad eller stadium. Fire av prøvene inneholder
akt1
mutasjoner (E17K), ingen som co-eksistert med
PIK3R1
mutasjon.
TSC1
mutasjonsstatus er kjent for 148 svulster i serien, hvorav 14 inneholder en mutasjon [4]. En av disse svulstene hadde en mutasjon i BH domenet av
PIK3R1 plakater (W237_Y242del). Men størrelsen på utvalget og mutasjons frekvenser som er for små for noen vesentlig sammentreff eller gjensidig eksklusivitet kan identifiseres.
PIK3R1 uttrykk er redusert i UC og cellelinjer
Som p85α mutasjoner kan endre protein: protein interaksjoner av p85α, hvorav noen, spesielt de i BH domene, kan tyde på en svulst suppressor rolle vurderte vi muligheten for at nedregulering av proteinet kan bidra til kreftutvikling.
PIK3R1
ligger på kromosom 5 (5q13.1). Tap av heterozygositet (LOH) og kopiantall tap av sekvenser på 5q har blitt rapportert i blærekreft [41,42]. Ved å rekke CGH har vi funnet ut at 29% av muskel invasiv UC ha kopiantall tap i størrelsesorden
PIK3R1 product: [43]. Undersøkelse av offentlig tilgjengelige ekspresjonsvektorer data indikerte at UC har en betydelig reduksjon i PIK3R1 ekspresjon på RNA-nivå (figur 4A).
A. Analyse av p85α mRNA uttrykk nivåer i 105 blære tumorprøver og 52 normale blære prøver. Data fra Sanchez-Carbayo et al [30]. B. Kvantitativ analyse av p85α immunoblottet proteinprøver fra blærekreftcellelinjer normalisert til tubulin og vist i forhold til sammenslåtte normale menneskelige urotelialceller (NHU-basseng).
Vi vurderte p85α protein uttrykk i 44 UC celle linjer ved hjelp av western blotting. Denne viste stor variasjon i uttrykket nivåer med de fleste cellelinjer (80%) som viser redusert p85α protein uttrykk sammenlignet med normale urotelialceller (figur 4B).
Diskusjoner
I denne studien har vi funnet
PIK3R1
mutasjoner i 4,9% av UC. Jo høyere frekvens funnet her enn i forrige undersøkelse av UC [18] uttrykk for vår vurdering av hele genet i stedet for bare eksoner 12, 14 og 15. Våre data for de tre eksoner avslørte 5 mutasjoner (1,8% av svulster), kompatible med denne tidligere studie. De fleste av mutasjonene var lokalisert i den C-terminale region av p85α i likhet med funn i andre humane kreftformer [14,16,17,19,20]. Mutasjoner er identifisert i nSH2 og iSH2 domener kan etterligne effekten av p110α mutasjoner ved lindrende hemmende regulering av p110α av p85α og onkogene aktiviteten til disse mutantene ser ut til å bli p110α avhengig [36].
Interessant, fant vi en høyere frekvens av BH domene mutasjoner sammenlignet med tidligere mutasjon skjermer. Hvorvidt dette er spesifikk for UC er ennå ikke klart på grunn av den gjenstand for mange undersøkelser bare på den p110α -interacting region av genet. Nyere data indikerer at BH-domene mutante former av p85α kan forandre stabiliteten i PTEN [20]. p85α binder seg til ufosforylerte PTEN innenfor den høymolekylære PTEN forbundet kompleks (PAC) [22]. Denne interaksjonen omfatter den N-terminale region av P85 (SH3-BH), og har blitt vist å positivt regulerer lipid-kinase-aktiviteten til PTEN i en vekstfaktor-avhengig måte [23]. Expression of p85α med sletting av BH domene alene betydelig redusert interaksjon med PTEN og sletting av begge domenene avskaffet det, noe som fører til økt amplitude og varighet av AKT aktivering følgende vekstfaktor stimulering [23]. Dermed PTEN: vises p85α samhandling for å forsterke muligheten for PTEN å redusere PIP3 nivåer og avslutte aliserte til AKT. Faktisk mutasjonen E160 * identifisert i endometriet har vist seg å destabilisere PTEN og resultere i økt AKT-fosforylering [20].
BH-regionen viser også sekvenshomologi RhoGAP proteiner og besitter GAP aktivitet mot Rab5, Rab4, Cdc42 og Rac1 [21].
