Abstract
behandling av kreft som oligonukleotider eller peptider krever effektive leveringssystemer. En roman peptid, TMTP1, tidligere utledet og identifisert i vårt laboratorium viste bemerkelsesverdig evne til å målrette høyt metastatiske svulster både
in vitro og in vivo
, selv på et tidlig stadium av okkult metastase foci. TMTP1 moderat hemmet tumorcellelevedyktigheten, men ikke nok til å anser det et effektivt drept av tumorceller. I denne studien, søkte vi å forbedre anti-tumoraktiviteten til TMTP1. For å gjøre dette, vi smeltet den til en antimikrobielle peptid,
D (KLAKLAK)
2, og betegnet det resulterende peptid TMTP1-DKK. Vi fant ut at TMTP1-DKK kan utløse raske apoptose i menneskelig prostata og mage kreft celler gjennom både mitokondrie-indusert apoptose sti og død reseptor veien. Videre er direkte injeksjon av TMTP1-DKK i mus med prostata og mage kreft xenograft resulterte i reduksjon av tumorvolumer og en betydelig forsinkelse i tumorprogresjon og metastase
in vivo
. Disse resultatene tyder på at TMTP1-DKK kan tjene som en kraftig terapeutisk middel for metastatiske svulster
Citation. Ma X, Xi L, Luo D, Liu R, Li S, Liu Y, et al. (2012) anti-tumor Effekter av Peptide TMTP1-GG-
D (KLAKLAK)
2 på det sterkmetastatisk kreft. PLoS ONE 7 (9): e42685. doi: 10,1371 /journal.pone.0042685
Redaktør: Hiroshi Shiku, Mie Universitetet Graduate School of Medicine, USA
mottatt: 05.02.2012; Godkjent: 11 juli 2012; Publisert: 11.09.2012
Copyright: © Ma et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Funding var levert av Science Foundation of China National (No.30973472, 81001006, 30973148), major Innovation Medicine program (2009ZX09103-738, 2009ZX09103-739, 2009ZX09103-740), og «973» program of China (No. 2009CB521808). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
de fleste av dødelighet assosiert med kreft skyldes metastasering av de opprinnelige kreftceller til nettsteder fjernt fra den første eller primærtumor. For tiden tilgjengelige behandlingsalternativer er sjelden i stand til å kurere metastatisk kreft, slik som de arised fra prostata og magekreft. På verdensbasis er prostatakreft den vanligste kreftformen hos menn og den nest største årsaken til kreftrelaterte dødsfall. Magekreft er fortsatt en av de hyppigste svulster, forårsaker 12% av alle kreftrelaterte dødsfall hvert år [1], [2], [3]. Videre er klinisk behandling av disse faste tumorer er relativt ineffektiv. Derfor oppdage og behandle metastase, spesielt okkulte metastaser, har vært den viktigste tilnærmingen nyutviklede kreftbehandlingen. Av de siste årene for kreft forskning har gitt innsikt i de prosesser som er ansvarlige for kreft vekst og identifisert mange molekylære mål for mulige kreftterapi [4], [5]. Imidlertid er godkjenningsprosedyre for nye kreftbehandlinger lang. Håpet er at ved å målrette spesifikke endringer i kreftceller på tidlig stadium av metastasering, kan behandlingsformer utvikles til å bli mer effektive i å drepe kreftceller
in situ Hotell og metastasebrennpunkter, mens mindre skadelig for normale celler. Som et resultat, ville disse innovative terapier gjøre en stor positiv innvirkning på overlevelse og livskvalitet for kreftpasienter.
I løpet av det siste tiåret, innen kreft narkotika utvikling har blitt forvandlet med identifisering av spesifikke molekylære målene [6], [7], [8]. Målrettet genterapi kan oppnås ved en rekke forskjellige teknikker inkludert genterapi og gentranskripsjon. Nylige fordeler ved målrettet levering inkluderer vellykket bruk av små molekylære inhibitorer, monoklonale antistoffer, og korte peptider som målretter [9], [10]. Utviklingen av korte rettet mot peptider synes å være en lovende avenue for vellykket målrettet genterapi. Korte rettet mot peptider har utmerket vev penetrability og minimal toksisitet og immunogenisitet, noe som gjør dem egnet for aksept av pasienter og klinikere.
Nylig har vi identifisert en 5-aminosyre peptid, TMTP1, som er bundet til en rekke svært metastatisk kreftcellelinjer
in vitro
og
in vivo
, spesielt de fra atypiske lever micrometasteses som inneholdt små mengder av neoplastiske celler [11]. Men TMTP1 kjente ikke normal og ikke-metastaserende cellelinjer. Vi fant også at høye konsentrasjoner av TMTP1 kunne mekle tumor celle apoptose. Siden TMTP1 bundet til metastatisk kreft med høy spesifisitet, kan det være nyttig som et diagnostisk verktøy og /eller har cytotoksiske funksjon. Spesielt TMTP1 kunne brukes i konstruksjonen av tilpass
de novo
peptidkonjugater. Disse peptidene kan tilpasses for forskjellige diagnostiske og terapeutiske anvendelser gjennom forbindelse til et bredt spekter av målretting midler så som virus, proteiner og antimikrobielle peptider. I denne studien, sammen vi TMTP1 til en kationisk antimikrobielle peptid kjent for sin sterke cytotoksiske aktivitet for å forbedre sin anti-tumor effekter.
Det er mer enn 100 naturlig forekommende antibiotika peptider og deres
de novo
utforming har fått mye oppmerksomhet [12], [13], [14], [15], [16]. Ellerby et
al product: [17] funnet at når de er konjugert et kationisk antimikrobielt peptid,
D (KLAKLAK)
2, til CNGRC målsøkende domene, det resulterende peptid hadde antitumoraktivitet gjennom sin muligheten til å målrette mitokondrier og utløse apoptose. Disse og andre strukturelt lignende pro-apoptotiske antibiotiske peptider forbli forholdsvis ikke-toksiske utsiden av eukaryote celler. Men når tatt opp av tumorceller, induserte de mitokondrielle svelling og mitokondrier avhengig apoptose [18], [19], [20]. Det er imidlertid et stort problem med disse peptidene å sikre deres innføring inn i celler. Dermed må disse peptidene bli koblet til tumor rettet mot peptider som tillater reseptor-formidlet internalisering. Dette sikrer at kimære peptid vil gå inn i cytosol av målrettede cellene der det kan indusere mitokondrie-avhengig apoptose.
I denne studien har vi smeltet
D (KLAKLAK)
2 til TMTP1 av fast fase peptidsyntese på en automatisert Applied Biosystems modell og heter den resulterende peptid TMTP1-DKK [11]. Vi antok at TMTP1 peptid ville tillate for målretting mens
D (KLAKLAK)
2 vil fremme mitochondria indusert apoptose. I denne studien, vurderte vi det bemerkelsesverdig spesifisitet og anti-tumor evne TMTP1-DKK på metastatiske svulster
in vitro Hotell og
in vivo
.
Resultater
TMTP1-DKK hjem til høyt metastatiske tumorceller in vitro og in vivo
Vi har tidligere vist at TMTP1 binder spesifikt til metastatiske tumorceller [11]. For å finne ut om den nylig syntetisert TMTP1-DKK peptid beholder bindende spesifisitet av sin målgruppe domene, TMTP1, konjugert vi TMTP1-DKK til FITC. Vi deretter undersøkt bindingen av FITC-konjugert TMTP1-DKK til flere kreftcellelinjer og normale celler
in vitro Hotell og
in vivo
. FITC-konjugert TMTP1-DKK spesifikt bundet til den svært metastatisk prostatakreft-cellelinje PC-3M-1E8 og magekreft cellelinje MKN-45sci (figur 1 A, a og c,). Men gjorde TMTP1-DKK ikke målrette de ikke-metastatisk cellelinje PC-3M-2B4 celler, murine fibroblast cellelinje NIH /3T3, normal mammary epitelceller MCF-10A, normal leveren celle LO2 og HEK293 celler (figur 1A, b , d og B).
En Fluorescent bilder av tumorceller behandlet med TMTP1-DKK ble undersøkt med Confocal laser scanning mikroskopi. (A) PC-3M-1E8-celler (b) PC-3M-2B4-celler (c) MKN-45sci-celler (d) NIH /3T3-celler. FITC-TMTP1-DKK (grønn) og kontroll peptid ble undersøkt i xenografttumorer inkludert PC-3M-1E8 (e) TMTP1-DKK, (f) svTMTP1-DKK, MKN-45sci (g) TMTP1-DKK, (h) svTMTP1 -DKK. Kjerner ble co-farget med DAPI (blå). B Fluorescent bilder av utstyrsleverandørene celler (normal mammary epitelceller MCF-10A, normal leveren celle LO2 og HEK293 celler) som ble behandlet med TMTP1-DKK ble undersøkt med Confocal laser scanning mikroskopi. Den morfologiske endring av utstyrsleverandørene celler ble visualisert ved hjelp av invertert mikroskop.
neste søkt å fastslå om TMTP1-DKK bundet til disse svært metastatiske tumorceller
in vivo
. For dette formål ble PC-3M-1E8 og MKN-45sci celler subkutant injisert inn i BALB /c nakne mus. Mus med tumorer 1-1,5 cm i diameter ble injisert med 300 mikrogram FITC-TMTP1-DKK peptidet via halevenen. Etter 24 timer, svulster og kontroll organer ble skåret ut og behandlet for frosset snitting. Vi har oppdaget at den dynamiske biofordelingen av FITC-konjugert TMTP1-DKK fra i 1 time, 6 timer, 12 timer, 24 timer og 48 timer i musemodeller av MKN-45sci ortotopisk magekreft og PC-3M-1E8 subkutan prostatakreft hos konfokal mikroskopi. TMTP1-DKK ble påvist i svært metastatisk PC-3M-1E8 og MKN-45sci xenograft tumor vev (Figur 1A, e og g). Ved konfokal mikroskopi viste at TMTP1-DKK kunne vedvare på et høyere nivå i 48 timer i musemodeller av MKN-45sci ortotopisk magekreft og PC-3M-1E8 subkutan prostatakreft (figur S1). Som kanskje indikerer at peptidet kunne stabil i tumorvevet. Imidlertid fluorescens ble ikke detektert i kontroll organer og vev. Den homing analysen med kontroll peptid, svTMTP1-DKK, viste ingen åpenbar fluorescens flekker i PC-3M-1E8 og MKN-45sci xenograft tumor vev eller normale vev (Figur 1A, f og h, figur S2,).
TMTP1-DKK hemmer spredning og induserer apoptose i svært metastatiske kreftceller
neste søkt å fastslå om TMTP1-DKK kan hemme spredning av høyt metastatiske kreftceller. For å teste dette, PC-3M-1E8, MKN-45sci, og NIH /3T3 celler ble behandlet med ulike konsentrasjoner (1-20 mm) av TMTP1-DKK og kontroll peptider i 24 timer. Satsene for cellevekst ble målt ved MTT-analyse. TMTP1-DKK hemmet celleproliferasjon av PC-3M-1E8 og MKN-45sci-celler på en doseavhengig måte med maksimal hemming som forekommer i en dose på 15-20 uM av TMTP1-DKK (figur 2A og B
P
. 0,01 tillegg inhiberingshastigheten ved TMTP1 var mye lavere enn ved TMTP1-DKK (figur 2A og B,
P
0,01). inhibering av proliferasjonen av murine fibroblaster NIH /3T3-celler ble ikke påvist (figur 2C). og svTMTP1-DKK viste ingen effekt på prostata og mage kreft celler (figur 2D, F).
Cell overlevelse ble bestemt ved MTT-analyser utført i tre eksemplarer (
feilfelt
, ± SD). dataene presentert representerer prosentandelen av celler overlevende sammenlignet med ubehandlede celler. Representative resultater er vist. forskjellene i overlevelse mellom 10 uM og 20 uM TMTP1-DKK er mer signifikant i begge PC- 3M-1E8 eller MKN-45sci celler (
P
0,01). Det er imidlertid lite eller ingen effekt ble sett på murine fibroblaster NIH /3T3-celleformering når de ble behandlet med TMTP1-DKK. D Celler levedyktighet av MKN-45 og PC-3M-1E8 kreftceller behandlet ulike konsentrasjoner (0-20 mm) av svTMTP1-DKK for 24 timer ble målt ved MTT-analyse. E Morfologisk kvantifisering av cellulær apoptose ved invertert mikroskop i PC-3M-1E8 og MKN-45sci celler behandlet med 10 mm TMTP1-DKK. Etter behandlet med DKK, cellene viste celle svinn, membran oppløsning, og kjernefysisk kondens /fragmentering. F Lille morfologisk endring ble observert av invertert mikroskop i PC-3M-1E8 og MKN-45sci behandlet med 10 mm svTMTP1-DKK for 24-timers.
Det er mulig at TMTP1-DKK begrenset spredning ved å fremkalle apoptose i svært metastatiske kreftceller. For å teste dette, PC-3M-1E8, MKN-45sci celler, normal mammary epitelceller MCF-10A, normal leveren celle LO2 og HEK293 celler ble behandlet med 10 mm TMTP1-DKK og svTMTP1-DKK i 24 timer. Eventuelle morfologiske forandringer i cellene ble observert under fase-kontrast mikroskop. Utbredelsen av apoptose priser ble bestemt av FACS benytter FITC-annexin V og propidiumjodidfarging. PC-3M-1E8 og MKN-45sci celler behandlet med TMTP1-DKK viste cellekrymping, membran oppløsning, og atom kondensasjon /fragmentering (figur 2E), som alle er karakteristiske morfologiske forandringer av cellene som gjennomgår apoptose. Mens TMTP1-DKK ikke påvirke disse normale cellenes levedyktighet og morfologi under fase-kontrast mikroskop (figur 1B). FACS-analyse indikerte også at TMTP1-DKK indusert celle apoptose i en doseavhengig måte ved doser på 10 uM eller høyere, sammenlignet med kontroll (figur 3A og C).
Celler ble behandlet over natten med 10 uM TMTP1- DKK peptidet og deretter analysert ved hjelp av strømningscytometri ved 12 timer, 24 timer og 48 timer. Prolifererende PC-3M-1E8 celler og MKN-45sci celler behandlet med TMTP1-DKK peptid (fylte søyler) viste en nedgang i levedyktighet gjennom apoptose over tid (
P
0,01). Imidlertid murine fibroblaster NIH /3T3-celler viste ingen signifikante endringer. B signalmolekyler som er involvert i den apoptotiske effekt av TMTP1-DKK peptid behandles. Dyrkede celler behandlet med 10 uM TMTP1-DKK peptid i 24 timer ble høstet og lysert. Totale celleproteiner ble oppløst ved 12% SDS-PAGE-gel elctrophoresis og deretter overført til en nitrocellulosemembran. Etter blokkering med 5% fettfri melk ble membranene inkubert i 1 time med 1 ug /ml primære antistoffer (kaspase 9 (35 KD, 17 KD), kaspase-8 (20 KD) og kaspase 3 (19 KD)), etterfulgt av pepperrot peroksidase-konjugert anti-kanin sekundære antistoffer. Blottene ble utsatt for kjemiluminescens substrat og utviklet med Hyperfilm MP. C PC-3M-1E8-celler og MKN-45sci celler ble utfordret med 10 uM TMTP1-DKK i nærvær (+) av 40 pM Z-VAD-FMK i 24 timer. Etter 24 timer ble cellelevedyktigheten analysert. Det brede spekter kaspaseinhibitor Z-VAD-FMK redusert apoptose frekvensen av PC-3 M-1E8 og MKN-45sci celler.
TMTP1-DKK aktiverer både mitokondrie og Fas-avhengige apoptose veier
D (KLAKLAK)
2 er en amfipatisk D-aminosyre peptid som binder seg selektivt til bakterie-, men ikke eukaryot cellemembraner [9]. I eukaryoter, initierer det apoptose gjennom forstyrrelse av mitokondriene, antagelig fordi membranene til mitokondrier likne de av bakterier [10]. Det er to store signalveier for apoptose: extra Fas død reseptor sti og den intracellulære mitokondrie vei. Å identifisere apoptotiske sti utløst av TMTP1-DKK behandling i PC-3M-1E8 og MKN-45sci celler, undersøkte vi uttrykket av caspase-3, 8 og 9 av western blotting. Bånd tilsvarende til aktiv kaspase 3 (19 kDa), caspase 8 (20 kDa), og caspase 9 (to bånd: 17 kDa og 35 kDa) ble detektert. Derfor, i TMTP1-DKK behandlede kreftceller, spalting av caspaser 3, 8 og 9 ble alle detektert. Dette indikerte at både Fas død reseptor sti og mitokondrie veien ble aktivert av TMTP1-DKK (figur 3B).
For ytterligere å validere at TMTP1-DKK forfremmet apoptose, testet vi om kaspaseinhibitorer kunne redusere TMTP1- DKK indusert apoptose rate i PC-3M-1E8 og MKN-45sci cellelinjer. Det brede spekter kaspaseinhibitor Z-VAD-FMK kan redusere apoptotisk frekvensen av TMTP1-DKK-behandlet PC-3 M-1E8 og MKN-45sci celler fra 45,2 ± 2,3% til 22,1 ± 1,3% og 53,7 ± 2,6% til 25 ± 0,8 % henholdsvis (figur 3C). Disse resultatene tyder på at TMTP1-DKK indusert apoptose gjennom både den intracellulære mitokondrie sti og Fas død reseptor sti.
TMTP1-DKK hemmer invasjonen av tumor
in vitro
Å undersøke hvorvidt TMTP1-DKK berørte celler invasjon, PC-3M-1E8 og MKN-45sci cellene ble behandlet med enten TMTP1-DKK eller filter-sterilt vann i 12 timer, derefter hvilken celle invasjon ble bestemt ved en matrigel invasjon analyse (figur 4A) . Den cellulære migrasjon rate på PC-3M-1E8 celler ble redusert med 52,38 ± 3,3% når cellene ble behandlet med 2 mikrometer av TMTP1-DKK peptid. Tilsvarende cellemigrasjon av MKN-45sci celler ble redusert med 46,16 ± 2,7% under samme forhold (figur 4B).
Celler ble inkubert med 2 mikrometer TMTP1-DKK peptid for 12 timer. Transwell migrasjon analyser av PC-3M-1E8 celler og MKN-45sci celler ble utført. Etter 24 timers inkubering ble cellene fra den øvre siden av filteret fjernet og celler fra den nedre overflate av filteret ble fiksert og farget. Dataene er gjennomsnitt ± SE av tre uavhengige eksperimenter; hver utført in triplo. B Cellular migrasjon ble redusert med 52,38 ± 3,3% i PC-3M-1E8 celler og 46,16 ± 2,7% i MKN-45sci celler i forhold til de aktuelle kontrollene.
TMTP1-DKK hemmer tumorvekst og utvikling
in vivo
neste søkt å utforske hvis TMTP1-DKK peptid kan representere en mulig terapeutisk strategi for å undertrykke tumorvekst
in vivo
. For å teste dette, analyserte vi effekten av TMTP1-DKK på subkutan tumorvekst i mus. MKN-45sci ortotopisk magekreft og PC-3M-1E8 prostatakreftceller ble injisert subkutant i mus som deretter ble behandlet med 50 uM TMTP1-DKK, TMTP1 eller filter-sterilt vann gjennom intraperitoneal (IP) injeksjon hver annen dag. PC-3M-1E8 tumorbærende mus behandlet med TMTP1-DKK viste en økning i overlevelse fra 55 dager (varierer fra 49 til 58 dager) til 65 dager (variasjonsbredde fra 60 til 69 dager) sammenlignet med kontrollgrupper. I mellomtiden, overlevelse av MKN-45sci tumorbærende mus økte fra 35 dager (range fra 29 til 39 dager) til 42 dager (varierer fra 35 til 44 dager) ved behandling med TMTP1-DKK.
TMTP1 -DKK behandling også markert hemmet tumorvekst i PC-3M-1E8 subkutan prostatakreft og MKN-45sci ortotopiske magekreft bærende mus. Det gjennomsnittlige volum av begge typer xenografttumorer krympet i TMTP1-DKK behandlede gruppen sammenlignet med kontrollgruppen (figur 5B, C). Førti dager etter injeksjon, PC-3M-1E8 subkutan prostatakreft xenograft tumor volum var i gjennomsnitt 18% som av kontroll i TMTP1-DKK behandlede mus (figur 5D). Videre undersøkte vi om TMTP1-DKK peptid indusert apoptose i xenograft prostatakreft
in vivo
av TUNEL analysen. Antallet observerte apoptotiske celler økte i TMTP1-DKK peptid behandlede gruppen i forhold til kontroll. Således viser disse resultater en kraftig anti-tumoreffekten til TMTP1-DKK peptid
in vivo
.
A Mus behandlet med TMTP1-DKK peptid overlevde lenger enn kontrollmusene ble behandlet med en ekvimolar blanding av TMTP1 peptid eller filter-sterilt vann, som vist ved en Kaplan-Meier-overlevelses plot. B, C PC-3M-1E8 prostatakreft og MKN-45sci orthotopic magekreft behandlet med TMTP1-DKK peptid var mindre enn de som ble behandlet med kontroll peptid. D Tumorvekst i PC-3M-1E8 tumor-bærende mus som gjennomgår TMTP1-DKK peptidet terapien. Mus ble behandlet i løpet av en periode på 40 dager (
n
= 9). Under behandlingsperioden ble tumorer målt to ganger i uken. Tumorer volum hos mus behandlet med TMTP1-DKK peptid var i gjennomsnitt 18% av størrelsen av kontroll. Tumorvolumene ble vurdert på dag 1 (○) og dag 40 (•). P 0,05, t-test. E Dyrene ble avlivet seks dager etter TMTP1-DKK behandling. Tumoren ble utvunnet og avbildes umiddelbart etter analyse av apoptotisk celledød ved TUNEL assay. Antallet av apoptotiske celler øket spesielt i TMTP1-DKK peptid behandlede tumorer. en, Forstørrelse: × 100. b Forstørrelse:. × 200
TMTP1-DKK undertrykker metastase og progresjon av MKN-45sci ortotopiske transplantater i atymiske mus
For å teste om TMTP1-DKK kan redusere metastaser
in vivo
, undersøkte vi effekten av dette peptid i en metastase modell. Ortotopisk implantering av humane magekreft MKN-45sci fragmenter inn i magen av seks nakne mus forårsaket en betydelig økning i antallet av metastatiske vev, inkludert fire levermetastaser, to milt metastase, tre bukveggen metastase, en nyre metastase, og to mesenteriske lymfeknuter metastaser (en kontroll mus døde innen 16 dager etter implantasjon). Imidlertid IP administrasjon av TMTP1-DKK annenhver dag i 20 dager forårsaket en dramatisk og doseavhengig reduksjon i antall metastatiske vev, uten noen metastaser som observeres i seks TMTP1-DKK behandlede nakne mus (figur 6A, C). I tillegg, H E farging. D ortotopisk gastriske tumorer ble gjenvunnet og avbildes umiddelbart etter analyse av apoptotisk celledød ved TUNEL assay. Kolonner, gjennomsnittlig antall tunel-positive celler telles i tre tilfeldig utvalgte felt i tre tumorprøver fra hver gruppe; feilfelt, SD. *, P . 0.001 av Student t test sammenlignet med kontrollgruppen
TMTP1-DKK-behandlede mus overlevde godt og viste ingen tegn på toksisitet eller vekttap gjennom eksperimenter. Sammen er disse resultatene tyder på at TMTP1-DKK kan hemme tumormetastaser og tumorvekst
in vivo
.
Diskusjoner
behandling av kreft ved hjelp av mikromolekylære therapeutics som oligonukleotider eller peptider krever effektive leveringssystemer som kan intracellulær penetrasjon. Nylig ble en serie av nye peptider identifisert som binder seg spesifikt til plasmamembranen av både kreft og tumorassosierte endotelceller. De identifiserte peptider ble lovende alternativer til tiden anvendes biomolekyler for målretting metastatiske celler på grunn av deres hurtige blodclearance, øket diffusjon og penetrasjon vev, ikke-immunogene natur, og enkel syntese [21], [22], [23], [24], [25]. Vi har tidligere vist at okkult metastaser eller subkliniske mikrometastaser ble tydelig påvist ved TMTP1 [11]. I denne studien har vi undersøkt videre om TMTP1 kunne levere terapeutiske midler effektivt. Vi undersøkte evnen til TMTP1 å levere en proapoptotiske peptid til høyt metastatiske kreftceller ved å koble den til pro-apoptotiske
D (KLAKLAK)
2 domener. Vi valgte syntetisk 14-amino-syre peptid KLAKLAKKLAKLAK fordi det var inert utenfor cellene, men ble giftig når internalisert forårsaker ødeleggelse av mitokondrie membranen, noe som fører til programmert celledød.
Våre data viser at TMTP1-GG-
D (KLAKLAK)
2 bundet spesifikt til høyt metastatiske tumorcellelinjer, prostatakreft celle PC-3M-1E8 og magekreft celle MKN-45sci
in vitro Hotell og
in vivo
. Men TMPT1-GG-
D (KLAKLAK)
2 ikke binde til nometastatic prostatakreft celle PC-3M-2B4 og murine fibroblast cellelinje NIH /3T3 normal mammary epitelceller MCF-10A, normal leveren celle lo2 og HEK293 celler (figur 1). Resultatene viste at TMTP1-DKK ikke påvirke disse normale cellenes levedyktighet og morfologi. Siden vi observerte FITC-TMTP1-GG-
D (KLAKLAK)
2 binding til begge cellelinjer og xenografttumorer i nakne mus, begrunnet vi at TMTP1 vil målrette levering av pro-apoptotiske peptid til høyt metastatiske svulster.
Vi undersøkte videre anti-tumor effekter av TMTP1-DKK fusjon peptid. Våre resultater viser at TMTP1-DKK mediert bemerkelsesverdig anti-tumor aktivitet både i
n vitro Hotell og
in vivo
, sammenlignet med enten TMTP1 eller DKK alene. Sammensmeltingen peptid TMTP1-DKK indusert apoptose raskt og potent. Lave konsentrasjoner av TMTP1-DKK kan indusere kreft celledød mens effekten på de murine fibroblast celler NIH /3T3. TMTP1-DKK viste høye anti-tumor effekt på høyt metastatisk MKN-45sci og PC-3M-1E8 celler, sammenlignet med TMTP1. DKK alene ikke kunne utløse apoptose som det ikke kunne bli omformet til cytoplasma av tumorceller. Når knyttet til målretting peptid TMTP1, mikromolare nivåer av DKK resultert i minst 100 ganger økning av drepte effektivitet i kreftceller. Interessant, den økte effektivitet drepte ble ikke observert i muse-fibroblast cellelinje NIH /3T3. Videre TMTP1-DKK vesentlig hemmet invasivitet av tumorceller
in vitro
i en transwell analysen. Disse dataene viser også den modulære natur målretting /transduksjon domene og pro-apoptose domene i TMTP1-DKK. Hvert domene overfører sine egenskaper ved den koblede peptidet for å generere et biologisk aktivt middel.
D (KLAKLAK)
2 har antibakteriell aktivitet, men er relativt ikke-toksiske for eukaryote celler. Imidlertid har det vist seg at hvis
D (KLAKLAK)
2 blir levert inn i cytoplasmaet til pattedyrceller, forstyrrer det mitokondrier, på grunn av likheten av mitochonrdrial og bakterielle membraner, og initierer apoptose [26]. Tidligere studier har vist at når
D (KLAKLAK)
2 ble konjugert til et målsøkende peptid gjennom et GG linkeren som det hjem til tumor vaskulaturen og er selektivt cytotoksisk til angiogene endotelceller, og hadde anti-tumor-aktivitet
i vivo product: [26]. Etter intern, apoptosiske
D (KLAKLAK)
2 peptid handlet ved å bryte ned mitokondrielle membranen, noe som fører til cytokrom c utstrømning inn i cytoplasma resulterer i apoptose. I cytoplasma, danner cytokrom c et kompleks med Apaf-1 og procaspase-9. Interaksjon med procaspase-9 resultater i sin spalting og aktivisering, initiere spalting av nedstrøms effektor kaspaser. I vår studie observerte vi aktivert caspase 9 av western blot i TMTP1-DKK behandlet kreftceller, noe som tyder på involvering av mitokondrie pathway (figur 3). Vi har også observert aktivering av caspase 8, som foreslo Fas-ligand ekstracellulære celledød veien var involvert i TMTP1-DKK indusert apoptose også. Effektiviteten av TMTP1-DKK indusert apoptose ble hemmet av det brede spekter kaspaseinhibitor Z-VAD-FMK i PC-3M-1E8 og MKN-45sci celler. Derfor vår studie viste at TMTP1-DKK utløst apoptose gjennom både mitokondrie sti og død reseptor veien.
TMTP1-DKK syntes å selektivt hemme tumorvekst og har liten effekt på andre vev i det subkutane xenograft og orthotopic transplantasjon mus modeller. Både subkutane xenografttumorer av PC-3M-1E8 og murine MKN-45sci ortotopiske mage svulster ble bemerkelsesverdig hemmet av TMTP1-DKK. Overlevelsestiden for tumorbærende nakne mus i begge modellene ble betydelig forlenget med TMTP1-DKK behandling. Opphør av terapeutisk peptid administrasjon førte til rask tumorvekst og død av forsøksdyr. Videre har vi gitt direkte eksperimentelle bevis i en preklinisk modell av effekten av forstyrrelser av ortotopisk veksten av humane magecancerceller i nakne mus ved både den primære område og metastaser. Vi observerte kreftmetastaser i alle ubehandlede dyr, men bare et fåtall i TMTP1-DKK behandlede dyr. Dermed blir resultatene fra de ortotopiske MKN-45sci xenografter avslørte at TMTP1-DKK effektivt hemmet tumormetastaser hos mus. De terapeutiske virkninger av TMTP1-DKK peptid
in vivo
ble også vist å være et resultat av tumorceller ved apoptose som vist ved en TUNEL assay (figur 5, 6).
Til sammen utgjør disse data tyder på at TMTP1-DKK er en effektiv anti-tumor middel både
in vitro Hotell og
in vivo
. Det utløste apoptose i en rekke svært metastatiske kreftceller via både mitokondrie sti og død reseptor veien. Våre resultater tyder på at TMTP1-DKK kan være en kraftig kandidat terapeutisk middel for metastatiske svulster basert på sin spesielle målgruppe og effektiv tumor-drapet aktivitet. Videre studier av TMTP1-DKK og dets analoger kan føre til oppdagelsen av nye anti-tumor og metastase agenter.
Materialer og metoder
Peptide design og syntese
TMTP1- DKK (NVVRQ -GG-
D (KLAKLAK)
2) og svTMTP1-DKK (VNQRV -GG-
D (KLAKLAK)
2), som er kontroll peptid av TMTP1 (NVVRQ) ble skapt ved å koble den rettet mot domene (TMTP1) og pro-apoptotiske
D (KLAKLAK)
2 domene gjennom en glycinylglycine bro som beskrevet [11]. Fluorescein-isotiocyanat (FITC) ble koblet til peptidet via en ytterligere glycin ved N-terminus. TMTP1-DKK og kontroll peptider (DKK, TMTP1 og svTMTP1-DKK) ble syntetisert ved hjelp av Fmoc kjemien i en fast-fase synthesizer og renset ved HPLC ved Xi’an Huachen Bio-tech Ltd (Xi’an, Kina). Sekvensen og strukturen til peptidene ble bekreftet ved massespektrometri. Peptider ble oppløst i filter-sterilt vann til en konsentrasjon på 1 mm.
Cellelinjer og reagenser
Den svært metastatisk og ikke-metastatisk menneskelige prostata kreft cellelinjer PC-3M-1E8 og PC-3M -2B4 henholdsvis ble vennlig levert av Dr. Jie Zheng (Peking University, Beijing, Kina) [27], [28]. Den humane magecancercelle lineMKN-45sci, murin fibroblast NIH /3T3-celler, normalt brystepitel epitelcellelinje MCF-10A, normal lever celle LO2 og HEK293-celler ble erholdt fra American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA). Alle celler ble opprettholdt i RPMI 1640 supplert med 10% føtalt kalveserum (FCS) ved 37 ° C med 5% CO
2. Z-VAD-FMK ble hentet fra Bachem (Heidelberg, Tyskland).
Bygging av musemodeller
Fire uker gamle BALB /c
nu /nu
mus ble innhentet fra SLAC Forsøksdyr Co Ltd (Shanghai, Kina). I direkte intratekal (IT) injeksjon studier ble 3 × 10
6 PC3M-1E8 celler suspendert i 100 mL normal saltløsning og injisert subkutant (SC) på de riktige flankene av mus (4-6 uker gamle). Tumorene fikk vokse til 4-6 mm i diameter før behandling. Friske tumorfragmenter (2 mm
3) ble deretter implantert SC inn i den bakre bagasjerommet på de bedøvde mus.
musemodell av MKN-45sci ortotopisk magekreft, som har potensiale for lever-spesifikk metastase ble vennlig levert av Dr. Jinjun Li (Shanghai Cancer Institute, Medical College of Shanghai Jiao Tong University, Shanghai, Kina) [29], [30], [31]. Friske tumorfragmenter ble oppnådd som beskrevet ovenfor. Etter mus bedøvelsen, ble magen eksponert og den del av den serosale membran skrapes med pinsett. En 1 mm
3 svulst stykke ble så fiksert på skrapte området av serøse overflaten med en 5-0 absorberende sutur.
