Abstract
Innledning
Et økende antall studier har undersøkt microRNAs (mirnas) som potensielle markører for diagnose, behandling og prognose. Så langt har avtalen mellom studier vært minimal, noe som kan delvis forklares med intratumoral heterogenitet av miRNA uttrykk. Hensikten med denne studien var å vurdere heterogenitet av et panel av utvalgte miRNAs i endetarmskreft, ved hjelp av to ulike tekniske tilnærminger.
Materialer og metoder
Uttrykket av de undersøkte miRNAs ble analysert av sanntids kvantitativ polymerase chain reaction (RT-qPCR) og
in situ
hybridisering (ISH) i vevsprøver fra 27 pasienter med T3-4 endetarmskreft. Fra hver tumor, ble vev fra tre ulike luminal lokaliseringer undersøkt. Inter- og intraindividuelle variasjonen ble vurdert ved å beregne intra korrelasjonskoeffisienter (ICCS). Sammenhenger mellom RT-qPCR og ISH ble evaluert med Spearmans korrelasjon.
Resultater
ICC
single (en prøve fra hver pasient) var høyere enn 50% for miRNA-21 og miRNA- 31. For miRNA-125b, miRNA-145, og miRNA-630, ICC
enkelt var lavere enn 50%. ICC
bety (gjennomsnitt av tre prøver fra hver pasient) var høyere enn 50% for miRNA-21 (RT-qPCR og ISH), miRNA-125b (RT-qPCR og ISH), miRNA-145 (ISH), miRNA-630 (RT-qPCR), og miRNA-31 (RT-qPCR). For miRNA-145 (RT-qPCR) og miRNA-630 (ISH), ICC
mean var lavere enn 50%. Spearman korrelasjonskoeffisienter, som sammenligner resultatene oppnådd med RT-qPCR og ISH, henholdsvis, varierte 0,084 til 0,325 for middelverdien fra hver enkelt pasient, og fra -0,085 til 0,515 i den seksjonen inklusive den dypeste delen av svulsten.
Konklusjon
intratumoral heterogenitet kan innvirke på målingen av miRNA ekspresjon og følgelig antallet prøver som trengs for representative anslag. Våre funn med to ulike metoder tyder på at en prøve er tilstrekkelig for adekvat vurdering av miRNA-21 og miRNA-31, mens flere prøver ville forbedre vurderingen av miRNA-125b, miRNA-145, og miRNA-630. Interessant, fant vi en dårlig sammenheng mellom uttrykk estimater innhentet av henholdsvis RT-qPCR og ISH, etter
Citation. Eriksen AHM, Andersen RF, Nielsen BS, Sørensen FB, Appelt AL, Jakobsen A, et al. (2016) intratumorale heterogenitet av mikroRNA Expression i endetarms kreft. PLoS ONE 11 (6): e0156919. doi: 10,1371 /journal.pone.0156919
Redaktør: Rajvir Dahiya, UCSF /VA Medical Center, UNITED STATES
mottatt: 29 mars 2016; Godkjent: 20 mai 2016; Publisert: 03.06.2016
Copyright: © 2016 Eriksen et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet:. All relevant data er i avisen og dens saksdokumenter filer
Finansiering:. prosjekt~~POS=TRUNC utgifter til forskningsmateriale ble dekket av Vejle Hospital Research Council. Den Funder ikke gi støtte i form av lønn for forfattere. Byrået for forskning og innovasjon gitt midler til BSN (Bioneer A /S). Finansieringsorganisasjoner ikke spille en rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:. BSN er ansatt Bioneer A /S, Danmark, et ikke -profit selskap eid av The Danmarks Tekniske universitet. Det finnes ingen patenter, produkter under utvikling eller markedsført produkter å erklære. Dette endrer ikke forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikk på deling av data og materialer.
Innledning
microRNAs (mirnas) er korte ikke-kodende RNA-molekyler som virker som negative genet regulatorer på post-transkripsjonelle nivå. Det er vel kjent at den samme miRNA kan påvirke flere gener, men også at det samme genet kan bli nedregulert ved forskjellige mirnas. Dermed mirnas representerer et komplekst regelverk fra sentrale biologisk betydning. Systemet er dysregulerte under ondartet transformasjon, og det er generelt antatt at endring av miRNA aktivitet spiller en sentral rolle i kreftutvikling [1-4]. Derfor har en betydelig og økende antall studier undersøkte mirnas som potensielle markører for diagnose, behandling og prognose. De kliniske implikasjoner, men har så langt vært minimal [5]. En årsak kan være ulike metodiske tilnærminger, som vanskeliggjør sammenligning av studier. En annen sak er forskjellig sammensetning og kvalitet på pasientmateriale undersøkt. Videre er litteraturen dominert av mange små studier uten etterfølgende godkjenning av relevante funn [5-10].
En annen viktig hindring er normalisering av sanntids kvantitativ polymerase chain reaction (RT-qPCR) data, ved måling miRNA uttrykk, som hensiktsmessig normalisering er viktig for å sikre pålitelige og reproduserbare resultater. Til tross for en økende antall miRNA ekspresjonsstudier, er litteratur sparsom når det gjelder pålitelig Normaliser kandidater [11-14].
intratumoral heterogenitet er en generell karakteristikk av ondartede svulster [15-17] og representerer en viktig hinder i studiet av tumorbiologi, mirnas er ikke noe unntak. Hittil har problemet blitt nesten neglisjert til tross for sin åpenbare betydning; aktivitetene til mirnas sannsynligvis vil variere i ulike deler av svulsten med potensiell stor innvirkning på klinisk anvendelse. Bare noen få publikasjoner har adressert problemet med intratumoral heterogenitet påvirker målingen av miRNA uttrykk. En studie er å håndtere problemet i brystkreft [18], en annen i leverkreft [19].
Disse utfordringene er særlig aktuelt hos pasienter med lokalavansert endetarmskreft, der behandling beslutninger er ofte basert på enkelt biopsier og senere tolkning av svulsten er påvirket av preoperativ strålebehandling [20, 21].
Formålet med denne studien var å analysere uttrykk heterogenitet av et panel av utvalgte miRNAs i endetarmskreft prøver ved to forskjellige tekniske fremgangsmåter, og for å klargjøre deres innbyrdes overensstemmelse. RT-qPCR ble valgt, siden det er allment akseptert som gullstandarden for miRNA uttrykk analyser.
In situ
hybridisering (ISH) ble valgt på grunn av sin evne til å visualisere cellulær lokalisering av de undersøkte miRNAs i tillegg til uttrykket nivå.
Materialer og Metoder
Pasienter og vevsprøver
for tjue-sju pasienter ble tilfeldig valgt fra en kohort av 239 pasienter som hadde gjennomgått reseksjon for endetarmskreft i Vejle Hospital, Danmark fra 1999 til 2008. Inkludering ble gjort bare hvis histopatologisk diagnose var rektal adenokarsinom pT3 eller pT4, hvis ingen preoperativ kjemoterapi-strålebehandling ble gitt, og hvis formalinfiksert parafin-embedded (FFPE) endetarmskreft vev var tilgjengelig fra tre ulike lokaliseringer av svulsten, inkludert luminal aspektet.
Ifølge de regionale Vitenskapelige etiske komiteer Syddansk, etikk godkjenning og skriftlig informert samtykke var ikke nødvendig, siden hensikten med studien var å utvikle ny metodikk og ingen kliniske data ble videre analysert (forskningsetikkloven gjennomgang av helse forskningsprosjekter, jfr § 14, § 1). Prøvene ble samlet inn under standard rektal reseksjon, og prosjektet ble gjennomført uten kunnskap om kliniske data. Studien ble registrert i det danske Datatilsynet og Den danske Registeret menneskelig vev Utnyttelse ble konsultert før eventuelle vevsprøver ble brukt
Tilgjengelige histologiske snitt farget med hematoxylin og eosin (H E). Ble undersøkt ved en patolog for å velge tre lokaliseringer fra hver svulst. Seksjonene måtte kuttes fra vevsblokker samplet fra tre ulike lokaliseringer, og alle måtte inkludere luminal aspekter av svulsten speiling de stedene hvor diagnostiske, endoskopiske biopsier ville ha blitt tatt. Ifølge dette valget, ble tilstøtende seksjoner kuttet fra hver av de FFPE- vevsblokker for heterogenitet analyser som følger: (a) en del for å være farget med H E for identifisering av aktuelle området (ROI), (b) fire seksjoner for ISH (5 mikrometer), (c) to seksjoner å være farget med hematoksylin for RT-qPCR (8 mikrometer), (d) en look-up delen for å være farget med H E. På en utskrift av H E farget delen svulsten og svulstens mikromiljø ble identifisert av patolog og omkranset som områder av interesse (ROI). Deretter merkingen ble overført til den digitale hele lysbildet bilde av ISH-lysbilde, og til H E farget seksjonen og hematoxylin farget seksjon for RT-qPCR. For RT-qPCR-analyse, ble det markerte område fjernes ved hjelp av en skalpell og oppsamlet i 1,5 ml RNase-frie PCR-rør inneholdende en dråpe etanol (99%) (S1 og S2 figurene).
Target mirnas og Normal mirnas
Fem mål mirnas ble valgt basert på litteratursøk: miRNA-21 basert på sin velkjente oppregulering i tykk- og endetarmskreft (CRC) og foreslo nedregulering etter neo-adjuvant kjemoterapi-strålebehandling [6, 9, 22]; miRNA-31 basert på den positive sammenhengen mellom uttrykksnivå og stadium av CRC [4, 23]; miRNA-125b, miRNA-145, og miRNA-630 basert på deres forslag oppregulering i endetarmskreft vev etter neo-adjuvant kjemoterapi-strålebehandling [6-8].
Adressering spørsmålet om normalisering vi nylig utført en studie på miRNA uttrykket profilering for å identifisere og validere referanse gener for relativ kvantifisering av miRNAs. MikroRNA-193a-5p, miRNA-27a, og la 7g ble identifisert som den mest stabilt uttrykt mirnas i vår kohort av endetarmskreft, og ble derfor brukt som Normalisering i denne studien [24].
Expression analyse ved RT-qPCR
RNA ekstraksjon.
RNA ble isolert fra mikro dissekert FFPE vev ved hjelp av miRNeasy FFPE Kit (Qiagen, Tyskland) i henhold til produsentens instruksjoner. Første trinnet var å legge en lysebuffer inneholdende proteinase K, fulgt av en kort inkubasjon ved 70 ° C. Dette ble etterfulgt av DNase-behandling og RBC-buffer behandling. Etanol ble tilsatt, og prøven ble applisert på en RNeasy MinElute spinnkolonne, hvor det totale RNA, inkludert miRNA, ble bundet til membranen. Til slutt ble totalt RNA eluert i 14 mL RNase-fritt vann.
RT-qPCR.
Custom TaqMan® mikroRNA Enkelt Analyser (Life Technologies, CA, USA) for HSA-brev 7g 002282, HSA-MIR-193a-5p 002281, HSA-MIR-27a 000408, HSA-MIR-21 000397, HSA-MIR-31 002279, HSA-MIR-125b 000449, HSA-MIR-145 002 278, og hsa- MIR-630 001563 ble brukt i henhold til produsentens standardinstruksjoner om lav sample-inngang (LSI).
Custom mikroRNA RT Primer Pool og Custom mikroRNA PreAmp Primer Pool for å analysere de ovennevnte mirnas ble opprettet i henhold til protokoll for å lage Custom RT og preamplification Pools bruker TaqMan® mikroRNA Analyser (Publication delenummer 4465407, Life Technologies).
RNA ble revers-transkribert ved hjelp av Tilpasset mikroRNA RT Primer Pool. Hver RT reaksjon inneholdt 3 pl total RNA og 12 mL RT reaksjon mix fra TaqMan® mikroRNA Reverse Transcription Kit.
Preamplification (12 sykluser) ble utført med Custom mikroRNA PreAmp Primer Pool, hver reaksjon inneholder 2,5 mikroliter RT Vare , TaqMan® PreAmp Master Mix (2X) og PreAmp Primer Pool i et totalt reaksjonsvolum på 25 ul. Den PreAmp Produktet ble fortynnet 1:40 i TE-buffer.
RT-qPCR analyser ble utført på Applied Biosystems 7900 HT Real-Time System bruker 1 mL fortynnet PreAmp produkt, TaqMan® mikroRNA Analyser og TaqMan® Universal Master Mix II NoAmpErase® UNG i et totalt reaksjonsvolum på 20 ul. Alle reaksjoner ble utført in triplo. Dataanalyse ble utført ved hjelp av SDS-programvare ver. 2.2.2 (Life Technologies).
Vann ble brukt som negativ kontroll. Det ingen mal kontroll ble inkludert i hele prosessen (RT, preamplification og qPCR) og analysert sammen med prøvene.
Relativ kvantifisering.
Gjennomsnittlige verdier av tredoble CQ-verdier ble brukt for videre analyse. Cq er definert som det PCR-syklus nummeret som fluorescensen møter terskel i forsterkningen plottet. Det aritmetiske gjennomsnittet av CQ verdier for miRNA-193a-5p, miRNA-27a, og la-7g ble brukt for normalisering som nevnt ovenfor.
ΔCq verdier ble konvertert til lineære verdier for statistiske analyser av ligningen lineær verdi (ΔCq) =
2
-ΔCq
forutsatt at forsterkningen effektiviteten i analysene var nær 100%.
Expression analyse ved in situ hybridisering
Forut for analysen, ble assay optimalisering utført for å bestemme optimale konsentrasjoner probe og hybridiserings-temperaturer. MikroRNA-31 ble ikke påvist i 10 prøver analysert i løpet av analysen optimalisering og ble derfor ikke ytterligere utforsket. ISH for miRNA-21, miRNA-125b, miRNA-145, og miRNA-630 ble utført som tidligere beskrevet [25] med de følgende konsentrasjoner: 20nm (miRNA-21 og miRNA-145), 30nm (miRNA-630), 50 nM (miRNA-125b). ISH-analyse ble utført ved anvendelse av en Tecan Freedom EVO automatisert hybridisering instrument (Tecan, Sveits), hvor de følgende trinn utført: pre-spaltning med proteinase-K (15 pg /ml) ved 37 ° C i 8 minutter, pre- hybridisering ved 57 ° C i 15 minutter, hybridisering med dobbel-karboksyfluorescein (FAM) merket Låst Nucleic Acid (LNA) prober (Exiqon A /S, Danmark) i 1 time. Den miRNA-125b ble behandlet ved 56 ° C. Etter stringente vask med saltvann-natrium-citrat-buffer probene ble påvist med alkalisk fosfatase-konjugert sau anti-FAM Fab-fragmenter, etterfulgt av inkubering i 4-nitro-tetrazolium og 5-brom-4-klor-3′-indolylphosphate (Roche, Danmark) i 60 minutter (90 minutter for miRNA-125b) resulterer i en mørk blå flekker, og til slutt kontra med atom rask rød (Vector Laboratories, CA, USA).
Bildeanalyse analyse~~POS=HEADCOMP og kvantifisering
Digitale hele lysbildene ble oppnådd med en x20 objektiv du bruker en Axio Scan Z1 lyse felt scanner (Carl Zeiss, Tyskland). Bildeanalyse av de digitale lysbildene ble utført ved hjelp VisiomorphDP programvare (Visiopharm, Danmark)
De områdene av ROI omkranset på H . E farget seksjonene ble skissert på ISH digitale hele lysbildene og farging gjenstander samt som vev gjenstander ble fjernet. Noen lysbilder var i dårlig tilstand forårsaket av brettet eller tapt vev, som er begrenset av størrelsen på området som inngår i avkastning. Vi fant ikke overraskende at bilder med en liten ROI (mindre enn 2 mm
2) bidro med ganske dramatisk variasjon, og de ble derfor utelatt fra de statistiske analysene. For miRNA-21 fem pasienter ble ekskludert; for miRNA-125b og miRNA-630 tre pasienter ble ekskludert; og for miRNA-145 fire pasienter ble ekskludert.
En piksel sorter ble trenet til å skille det blå ISH signal fra den røde counterstain, de ufargede og svakt farget vev, og vevet frie områder. Følgende parametre ble oppnådd under bildebehandlingen fra hver ROI: område med intens blå (ISH signal), område med svak blå (ansett bakgrunn ISH signal), område av lilla blå (blå plassert over atom rød), og det samlede arealet av den enkelte ROIs. De relative fraksjoner området (områder med blå farge av interesse delt på totalt ROI-området) ble ansett som representativ for den relative uttrykk for miRNA av interesse.
Dataanalyse
Alle data ble oppsummert ved hjelp standard beskrivende statistikk. Inter- og intraindividuelle variasjonen ble vurdert ved beregning av intra korrelasjonskoeffisienter (ICC), ved hjelp av en enveis tilfeldig effekt modell. Nærmere bestemt kan ICC i denne innstillingen betraktes som prosentandelen av den totale varians i prøvene utgjorde av forskjeller mellom pasienter som ble undersøkt. Hvis flertallet av variasjoner i utvalgs målingene er fra inter-pasient variasjon, er ICC høy (ICC → 1). Hvis flertallet av variasjonen er fra intra-pasient variasjon, er ICC lav (ICC → 0). Vi vurderte ICC både for enkeltprøver (ICC
singel) og for gjennomsnittet av prøvene innenfor pasienter (ICC
mean). ICC
enkelt gir et estimat av påliteligheten av en gitt prøve å gjengi informasjon om den aktuelle pasienten (sammenlignet med alle andre pasienter). Tilsvarende ICC
gjennomsnittsanslag påliteligheten av informasjonen gjengitt ved å ta gjennomsnittet av tre prøver fra en pasient.
Sammenhengen mellom RT-qPCR og ISH-fraksjoner for hver miRNA ble beregnet for enkeltprøver og for middelverdier for de enkelte pasienter ved hjelp av Spearman korrelasjonskoeffisienten.
for å illustrere de inter- og intra-pasient variasjon samt korrelasjon mellom RT-qPCR og ISH-verdier ble alle data normalisert for å tillate for plotting på en felles skala. For hver miRNA, ble middelverdien og standardavvik for alle RT-qPCR målinger av hver enkelt pasient beregnes, og en hvilken som helst individuell prøvemåling var normalisert til en standard skala ved å ekstrahere midlere og dividere den med standardavviket. Dette ble også gjort for alle ISH målinger, for hver miRNA. De resulterende verdier for både RT-qPCR og ISH ble plottet separat for hver miRNA.
Resultater
RT-qPCR
uttrykk mønster av målet miRNAs (miRNA-21 , miRNA-31, miRNA-125b, miRNA-145, og miRNA-630) ble analysert i tre forskjellige prøver fra hver kreftprøve av RT-qPCR. MikroRNA-21, miRNA-31, miRNA-125b, og miRNA-145 viste forskjellige og målbare uttrykk nivåer, og alle de mirnas ble uttrykt i alle tre prøver fra hver tumor. MikroRNA-630 ble uoppdaget i to prøver fra to ulike pasienter. Utvalget av rå CQ nivåer var 17,4 til 21,6 for miRNA-21, 20,9 til 28,7 for miRNA-31, 20,4 til 26,3 for miRNA-125b, 15,9-24,4 for miRNA-145, og 28,5 til 36,7 for miRNA-630. Et par slengere av de tredoble RT-qPCR målinger ble fjernet fra datasettet før videre analyser. Etter normalisering ble ΔCq verdiene konvertert til lineære verdier for videre analyse.
In situ hybridisering
relative uttrykk estimater for målet mirnas (miRNA-21, miRNA-125b, miRNA-145, og miRNA-630) ble oppnådd ved bildeanalyse av de ISH-fargede objektglass (Tabell 1) sikret miRNA-21 ISH resulterte i et sterkt signal i det stromale vev som omgir epiteliale tumorceller som også er beskrevet tidligere [25, 26]. Et sterkt signal i enteriske neuroner i det stromale vev og et svakere signal i andre stromale celler ble detektert for miRNA-125b. ISH for miRNA-145 resulterte i et sterkt og et svakt signal hovedsakelig i glatte muskelceller og myofibroblastic celler som omgir tumorcellene [26, 27]. MiRNA-630 ISH viste farging av tumorceller og en undergruppe av de tilstøtende stromale celler. Både sterke og svake ISH signaler ble vurdert i bildeanalyse. Eksempler på ISH signaler for miRNA-21, miRNA-125b, miRNA-145, og miRNA-630 med tilsvarende klassifiserte bildene er vist i figur 1.
ISH signalet som tilsvarer den blå fargen i venstre rad. St: stroma; Ca: epiteliale kreftceller. (A) Ekspresjon av miRNA-21 hovedsakelig til stede i stroma i tilknytning til de epiteliale kreftceller. (B) Pixel klassifikator tilsvarende bilde A. (C) Uttrykk for miRNA-125b med sterk ISH-signal til stede i en ente nevron (piler) og svakere ISH signal som representerer ulike stromale celler. (D) Pixel sortertilsvarende bilde C. (E) Ekspresjon av miRNA-145 hovedsakelig til stede i glatte muskelceller (SMC) og myofibroblastic celler. (F) Pixel sortertilsvarende bilde E. (G) Ekspresjon av miRNA-630 spredt i epitel-tumorceller og tilstøtende stromale celler (piler angir eksempler på ISH-positive celler i stroma). (H) Pixel klassifikator tilsvarende bilde G.
intra korrelasjonskoeffisient (ICC)
ICC for hver miRNA ble beregnet for både RT-qPCR og ISH som vist i tabell 2. for miRNA-21, miRNA-145, og miRNA-630, ble TBP-fraksjonen (dvs. alle blå farger) som brukes, men for miRNA-125b vi ikke inkludere områder med intens blå flekker som representerer de enteriske nerveceller .
Sammenheng mellom qPCR og ISH
Spearman korrelasjonskoeffisient ble beregnet til å sammenligne resultatene oppnådd ved RT-qPCR og ISH, henholdsvis (Tabell 3). For ISH, når man sammenligner med RT-qPCR ble TBP-fraksjonen (alle blå farger) som brukes for alle fire mirnas, siden RT-qPCR måler den totale uttrykk for miRNA av interesse, uavhengig av lokalisering. Generelt er det var en dårlig korrelasjon mellom estimatene som oppnås ved de to teknikkene med korrelasjonskoeffisienter som strekker seg 0,084 til 0,325 for gjennomsnittsverdien for hver enkelt pasient, og som strekker seg fra -0,085 til 0,515 i den seksjonen inklusive den dypeste delen av hver tumor.
intra- og inter-pasient variasjon og korrelasjonen mellom RT-qPCR og ISH for miRNA-21, miRNA-125b, miRNA-145, og miRNA-630 er illustrert i figur 2. for miRNA-31 (RT-qPCR, bare) se S3 fig
Alle data ble normalisert til plottes på en felles skala. se hovedteksten for detaljer. Hver vertikal linje representerer rekkevidden av de tre tiltakene som oppnås i den enkelte pasient med forskjellige farger for å representere RT-qPCR og ISH målinger, henholdsvis. For hver miRNA ble pasientene sortert i henhold til gjennomsnittlig RT-qPCR måling for plotting.
Diskusjoner
Et økende antall studier fokuserer på mirnas som potensielle biomarkører i kreftdiagnose og behandling , men de avvikende og motstridende resultater i litteraturen er et stort hinder for klinisk anvendelse [5, 21]. Situasjonen krever en kritisk tilnærming til metodologiske aspekter blant som heterogenitet rangerer høyt.
Tissue heterogenitet er en generell karakteristikk av ondartede svulster. Det er velkjent at mikromiljøet varierer i løpet av tumor med virkning på vekst, proliferasjon og metastatisk potensiale. Oppførselen av tumor mutasjoner er inkonsekvent, også [16, 17]. Derfor har saken avgjørende betydning i biomarkør forskning med perspektiver av klinisk anvendelse. Dette gjelder også for miRNAs. Denne studien adressert heterogenitet problem å sammenligne to ulike metoder for miRNA uttrykket analyse.
Litteraturen håndtere miRNA og intratumoral heterogenitet er sparsom. Raychaudhuri
et al
. (2012) undersøkte intratumoral heterogenitet av et panel av mirnas i brystkreft [18] ved RT-qPCR. De fant en variasjonskoeffisient (CV) på 40% i løpet av primærtumorprøver og konkludere med at, kan intratumoral heterogenitet føre til betydelige prøvetaking og skjevhet, vurdering av miRNA profiler kan kreve sampling på flere forskjellige tumor steder. Peveling-Oberhag
et al
. (2014) [19] utførte en miRNA profilering i leverkreft sammenligne ulike avdelinger av leversvulster og fant at miRNA feilregulering varierer innenfor kreft avdelinger. De to studiene kan ikke uten forbehold bli sammenlignet med våre resultater, som ingen av dem rapporterer ICC. På den annen side, de begge rapporterer betydelig intratumoral heterogenitet i samsvar med foreliggende studien.
Så langt vi kjenner til, er dette den første studien å vurdere intratumoral heterogenitet av miRNAs i endetarmskreft. Videre er vi ikke kjent med andre studier som gjelder de to teknikker for RT-qPCR og ISH på tilstøtende deler av vev for å belyse deres felles samstemmighet. RT-qPCR ble valgt, siden det er allment akseptert som gullstandarden for miRNA uttrykk analyser. ISH ble valgt på grunn av dens evne til å visualisere den cellulære lokalisering av det undersøkte miRNA i tillegg til ekspresjonsnivået. Vi brukte vevsprøver fra pasienter med endetarmskreft å analysere intratumoral heterogenitet av et panel av miRNAs med potensiell klinisk relevans [4, 6-9, 22, 23].
Vi fant det totale omfanget av heterogenitet, som uttrykt ved ICC, til å være forskjellig for de fem mirnas. CV er ikke nyttig som en parameter i denne innstillingen, da den ikke gir et direkte mål på den intraindividuelle variasjon i forhold til den totale variasjon i målingene. ICC, men gir mulighet for sammenligning av intra- og inter-pasient variasjon i datasettene fra de to forskjellige metoder, og dermed gi et estimat av presisjon for de individuelle målingene som henviser til en bestemt pasient.
inter-pasient variasjon var høyere enn den for den intraindividuelle variasjon med hensyn til miRNA-21 og miRNA-31. Dette er en indikasjon på at de to mirnas har potensial som biomarkører, når analysere en prøve (f.eks en diagnostisk biopsi). Her fant vi det at ICC verdier for RT-qPCR og ISH var nesten identisk for miRNA-21, 0,848 og 0,838, henholdsvis. Disse verdiene er i god samsvar med Nielsen
et al
. (2011), som rapporterte en ICC-verdi for miRNA-21 ISH på 84% i CRC vev [25].
På den annen side, for miRNA-125b, miRNA-145, og miRNA-630, den ICC
singel var under 50%, noe som krever mer forsiktighet når man tolker resultatene fra en enkelt prøve. For miRNA-125b og miRNA-630 viste ISH analyse lavere ICC verdier (single og mener) enn RT-qPCR analyse, noe som indikerer en høyere intra-pasient variasjon for ISH analyse. For miRNA-145 var det en motsatt scenario med ISH analyse som viser høyere ICC verdier (single og mener) enn RT-qPCR analyse, noe som indikerer en høyere intra-pasient variasjon for RT-qPCR analyse. Derfor stole bare på ICC’er, ingen av de to teknikkene er bedre enn den andre
Interessant, fant vi en dårlig korrelasjon mellom resultatene fra RT-qPCR og ISH for alle miRNAs.; så selv om ICC (single og mener) er lik for RT-PCR og ISH for miRNA-21, resultatene er ikke sammenlignbare. Hovedforklaringen er sannsynlig å være iboende forskjeller i metodikk for RT-qPCR og ISH. F.eks forskjellig fra RT-qPCR teknikk, oppdager ISH teknikken både forløper og modne miRNAs. Imidlertid kan det ikke utelukkes at en del av en forklaring på dårlig korrelasjon kan være små forskyvninger av ROI når du kopierer det fra primærplotting til ISH digital hele slide image og lysbildet for RT-qPCR. Dette ville bety en forskjell i det analyserte området, særlig i stroma, hvor alle mirnas er representert.
Generelt har RT-qPCR en høy reproduserbarhet og er et forholdsvis rimelig metode anvendelig i de fleste laboratorier. FFPE vev er godt egnet for ekspresjon miRNA analyse utført på en liten mengde av vev med bare de modne mirnas å bli oppdaget. Imidlertid RT-qPCR omfatter flere forberedende trinn (RNA ekstraksjon, omvendt transkripsjon, Preamplification) hvori teknisk variant kan innføres, og i tillegg er riktig normalisering er avgjørende for å sikre reproduserbare resultater.
ISH teknikk presenterer flere fordeler , inkludert muligheten til å visualisere den cellulære lokalisering av de undersøkte mirnas i tillegg til ekspresjonsnivået. Den kvantitative ISH metoden krever standardiserte delen tykkelse, fordi de kvantitative estimatene ikke er normalisert mot en referansestandard. Andre forberedende tiltak som kan introdusere noe teknisk variasjon inkluderer proteolytisk forbehandling samt vev folder og løsrivelse. I tillegg er ISH en mer arbeidskrevende metode ikke er egnet for alle laboratorier, og tolking krever spesialisert personale
I den foreliggende undersøkelse var det mulig å visualisere den cellulære lokalisering av de undersøkte mirnas, og det tilsvarende ISH signal tillates for fokus på de aktuelle cellene i ISH dataanalyse. For miRNA-125b kan vi la ut den sterke ISH signal danne enteriske nerveceller ved beregning av ICC. For RT-qPCR, er det samme valget ikke er tilgjengelig, og miRNA-125b fra de enteriske neuroner er en del av den målte ekspresjonsnivå. Siden de enteriske nerveceller er til stede uavhengig av kreft, og etterlater dem ut av analysen vil være det mest nøyaktige ting å gjøre. I så fall RT-qPCR inkludert miRNA-125b fra de enteriske neuroner ville gi en forutinntatt anslag, og ISH vil sannsynligvis gi et mer korrekt resultat. Dette må være balansert med tap av saker i ISH analyser på grunn av brettet eller tapt vev. Dermed flere tilfeller var faktisk tapt for alle de analyserte mirnas, sannsynligvis på grunn av feilaktig festing av svulstene.
For alle mirnas ICC
mean var høyere enn ICC
singel. En lav verdi ICC kan bli forklart som en høy målestøy, mens en høy verdi angir ICC mindre målestøy. Det faktum at ICC
mean ble høyere enn ICC
enkelt tyder på at sammenslåing alle tre prøvene reduserer målestøy, men eneste tilgjengelige biopsi er ofte scenariet i klinisk praksis.
Stole på ICC’er beregnet her, var det ikke mulig å konkludere med hvilken av de to teknikkene, RT-qPCR eller ISH, gir de mest representative uttrykk estimater og dermed utgjør svulsten heterogenitet. Men for klinisk anvendelse av en metode, praktiske faktorer som antall biopsier som trengs for undersøkelse, tilgjengelighet og pris av fremgangsmåten, og tolkningen av resultatene er faktisk viktige faktorer
Som konklusjon, intratumoral heterogenitet bør vurderes i analysen av mirnas som biomarkører og miRNA analyse bør derfor utføres på alle tilgjengelige prøver. En prøve kan være tilstrekkelig i noen settinger som indikert for miRNA-21 og miRNA-31 i den aktuelle studien. Den dårlig korrelasjon mellom RT-qPCR og ISH antyder at resultatene som oppnås ved de to teknikker bør sammenlignes med forsiktighet. I en klinisk setting, synes RT-qPCR foretrekke som en enkel metode for å få reproduserbare resultater, men det kan ikke utelukkes at ISH metoden kan gi mer klinisk relevant uttrykk estimater.
Hjelpemiddel Informasjon
S1 Fig . Endetarmskreft prøven for miRNA uttrykk analyser. Product: (A) fra overfladiske /luminal del av svulsten ble tre forskjellige steder (røde piler) valgt for undersøkelse. (B) De seksjoner for RT-qPCR og ISH ble kuttet samtidig som tilstøtende seksjoner. Regionen av interesse (ROI) ble omringet på en utskrift av digitale hele lysbildet bilde av HE-delen. ROI ble overført til de digitale hele lysbildene av ISH-bilder og til de deler som er skåret for RT-qPCR
doi:. 10,1371 /journal.pone.0156919.s001 plakater (TIF)
S2 Fig. Region of Interest (ROI) product: (A) På en utskrift av H . E farget delen, ROI var preget av patologen.
