Abstract
Bakgrunn
Tykktarmskreft (CRC) er den tredje viktigste årsaken til kreftrelaterte dødsfall i verden. 5-fluorouracil (5-FU) er mye brukt til behandling av tykktarmskreft, men som en mono gjengir lave responsrater. Kolin kinase alfa (ChoKα), et enzym som spiller en rolle i celleproliferasjon og transformasjon, har blitt rapportert uttrykt i mange forskjellige tumorer, inkludert tykktarmssvulster. ChoKα hemmere har nylig inngått kliniske studier som en roman antitumor strategi.
Metodikk /hovedfunnene
ChoKα spesifikke hemmere, MN58b og TCD-717, har vist en potent antitumor aktivitet både
i vitro
og
in vivo
mot en rekke tumor-avledet cellelinje xenotransplantater inkludert CRC-avledede cellelinjer. Effekten av ChoKα inhibitorer i kombinasjon med 5-FU som et nytt alternativ for behandling av tykktarmskreft både
er blitt undersøkt in vitro
i CRC-tumor-avledede cellelinjer, og
in vivo
i muse xenoimplantater modeller. Virkningene på thymidilate syntase (TS) og tymidin kinase (TK1) nivåer, to enzymer som er kjent for å spille en viktig rolle i mekanismen for virkningen av 5-FU, ble analysert ved western blotting og kvantitativ PCR-analyse. Kombinasjonen av 5-FU med ChoKα inhibitorer resulterte i en synergistisk effekt
in vitro
i tre forskjellige humane tarmkreftcellelinjer, og
in vivo
mot humane tykktarm xenotransplantater i nakne mus. ChoKα hemmere modulere uttrykk nivåer av TS og TK1 gjennom hemming av E2F produksjon, noe som gir en rasjonell for virkningsmekanismen.
Konklusjon /Betydning
Våre data tyder på at både narkotika i kombinasjon skjerm en synergistisk antitumoreffekt på grunn av ChoKα inhibitorer drevet modulering av metabolisering av 5-FU. Den kliniske relevansen av disse funnene er sterkt støttet siden TCD-717 har nylig inngått Fase I kliniske studier mot solide tumorer
Citation. De la Cueva A, Ramírez de Molina A, Álvarez-Ayerza N, Ramos MA, Cebrián A, Pulgar TGD, et al. (2013) Kombinert 5-FU og ChoKα hemmere som et nytt alternativ behandling av tykktarmskreft: Bevis i humane tumorcellelinjer utvunnet og Muse xenografter. PLoS ONE 8 (6): e64961. doi: 10,1371 /journal.pone.0064961
Redaktør: Irina V. Lebedeva, Enzo Life Sciences, Inc., USA
mottatt: 25 mars 2011; Godkjent: 22 april 2013; Publisert: 10 juni 2013
Copyright: © 2013 de la Cueva et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet har vært finansiert av følgende tilskudd: Comunidad de Madrid (S-BIO /0280/2006 og S2010 /BMD-2326), Ministerio de Ciencia e Innovación (SAF2008-03750, SAF2011-29699, RD06-0020-0016 og RD12 /0036 /0019) og EU # 259737. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:. Juan Carlos lacal er grunnlegger av TCD Pharma og et medlem av sin vitenskapelige Advisory Board men ikke en ansatt i selskapet. TCD Pharma utvikler forbindelsen TCD717, en ChoKα inhibitor, som for tiden er i fase I kliniske studier. Dette endrer ikke forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikk på deling av data og materialer.
Innledning
Tykktarmskreft (CRC) er den første vanligste kreftsykdommen og er den andre årsaken til kreftdød i Europa med rundt 212.000 dødsfall hvert år [1]. Den mest studerte medikamentet i CRC er antimetabolitt 5-fluorouracil (5-FU), utviklet for over 50 år siden, [2]. 5-FU er en analog av uracil med et fluoratom. Virkningsmekanismen av cytotoksisitet består i misincorporation av fluoronucleotides til RNA og DNA, men de viktigste toksiske effektene formidles ved inhibering av nukleotid-syntese enzymet tymidylatsyntase (TS). 5-FU er mye brukt i behandlingen av en rekke kreftformer, inkludert CRC, bryst og hode og hals-kreft [3], [4]. Responsrater for 5-FU basert kjemoterapi som førstelinjebehandling ved avansert CRC kreft er bare 10-15% [5]. Kombinasjon av 5-FU med nye cytotoksiske stoffer som oksaliplatin og irinotekan har forbedret responsrate på 40-50% [6], [7]. Videre har nye biologiske midler, slik som det monoklonale antistoff cetuximab og bevacizumab demonstrert ytterligere fordeler i pasienter med metastatisk sykdom [8], [9]. Dermed er denne tilnærmingen oppnå viktige forbedringer, og fremmer nye terapeutiske strategier basert på kombinatoriske behandlinger.
kolin-kinase-alfa (ChoKα), det første enzym i Kennedy vei, er ansvarlig for syntesen av de store fosfolipid av den plasmamembraner, fosfatidylcholin (PC). Flere studier har vist at ChoKα spiller en viktig rolle i celle transformasjon og induserer
in vivo
tumorogenesis [10], [11]. Videre er ChoKα overuttrykt i tykktarm, bryst, lunge, prostata, ovarie og hematologiske svulster [11] – [16]. Basert på disse observasjonene har ChoKα blitt brukt som en ny molekylære mål å utvikle en ny antitumor-strategi. ChoKα hemmere (ChoKIs) er derivater av Hemicolinium-3 (HC3) struktur, en kjent kolin kinase inhibitor med en høy neurotoxicity
in vivo product: [17] – [19]. MN58b [20], [21] ble identifisert som en første generasjon HC3 derivat med potent antiproliferativ aktivitet
in vitro Hotell og effektiv antitumor aktivitet
in vivo
i nakne mus-systemer, inkludert kolon xenografter [10] , [21]. MN58b har blitt brukt som en modell for en ny generasjon av forbindelser, og en ledning molekyl for å studere virkningsmekanismen av denne nye klasse av antitumormedikamenter.
En andre generasjon av ChoKα inhibitorer har blitt syntetisert for å forbedre toleransen for ChoKα hemmere hos mus. TCD-717 har blitt valgt blant flere molekyler fordi det ga de beste resultatene
in vitro Hotell og
in vivo
(upubliserte resultater). ChoKα hemmere er svært spesifikke legemidler for kreftceller, siden primære celler er reversibelt arrestert i G1 og er i stand til å gjenopprette sine vekstkinetikk når stoffet er fjernet. Imidlertid er tumorceller utløst til celledød samtidig til en økning i de intracellulære nivåene av ceramider [22], [23]. Begge narkotika, MN58b og TCD-717, er avledet fra Hemicolinium-tre, og slik de er begge regnet konkurrerende hemmere med kolin på kolin bindende lommen [24] -. [26]
Det har blitt beskrevet at den kombinerte bruk av en kolin-kinase-spesifikk siRNA og 5-FU, resulterer i en synergistisk effekt på reduksjonen av celleproliferasjon av brystkreftceller [27]. Hensikten med denne studien var å undersøke antitumor effekt av den kombinerte bruk av kjemiske ChoKα hemmere og 5-FU, søker etter en alternativ behandling som ville tillate å forbedre 5-FU frekvensrespons i CRC behandling og redusere den tilhørende toksisitet. Den kliniske relevansen av denne nye behandlingen er sterkt støttet siden TCD-717 har nylig blitt godkjent for å gå inn kliniske studier mot solide tumorer (https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT01215864).
Resultater
ChoKα nivåer i menneskelig avledet kolorektal kreft cellelinjer
ChoKα nivåer ble analysert i de tre tykktarmskreft cellelinjer brukt i denne studien, DLD-en, HT29 og SW620 versus en ikke tumor kolorektal cellelinje CCD -841. Figur 1 viser at ChoKα nivå er omtrent 20-30 ganger høyere enn det primære cellelinjen. Dette resultatet er i overensstemmelse med tidligere analyser av ChoKα ekspresjon i tumorprøver, sammenlignet med matchede normale vev fra den samme pasient [11], og tilveiebringer en rasjonell for potensiell bruk av ChoKα inhibitorer i klinikken i kombinasjon med standard kjemoterapi.
ChoKα proteinnivåer av tre kolorektale svulstcellelinjer, DLD-1, HT29 og SW620 er sammenlignet i forhold til den ikke-tumoral kolorektal cellelinje CCD-841. den er representert kvantifisering nivåer (ChoKα /tubulin). Under den vestlige
ChoKα hemmere synergizes med 5-FU fremme celledød av tykktarm kreft celler
effekt på spredning av ChoKα hemmere i kombinasjon med 5-FU, ble bestemt i de tre kolorektale cancercellelinjer: DLD-1, HT29 og SW620. For å estimere de aktuelle konsentrasjoner for hver forbindelse, ble cellene behandlet med et bredt område av konsentrasjoner basert på deres respektive IC
50, alene eller i kombinasjon. Konsentrasjonene som ble benyttet var fra 1 til 6 um (MN58b og TCD717) og 2-8,5 uM 5FU både som samtidig- og sekvensielle behandlinger (fig S1). Den beste kombinasjon for å oppnå en effektiv synergisme som antiproliferative medikamenter var en sekvensiell behandling initiert av en ChoKα inhibitor og fulgt av 5-FU. Den inhiberende effekt ble kvantifisert ved MTT-analysen, og inhiberingsgraden ble analysert ved metoden til Chou og Talalay, og kombinasjonsindeksene (CIS) beregnet i henhold til den Calcusyn programmet [28]. Stykkene ble oppnådd når ChoKα inhibitorer TCD-717 og MN58b ble kombinert med 5-FU i DLD-1, HT29 og SW620 cellelinjer (figur S1). Cis- og et representativt tall for hver forskjellig CRC cellelinje ved sekvensiell kombinasjon av ChoKα inhibitorer og 5-FU er vist (figur 2).
6 x 10
3 tumor-celler ble dyrket i 96-brønners plater . Etter 24 timers inkubering ble cellene eksponert for TCD-717 (venstre paneler) i 24 timer eller MN58b (høyre panel) i 9 timer. Deretter ble mediet forandret til medium som inneholder 5-FU i 60 timer i form av plater som tidligere er behandlet med MN58b og i 24 timer i form av plater som ble behandlet med TCD-717. Cellelevedyktigheten ble evaluert ved MTT-analysen, og er representert som prosent av kontroll, ubehandlede celler. CI-verdi i hvert tilfelle er gjennomsnittet av tre uavhengige forsøk, hvert utført i quadruplicates. CI 1 indikerer en synergistisk effekt. Et representativt forsøk av tre uavhengige eksperimenter er vist.
Virkningen av denne kombinasjon ble undersøkt, og cellesyklusfordelingen indusert av TCD-717 og 5-FU alene eller i kombinasjon analysert (figur 3). Strømningscytometri-analyse viste en signifikant induksjon av celledød etter behandling med ChoKIs med en ytterligere økning i kombinasjon med 5-FU, noe som indikerer at den kombinerte behandling hadde en sterkere virkning enn de enkelte behandlinger. Tidligere studier har vist at tumorcellene er følsomme overfor ChoKα hemmere hvis de utsettes ved G1 fase, men blir ufølsom i S-fasen [23]. 5-FU eksponering indusert S fase akkumulering, men den kombinerte behandlingen drastisk redusert S fase akkumulering og økt celle dødelighet. Disse resultatene støtter kravet om en sekvensiell behandling igangsatt med ChoKα hemmere som forklarer mangelen på synergisme observert med alternative planer for behandling.
2,5 × 10
5 DLD-1 og SW620 cellelinjer ble sådd i 6 brønners plater og inkubert i 24 timer med TCD-717 fulgt av 5-FU i 24 timer alene eller i kombinasjon. Kombinasjonen av de to medikamentene økte celledød i forhold til de to medikamentene alene. Tabellene under grafikken angir prosentandelen av de forskjellige faser av cellesyklusen når vi behandler med TCD-717 og 5-FU alene eller i kombinasjon. * P. 0,05 sammenlignet de ulike cellesyklusfaser vs. kontroll
In vivo
synergisme av ChoKα hemmere og 5-FU i nakne mus
Effektene av kombinatoriske behandlinger av ChoKα hemmere og 5-FU på
in vivo
tumorvekst av DLD-en og SW620 transplantater i nakne mus ble neste undersøkt. DLD-1 xenotransplantater ble inokulert i atymiske mus, og når tumorer nådde standard volum på rundt 0,2 cm
3, ble musene tilfeldig delt inn i fire grupper (10 tumorer /gruppe) og behandlet etter den neste skjema: ChoKα inhibitorer ble administrert 2 mg /kg /dag tre ganger i uken i løpet av 3 uker, og 5-FU ble administrert ved 40 mg /kg /dag to ganger i uken i 3 uker. Tumor vekst ble registrert etter behandlingsstart. Tumorvolumene ble redusert i alle behandlede grupper uavhengig av behandlingen, sammenlignet med de av kontroll, ubehandlede mus (figur 4). Tumor vekst av kombinasjonsgruppene i hvert eksperiment var betydelig mindre enn de som ble behandlet med ChoKα inhibitorer eller 5-FU alene (p-verdier og 0,05). Indikerer en sterk reduksjon av tumorvolumet i kombinasjon planene
Mus ble utsettes til 2 mg /kg /dag av ChoKα hemmere tre dager i uken og 40 mg /kg /dag i 5-FU to dager i uken i kombinasjon eller alene i løpet av 3 uker. Tumorvekstinhibitering hastigheten er vist under hvert eksperiment. (A) DLD-1 tumorer behandlet med MN58b som ChoKα inhibitor og 5-FU. (B) DLD-1 tumorer behandlet med TCD-717. (C) SW620 svulster utsatt for TCD-717 og 5-FU.
Som en validering, SW620 xenotransplantater ble også undersøkt etter en identisk plan med en kombinasjon av TCD-717 og 5-FU. En statistisk signifikant effekt ble også observert i kombinasjonsbehandling (figur 4).
ChoKα hemmere modulere uttrykk nivåer av viktige enzymer involvert i metabolismen av 5-FU
Å belyse mekanisme denne synergistiske virkning av ChoKα inhibitorer og 5-FU, undersøkte vi effekten av ChoKα inhibitorer på uttrykket nivåer av nøkkelenzymer i den metabolske veien til 5-FU som tymidylatsyntase (TS) og tymidin kinase (TK1). SW620-celler ble behandlet med økende konsentrasjoner av inhibitorer ChoKα fra 2 til 10 uM (figur 5A) som viser en doseavhengig reduksjon i nivåene av disse proteiner. Deretter ble SW620, HT29 og DLD-1 behandlet med ChoKα hemmere (TCD-717 6 og 10 pM, MN58b 10 og 15 uM) og 5-FU (5,5 uM), alene eller i sekvensiell kombinasjon for å bestemme effektene på ekspresjon nivåer av disse enzymer (Figur 5B). Gratis (aktiv form) og trefoldig kompleks (inaktiv form) av TS og TK1 ble analysert ved western blotting. Som forventet, ble celler behandlet med 5-FU viste både TS ternære kompleks (øvre bånd) og de frie TS (nedre bånd). ChoKα inhibitorer induserte en betydelig nedregulering av både frie TS (aktiv form) og ternære kompleks (inaktiv form), så vel som TK1 (figur 5B). Dermed sekvensiell kombinasjon av ChoKα inhibitorer og 5-FU indusert begge mekanismer for inaktivering, redusert dannelse av ternære kompleks og en betydelig nedregulering av TS aktiv (fri form). I tillegg vil redusert ChoKIs TK1 nivå, påvirker også den mekanisme forbundet til 5-FU motstand. Denne effekten kunne forklare mekanismen for synergi mellom begge legemidler.
2,5 x 10
5 DLD-1, HT29 og SW620-cellelinjer ble utsådd i 6-brønners plater og inkubert i 24 timer. (A) SW620 cellelinje ble utsatt for økte konsentrasjoner av ChoKα inhibitorer i 24 timer. (B) SW620, HT29 og DLD-1-cellelinjene ble utsatt for to konsentrasjoner av ChoKα inhibitorer [TCD-717: 6 um (venstre linje) eller 10 pM (rett linje); MN58b: 10 um (venstre linje) eller 15 pM (rett linje)]. Hvor angitt, ble mediet fjernet etter behandling med ChoKα inhibitorer som ovenfor, og forandret til friskt medium med 5,5 uM 5-FU i ytterligere 24 timer. Protein uttrykket ble analysert ved western blot hjelp monoklonalt anti-thymidilate syntase TS106-klone for TS og monoklonale anti-tymidin kinase klone F12 for TK1. Figuren viser øverst en representant blot, ved bunn protein nivåer (totalt TS, TS aktive, og TK1 /tubulin) beregnes ved hjelp av gjennomsnitt ± SEM av tre uavhengige eksperimenter. (C) 2,5 x 10
5 SW620, ble HT29 og DLD-1-cellelinjer utsådd i 6-brønners plater og inkubert i 24 timer. (A) SW620, (B) HT29 og (C) DLD-1-cellelinjene ble utsatt for to konsentrasjoner av ChoKα inhibitorer [TCD-717: 6 um (venstre linje) eller 10 pM (rett linje); MN58b: 10 um (venstre linje) eller 15 pM (rett linje)]. Hvor angitt, ble mediet fjernet etter behandling med ChoKα inhibitorer som ovenfor, og forandret til friskt medium med 5,5 uM 5-FU i ytterligere 24 timer. Protein-ekspresjon ble analysert ved western blot ved anvendelse av anti-E2F1. Figuren viser øverst en representant blot, ved den nederste proteinnivåer (E2F1 /GAPDH) beregnet av gjennomsnitt ± SEM av tre uavhengige eksperimenter.
Både TK1 og TS er blitt vist å være under transkripsjonen kontroll av E2F1 [29], [30]. Dermed har vi undersøkt hvorvidt den drastiske reduksjon i nivåene av TK1 en TS etter Chok inhibering ble formidlet av en effekt på nivået av denne transkripsjonsfaktor. Som vist i figur 5C, i alle tre cellelinjer undersøkt, var en drastisk reduksjon i nivåene av E2F1 observert i samsvar med sin rolle som regulator av TS og TK1 syntese.
Deretter å undersøke potensialet induksjon av apoptose etter Chok inibition, som et kjennetegn på apoptose, ble nivåene av PARP analysert under lignende betingelser, og en drastisk reduksjon ble observert i PARP-nivåer i SW620 (figur 6A), HT29 (figur 6B) og DLD-1 (figur 6C) celle linjer etter behandling med kombinasjonen plan. PARP er et protein involvert i DNA-reparasjon og dens nedgang har en lignende fysiologisk betydning som i sin spaltning på grunn reduserte nivåer av PARP unngå DNA reparasjon og cellene blir utløst for å apoptose inngrep.
(A-C) SW620, HT29 og DLD-1 celler ble sådd som beskrevet i Materialer og Metoder og behandlet med to konsentrasjoner av ChoKα hemmere [TCD-717: 6 mikrometer (venstre linje) eller 10 mikrometer (høyre linje); MN58b: 10 um (venstre linje) eller 15 pM (rett linje)] i 24 timer og, hvor angitt, med 5,5 uM 5-FU eller kjøretøy i ytterligere 24 timer. Protein-ekspresjon ble analysert ved Western blot ved anvendelse av polyklonalt antistoff anti-PARP. Bak hvert diagram, viser data proteinnivåer (PARP /GAPDH) beregnet av gjennomsnitt ± SEM av tre uavhengige eksperimenter. (A) SW620. (B) HT29. (C) DLD-1. (D) PARP og ChoKα uttrykk nivåer i HT29 og SW620 cellelinjer transfektert med en spesifikk ChoKα siRNA bestemt ved Western blot-analyse eller en kontroll krafse siRNA (SCR). Protein-ekspresjon ble analysert ved Western blot ved anvendelse av ChoKα monoklonalt antistoff og polyklonalt antistoff anti-PARP. Under hvert Western forholdet PARP /Tubulin er representert. (E) Caspase 3-aktivitet (øvre panel) og dens spalting (nedre panel) ble bestemt i HT29-celler etter behandling med MN58b i 24 timer. (F) Caspase tre enzymatiske aktivitet ble også målt etter transfeksjon av HT29-celler med en spesifikk ChoKα siRNA eller en kontroll siRNA (SCR) i 48 timer. Western blot representerer nivåene av ChoKα etter transfeksjon og dens relative reduksjon normalisert til GAPDH nivåer.
HT29 og SW620 celler ble også transfektert med et spesifikt siRNA-ChoKα. Som vist i figur 6D, ble lignende resultater erholdt til de av ChoKα farmakologisk inhibering, med en drastisk reduksjon i PARP-nivåer, en indikasjon på spesifisitet på grunn av ChoKα inhibering.
Som et ytterligere bevis på induksjonen av apoptose etter Chok hemmere i tykktarm kreft celler, ble to alternative metoder for igangsetting av apoptotiske signal maskiner som brukes. Kaspase 3 aktivitet og spaltning lett ble detektert etter MN58b behandling av HT29-celler (Figur 6E). Nedregulering av ChoKα uttrykk av spesifikke siRNA økte også caspase aktivitet, ytterligere støtte av spesifisiteten av denne effekten basert på reduksjon av ChoKα aktivitet (figur 6F). Således Chok inhibitorer er i stand til å indusere apoptose ved aktiveringen av caspase 3.
Til slutt ble TS-nivåer analysert i tumorer som genereres fra
in vivo
xenograft modell DLD-1 etter behandling med MN58b og 5-FU og sammenlignet med kontroll, ubehandlede mus (figur 7). En statistisk signifikant reduksjon i TS-nivåer (både total og aktivt protein) ble observert i tumorer behandlet med MN58b alene eller i kombinasjon med 5-FU, mens ingen signifikant forskjell ble funnet i tumorer fra mus som var behandlet med 5-FU alene.
Mus ble inokulert med DLD-1-celler som angitt under Materialer og Metoder og enten ubehandlet eller behandlet med MN58b eller 5-FU alene eller i kombinasjon. A) TS uttrykk nivåer av hver eksperiment gruppe: Control, MN58b, 5-FU og kombinasjonsgruppen. Tubulin ble brukt som lasting kontroll. B) Diagram representerer bety protein nivåer som TS /tubulin forholdstall for hver gruppe. Svarte striper representerer totalt TS /tubulin verdier; Grå stolper representerer TS aktive verdier. (*) Statistisk signifikant (p 0,05)., Sammenlignet med kontroll gruppe
Nedregulering av mRNA-nivåer av TS og TK1 gen etter behandling med ChoKα inhibitorer og 5-FU i DLD-1, SW620 og HT29-celler
prekliniske og kliniske studier har vist at TS uttrykk er determinant av 5-FU følsomhet og klinisk utfall [31], [32]. I samsvar med disse resultatene, genamplifikasjon av TS med påfølgende økning i TS mRNA og protein, er blitt observert i cellelinjer som er resistente mot 5-FU [31], [33], [34].
basert på resultatene ovenfor, ble SW620, HT29 og DLD-1-celler behandlet med MN58b og TCD-717 i 24 timer. Behandling med inhibitorer ChoKα resulterte i en betydelig nedregulering av både TS og TK1 mRNA-nivåer som bestemt ved sanntids Q-PCR-analyse ved å bruke de spesifikke prober Hs00426591_m1 for TS og Hs01062125_m1 for TK1 (figur 8). Disse resultatene indikerer at den nedmodulering i protein nivåene av TS og TK1 indusert av ChoKα hemmere fører fra en drastisk reduksjon på transkripsjonsnivå, med en betydelig effekt på både TS, og dens berging svei mediert av TK1. Siden nivåene av E2F1 ble også drastisk redusert, er det rimelig å foreslå at denne transkripsjonsfaktor er ansvarlig for de observerte virkninger på TS og TK1 hemming som tidligere beskrevet [29], [30].
2,5 x 10
5 DLD-1, HT29 og SW620-cellelinjer ble utsådd i 6-brønners plater og inkuberes under optimale betingelser i 24 timer. Deretter ble cellene eksponert for forskjellige konsentrasjoner av ChoKα inhibitorer i 24 timer. Nivåer av TS og TK1 ble analysert ved RT-qPCR som beskrevet under materialer og metoder. 18S ble anvendt som endogene kontroll for normalisering.
De ovennevnte resultater ville være i overensstemmelse med en generell virkning på gentranskripsjon indusert av ChoKα inhibitorer. For å teste denne mulighet, ble mRNA-nivåer av andre proteiner også involvert i 5-FU virkningsmekanisme undersøkt. I motsetning til hva som ble observert med TS eller TK1, uridin fosforylase (
UPP1
) ble økt etter behandling med ChoKα hemmere (figur 9). Denne høyden kan være fysiologisk relevant fordi
UPP1
er ansvarlig for transformasjonen av 5-FU til en mellom metabolitt som vil bli konvertert til den aktive metabolitter fluorouridin trifosfat (FUTP) og fluordeoksyuridin trifosfat (FdUTP). Dermed trenger effektene observert på E2F1, TS og TK1 ikke svare på en generell, ikke-spesifikk effekt på gentranskripsjon.
2,5 × 10
5 DLD-en, HT29 og SW620 cellelinjer ble utsådd i 6-brønners plater og inkubert i 24 timer under standardbetingelser. Deretter ble cellene behandlet med ChoKα inhibitorer, TCD-717 (6 og 10 pM) og MN58b (10 og 15 uM) i løpet av 24 timer. 18S ble brukt som en endogen kontroll
Effekter av ChoKα hemmere på MAPK, AKT signale og ceramider nivåer
Som tidligere beskrevet av oss og Chesney gruppe [40] -. [42] inhibering av ChoKα har en effekt på MAPK-kinase og AKT signalveier med en drastisk reduksjon av de fosforylerte formene i flere celletyper. I samsvar med disse resultatene, når SW620-celler ble behandlet med ChoKα inhibitorer, ble en drastisk reduksjon i både p42 /P44 observert (figur 10A). Men i motsetning til tidligere rapporter på andre cellelinjer, ble ingen signifikant effekt observert i fosforylering av pakt-Ser
473 (figur 10B). Videre ble ingen effekt verken signalveien observert ved behandling av SW620-celler med 5-FU alene, og ingen vesentlig modifisering av virkningene observert når cellene ble behandlet med ChoKα inhibitorer ble observert i henhold til kombinasjonsforhold.
(A ) 2,5 x 10
5 SW620-celler ble utsådd i 6-brønners plater og inkubert i 24 timer og utsatt for to konsentrasjoner av ChoKα inhibitorer [TCD-717: 6 um (venstre linje) eller 10 pM (rett linje); MN58b: 10 um (venstre linje) eller 15 pM (rett linje)]. Hvor angitt, ble mediet fjernet etter behandling med ChoKα inhibitorer og forandret til friskt medium med 5,5 uM 5-FU i ytterligere 24 timer. Protein-ekspresjon ble analysert ved western blot ved anvendelse av monoklonalt anti-fosfo P44 /p42 MAPK og anti-P44 /P42 MAPK. Figuren viser en representativ blot av to uavhengige eksperimenter. (B) SW620-celler ble dyrket og behandlet som angitt i (A) med 15 uM MN58b og 5,5 uM 5-FU alene eller i kombinasjon i 24 timer. Protein-ekspresjon ble analysert ved western blot ved anvendelse av anti-pAKT- Ser
473, anti-AKT eller anti-GAPDH. Figuren viser på toppen en representant klatt nederst protein nivåer (Pakt-Ser
473 /total AKT /GAPDH) fra et representativt eksperiment. (C) 2 x 10
6 SW620 celler ble sådd i P100-plater og inkubert i 24 timer under standardbetingelser. Cellene ble deretter behandlet med 15 uM MN58b og 5,5 uM 5-FU alene eller i kombinasjon i 24 timer. Total ceramid-nivåene ble analysert ved hjelp av UPLC-TOF. Middelverdi ± SD av to uavhengige eksperimenter utført in triplo er vist.
Til slutt, generering av ceramider er observert spesielt i Jurkat-celler etter behandling med MN58B mens ingen signifikant økning ble observert i humane primære lymfocytter [22 ]. Dette kan være ansvarlig for induksjon av apoptose i dette cellesystem og kan også forklare den observerte synergisme i denne studien. Det ble imidlertid ingen effekt på ceramider nivåer observert etter 5-FU behandling alene eller etter kombinatoriske tidsplaner med MN58B og 5-FU (figur 10B), med unntak av denne mekanismen som er ansvarlig for synergisme observert når 5-FU ble kombinert med Chok hemmere.
Diskusjoner
Tykktarmskreft kreft~~POS=HEADCOMP er en av de vanligste årsakene til død av kreft på verdensbasis. Standard behandling for CRC er basert på 5-FU som førstelinje vanligvis i kombinasjon med andre cytotoksiske stoffer som oksaliplatin eller topoisomerase inhibitor CPT-11 (Irinotecan) [33] -. [35]
en bedre kunnskap om molekylærbiologi av CRC svulster har endret forvaltning av CRC pasienter, med status for K-Ras mutasjoner være en kritisk beslutnings problemet. Mange kliniske studier er i gang for å bedre tidsplaner for CRC pasienter, som for mange andre typer kreft. Men lave priser av kurative behandlinger gjør likevel nødvendig å utforske nye terapeutiske tilnærminger for å oppnå bedre priser i overlevelse. I denne forstand, har en svært aktiv søken etter nye behandlinger basert på kombi kjemoterapi og målrettet terapi generert nye lovende alternativer. Denne strategien er basert på tidsplaner som har hevet responsrater 10-15% med 5-FU alene til 40-50% i kombinasjon kjemoterapi [6], [7].
Målrettet terapi er en behandling med en fokusert mekanisme som spesifikt virker forstyrrende en godt definert mål eller biologisk sti [36]. For tiden er disse nye tilnærminger utgjøre et reelt løftet for forbedret styring og resultatet av kreftpasienter, fordi det spesielt virker mot kreftceller, og derfor bør ha færre bivirkninger enn andre typer av terapeutiske behandlinger.
ChoKα er overuttrykt i en stort utvalg av humane tumorer inkludert tykktarmskreft [11] – [16]. Økte nivåer av totalt kolin metabolitter, inkludert phosphocholine, produktet av Chok aktivitet, er også et felles trekk ved mange typer svulster [37]. Derfor er ChoKα en roman interessant mål for utvikling av kreftbehandlingen. Som en konsekvens er ChoKα inhibitorer blitt syntetisert for spesifikt å interferere med dens aktivitet [10], [18], [20], [21].
Kombinasjonen av siRNA-Chok med 5-FU i brystkreft cellene har vist en reduksjon av cellenes levedyktighet og proliferasjon [27]. Imidlertid avhenger denne behandlingen på bruk av et siRNA som transporteres ikke til målet cellene
in vivo
på en effektiv måte. Her bruker vi to kjemiske hemmere spesielt utviklet mot ChoKα (MN58b og TCD-717) med høy potens mot kreftceller
in vitro Hotell og
in vivo
, for å utforske effekten av kombinasjonen av 5-FU og denne nye målrettet terapeutisk tilnærming for å forbedre dagens CRC behandlinger. En sterk synergistisk antitumoreffekt når 5-FU og ChoKα inhibitorer ble anvendt i kombinasjon mot flere CRC-cellelinjene er rapportert.
Tidligere rapporter fra vår gruppe demonstrerer at induksjon av apoptose ved inhibering av ChoKα er knyttet til den spesifikke generasjon av ceramider i kreftceller [22], [23]. Det er observert en dramatisk forskjell i respons til spesifikke ChoKα inhibitorer mellom normale og kreftceller. Mens blokkering av
de novo
fosfokolin (PCho) syntese av MN58b i primære celler induserer Retinoblastom (Rb) defosforylering og fører til reversible cellesyklusarrest i G0 /G1 fase, tumorceller lide en drastisk slingre i metabolismen av hoved~~POS=TRUNC fosfatidylcholin, og sphingomyelin, noe som resulterer i en betydelig økning i de intracellulære nivåene av ceramider som fremmer apoptose [22], [23]. Disse innledende forsøk er gjengitt i flere celletyper, inkludert tykktarmskreft avledede cellelinjer (data ikke vist). Ytterligere bevis er blitt rapportert som indikerer en tydelig hemming av PI3K /AKT og ERK signalveier ved Chok inhibitorer [38], [39], [40]. Men i kjelleren systemer som brukes i denne studien, verken MAPK eller AKT signale eller ceramider generasjon er vesentlig endret med 5-FU behandling alene. Ingen signifikant effekt observeres enten når cellene ble behandlet med kombinatorisk regimer som viste en sterk synergisme begge under in vitro eller in vivo-betingelser. Disse resultatene helt tyder på at de tidligere effektene rapportert om virkningsmekanismer av ChoKα hemmere enten på MAPK, AKT og ceramider signalering er ikke ansvarlig for synergistisk effekt observert i tykktarm kreft celler ved kombinasjon ChoKα hemmere og 5-FU.
Her har vi undersøkt videre mekanismen av synergisme av Chok inhibitorer og 5-FU for en bedre forståelse og forbedring av dens potensielle anvendelse i klinikken. TS-protein har en sentral rolle i biosyntesen av tymidylat, en vesentlig forløper for DNA-syntese [41]. Noen studier har vist at TS-protein nivåene er høyere i flere tumorer vev sammenlignet med deres normale motstykker [42]. Videre er høye TS nivåer assosiert med dårlig prognose i disse kreftformene [43] – [45].
