Abstract
Dagens begrensninger kjemoterapi inkluderer giftighet på friskt vev og multiresistens av ondartede celler. En rekke nyere anti-kreft strategier tar sikte på målretting mitokondrie apoptotiske maskiner å indusere tumor celledød. I denne studien har vi satt opp protokoller for å rense funksjonell mitokondrier fra ulike humane cellelinjer for å analysere effekten av peptidiske og xenobiotiske forbindelsene beskrevet til havn enten BCL-2-hemming egenskaper eller toksiske effekter knyttet til mitokondriene. Mitokondrie indre og ytre membran permeabilization ble systematisk undersøkt i kreftcelle mitokondriene
versus
ikke-kreft mitokondriene. Den avkortet (t) Bud protein, syntetiske BH3 peptider fra Bim og Bak, og lite molekyl ABT-737 fremkalt en tumor-spesifikke og OMP-begrenset mitochondrio-toksisitet, mens forbindelser som HA-14.1, YC-137, Chelerythrine, gossypol, TW-37 eller EM20-25 ikke. Vi fant ut at ABT-737 kan indusere Bax avhengige utgivelsen av apoptotiske proteiner (cytokrom c, Smac /Diablo og Omi /HtrA2 men ikke AIF) fra ulike, men ikke alle kreftcelle mitokondriene. Videre, ABT-737 tillegg til isolerte mitokondrier cancercelleinduserte oligomerisering av Bax og /eller Bak monomerer som allerede er satt inn i mitokondrie-membran. Endelig immunoprecipatations indikerte at ABT-737 induserer Bax, Bak og Bim desequestration fra BCL-2 og Bcl-xL men ikke fra Mcl-1L. Denne studien undersøker for første gang virkningsmekanismen av ABT-737 som monoterapi på isolerte kreftcelle mitokondriene. Derfor denne metoden basert på MOMP (mitokondrie ytre membran permeabilization) er en interessant screeningverktøy, skreddersydd for å identifisere BCL-2 antagonister med selektiv toksisitetsprofilen mot kreft celle mitokondriene, men blottet for toksisitet mot friske mitokondrier
Citation.: Buron N, Porceddu M, Brabant M, Desgué D, Racoeur C, Lass M, et al. (2010) Bruk av humane kreftcellelinjer Mitokondrier å utforske mekanismene for BH3 Peptider og ABT-737-Induced mitokondrielle membranen Permeabilization. PLoS ONE 5 (3): e9924. doi: 10,1371 /journal.pone.0009924
Redaktør: Syed A. Aziz, Health Canada, Canada
mottatt: 15 januar 2010; Godkjent: 01.03.2010; Publisert: 31 mars 2010
Copyright: © 2010 Buron et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Denne studien ble støttet av Agence Nationale pour la Valorisation de la Recherche (https://www.agence-nationale-recherche.fr) til Theraptosis SA (https://www.theraptosis.com), ved Theraptosis SA og Mitologics SAS (http: //www.mitologics.com). Den Agence Nationale pour la Valorisation de la Recherche hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:. Forfattere ABS, NB og MP erklærer konkurrerende økonomiske interesser på grunn av eierskapet i Mitologics SAS. Dette endrer ikke forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikk på deling av data og materialer.
Innledning
apoptose feilregulering har vist seg å underly flere sykdommer, inkludert kreft [1], [2 ]. Det er velkjent at forskjellige signaleringshendelser innenfor apoptose konvergerer på mitokondrier som gjennomgår ytre membran permeabilization (OMP) utløser frigjøring av oppløselige apoptogenic faktorer fra intermembrane plass slik som cytokrom c og en etterfølgende rekke av aktivering av et sett av proteolytiske enzymer, er caspaser ledende til apoptotisk demontering av cellestrukturen [3].
MOMP er under kontroll av medlemmer av Bcl-2-protein familien som inkluderer (1) anti-apoptotiske proteiner som Bcl-2, Bcl-xL, BCL-w, Mcl-1 og A1 /Bfl-en inneholder alle fire BCL-2 homologienheter domener (BH1-4), (2) pro-apoptotiske proteiner som Bax, Bak, Bok mangler BH4 domene og (3) produk- apoptotisk BH3-bare proteiner som Bud, Bim, Bad, BMF, Noxa og Puma [4] – [8]. I den direkte aktivering modellen blir induksjon av Bim eller bud som kreves for Bax eller Bak for å oligomerisere og danne porer i den ytre mitokondriemembranen (MOM) [9], [10]. Den anti-apoptotiske proteiner kan blokkere denne prosessen på MOM ved primært avsette Bax /Bak proteiner [11] – [13]. I den indirekte aktivering modell [14], [15], kan BH3-bare proteiner motvirke anti-apoptotisk effekt og frigjøre Bax /Bak proteiner. Det er fortsatt et spørsmål om debatt om Bax og Bak kan samhandle med proteiner som VDAC (spenning avhengig anion kanal) og /eller ANT (adenin nukleotid Translocator) for å regulere permeabilitet overgangen pore (PTP) [16]. På den mitokondrielle nivå, er cytokrom c fordelt i to adskilte bassenger: 15-20% i intermembrane plass og den større fraksjon (80%) i intracristae plass [17]. Derfor må BH3 mimetiske peptid matrise ombygging for å frigjøre den andre basseng av cytokrom c [18]. Andre apoptotiske faktorer som Omi /HtrA2 og Smac /DIABLO (caspase avhengige døds effektorer) eller apoptose-induserende faktor AIF og EndoG (caspase-uavhengig døds Effektor) blir løslatt etter MOMP.
mitokondriemembranen permeabilization ( MMP) prosessen er ofte endres i kreftceller muligens som et resultat av PTP komponent overekspresjon [19], oppregulering av anti-apoptotiske medlemmer av Bcl-2-familien og /eller nedregulering av Bax [20]. Disse underly en rekke anti-kreft-strategier som målretter komponentene av kjernen celledød maskineri for å fremme tumor celledød [21], [22]. Disse strategiene er basert på anvendelse av BH3-ligne peptider [14], [23], antisense [24] eller RNA-interferens [25] mot Bcl-2, og naturlige eller syntetiske små molekyler som binder seg spesifikt til BCL-2 familie proteiner . For eksempel screening fremgangsmåter ved bruk av kjernemagnetisk resonans, strukturbasert konstruksjon og combinatory kjemisk syntese, førte til identifisering av ABT-737, et lite molekyl inhibitor av anti-apoptotiske proteiner Bcl-2, Bcl-XL og Bcl-w men ikke Mcl-1 og A1 /Bfl1 [26]. ABT-737 er ansett for å være en dårlig lignende BH3 mimetisk fordi begge ABT-737 og Bad BH3 peptid binde samme undergruppe av BCL-2 pro-overlevelse proteiner [27] og indusere cytokrom c utgivelse i mitokondriene hentet fra «primet for døden «kreftceller [28]. Men den svake affinitet ABT-737 for de pro-overlevelse proteiner MCL-1 og A1 /Bfl1 [26] kan være en viktig faktor for tumorcelle motstand mot denne forbindelsen [29].
Vi har satt opp et multiparametric skjerm på renset mitokondrier for å identifisere forbindelser som induserer OMP av mitokondriene isolert fra cancercellelinjer, men ikke av mitokondriene isolert fra ikke-kreftceller. Blant ulike forbindelser (fra kjemiske, peptid eller protein-opprinnelse) beskrevet å målrette mitokondriene, har vi funnet at bare rekombinante t-bud, Bak BH3 og Bim BH3 peptider, og ABT-737 presentere en direkte tumorspesifikt mitochondrio-toksisitet og indusere relativt stor OMP grunn Bax og Bak oligomerisering. Ved videre undersøkelse av ABT-737-indusert OMP ved den cellefrie mitokondrie nivå, har vi funnet at (1) kreftcelle mitokondrier fra forskjellige kilder skilte seg i deres følsomhet til ABT-737 korrelerende med ulike mønstre av (ytre) membran-assosiert Bcl -2 familiemedlemmer og deres samspill, (2) ABT-737 induserer Bax, Bak, og Bim desequestration fra BCL-xL og BCL-2, men ikke fra BCL-w eller Mcl-en.
Resultater
Isolering og funksjonell karakterisering av sunne og kreft mitokondrier
mitokondrier fra både friskt vev (mus leveren) og human tumor (PC-3, prostata) cellelinje ble renset ved isopyknisk sentrifugering i tetthet graderinger av Percoll. De isolerte mitokondrier ble funnet høyt intakte som vist ved cytokrom c oksidase tilgjengelighetsanalyse og flowcytometri FSC /SSC analyse [30]. Ultra komparative studier av isolerte mitokondrier fra leveren eller PC-3-tumorcellelinje indikerer en relativt lik matrise /cristae organisasjon til tross for en liten forskjell i densitet mellom tumor (lav tetthet) og lever (høy tetthet) mitokondrier (Fig. 1A). Kalsium (50 uM) induserer en ytre membran omfattende forstyrrelser i både friske vev og tumorcellelinje mitochondria etterfulgt av en svelling som hemmes av cyklosporin A (CsA), som indikerer en intakt og funksjonelt permeabilitet overgang pore i begge mitokondrielle typer. Polarographic undersøkelser ble deretter utført på lever- og PC-3 mitokondrier (Fig. 1B). Succinate oksidasjon var i hovedsak avhengig av ADP tillegg og en luftveiskontroll indeks (RCI) for tre forbundet med succinate oksidasjon angitt funksjonell integritet mitokondriene, inkludert de isolert fra kreft dyrkede celler. Tilsvarende mitokondriene isolert fra HT-29, HCT-116 og Jurkat cancercellelinjer og HME-en ikke-kreft cellelinje presentert høy grad av integritet og funksjonalitet (ikke vist).
A. Ultrastructural analyse av isolerte mitokondrier og deres evne til å svelle. Elektronmikroskopibilder ble oppnådd etter inkubering av mitokondriene isolert fra friske mus leveren, eller PC-3 tumorcellelinjer ubehandlede (NT) eller behandlet med Ca
2+ (50 uM) eller med en 5 min-preinkubering med cyklosporin A (CsA ; 10 mm) eller ruthenium rød (RR, en mikrometer) før kalsium tillegg. Prosentandelen av svellet mitokondrier var mindre enn 10% i kontrollgruppen og 80% 30 minutter etter Ca
2+ tilsetning (n = 3). Skala barer 1 mikrometer. B. hindre oksidasjon egenskapene isolert lever og PC-tre mitokondrier. Trasene representerer oksygenforbruk isolerte mitokondrier (100 ug) etter tilsetning av de angitte reagenser. Tall langs sporet er nmol O
2 konsumert per minutt per milligram protein. Åndedrettskontroll indeks (RCI) beregnes for hver type mitokondrier som indikert i materialer og metoder. C. For å evaluere mitokondrie svelling og ΔΨ
m tap, mitokondriene isolert fra friske mus leveren eller PC-3-cellelinjen ble fordelt i 96-brønners mikrotiterplater og inkubert i 30 minutter enten med Ca
2+ (100 pM) i nærvær (gul) eller fravær (rosa) av CsA (10 mm), med
m
ClCCP (turkis, 50 mm) eller med t-Bud (lilla, 1 nM). For kvantifisering av cytokrom c frigivelse, ble isolerte mitokondrier behandlet med økende konsentrasjoner av t-Bud rekombinante protein og mitokondrielle supernatant ble underkastet ELISA-analyser, er gitt i prosent av frigivelse sammenlignet med 20 ug /ml alamethicin (Ala; 100% av cytokrom c release) (n = 3 uavhengige eksperimenter).
Multiparametric screening metoden på isolerte sunne og kreft mitokondrier
isolerte mitokondrier ble analysert på en screening plattform som tillot kvantifisering av mitokondriemembranen permeabilization (hevelse, fig. 1C, venstre panel) pluss mitokondrie transmembrane potensial (ΔΨm fig. 1C, midtre panelet) ved hjelp av sanntids spektrofluorimetri og cytokrom c utgivelsen av ELISA som en indeks for MOMP (fig 1C;. panelet til høyre). Sanntids ΔΨm deteksjon reflektert indre slimhinner og luftkjede endringer, men ikke tillatelse til å observere forsinket ΔΨm svar på pro-apoptotiske forbindelser. Når inkubert i hypotone buffere, både normale og tumorcelle mitokondrier fikk svelle (tap av O.D. ved 550 nm) i nærvær av kalsium i en CsA-avhengig måte. Imidlertid hevelse amplitude er redusert i tilfelle av tumor mitokondriene i overensstemmelse med det laveste tetthet sammenlignet med lever mitokondriene. Kalsium og
m
ClCCP induserte en rask ΔΨm tap preget av en økt fluorescens tilsvarer Rhodamine-123 dequenching grunn av en reduksjon av fargestoff konsentrasjon i depolariserte mitokondriene. Vi har således observert at det rekombinante protein t-Bud hadde ingen effekt på svelling og ΔΨm men induserte cytokrom c frigivelse spesielt i PC-3 (fig. 1C), HT-29, HCT-116 og Jurkat (ikke vist) celle mitokondrier i en konsentrasjonsavhengig måte som indikert ved ELISA analyse av supernatantene.
Screening av mulige Bcl-2 familien hemmere
Vi har evaluert ved effekten av BCL-2-hemmere på mitokondriene isolert fra mus lever, human ikke-kreft (HME-1) og kreft (PC-3) celler ved hjelp av 3 parametre: hevelse, ΔΨm og cytokrom
c
meldingen (fig 2a.). Det rekombinante t-Bud protein indusert cytokrom c frigivelse (uten svelling og ΔΨm tap) fra PC-3 mitokondrier, men hadde ingen virkning på leveren og HME-1 mitokondrier ved 100 nM. Noen BH3 peptider (avledet fra Bak, Bim, Bax, Bad, Bud, Noxa og Puma) fra menneske eller mus kilder ble også testet. Blant disse, bare menneskelig Bak BH3 og Bim BH3 (Fig. 2A) indusert mitochondrio-toksisitet til tumorceller (PC-3) mitokondrier, mens den er inaktiv på 100 um på leveren og HME-1 mitokondriene. Bemerkelsesverdig, selv den tilsvarende muse BH3 sekvenser er inaktive på muselever mitokondriene, med unntak av en feiltolkning på grunn av arter spesifisitet (ikke vist). I motsetning til de andre små-molekyl-inhibitorer undersøkt i denne studie, vist bare ABT-737 tumor mitokondriene spesifisitet som induserer cytokrom c-frigjøring fra PC-3 mitokondrier, men ikke fra leveren og HME-1 mitokondriene. Cytokrom c frigjøring fra PC-3 mitokondrier ble behandlet med t-Bud og ABT-737 oppstått uten noen svelling (fig. 2A og elektronisk mikroskopi, som ikke er vist) eller ΔΨm tap (fig. 2A) i løpet av en 45 min-behandling, noe som indikerer at disse forholdene oppstår en bestemt OMP. Vi deretter utvidet studiet av ABT-737 effekter til mitokondriene isolert fra HCT-116, HT-29 og Jurkat cancercellelinjer (Fig. 2B) og observerte forskjellig følsomhet til ABT-737. Faktisk, HT-29 mitokondrier var mye mindre følsomme for ABT-737 enn PC-3, HCT-116 og Jurkat, disse tre laters presentere et tilsvarende nivå av følsomhet til ABT-737. Disse data antydet at ABT-737 induserer cytokrom c utgivelse fra ulike, men ikke alle mitochondria isolert fra kreftceller.
A. Mitokondrier ble isolert fra muselever, humane ikke-kreft (HME-1) og kreft (PC-3) celler ble behandlet med økende konsentrasjoner av t-Bud, Bak BH3, HA-14,1, YC-137, Chelerythrine, Gossypol, TW- 37, EM20-25 og ABT-737 før evaluering av mitokondrie hevelse og ΔΨ
m tap. Alternativt ble mitokondriell supernatant underkastet ELISA-analyser for kvantifisering av cytokrom c frigivelse. Effektiv konsentrasjon som induserer 50% av den maksimale effekt (EF
50) er gitt for hevelse (100% av virkningen med 50 uM Ca
2+), ΔΨ
m tap (100% av virkningen med 50 pM
m
ClCCP) og cytokrom c frigjøring (100% av effekten med 20 mikrogram /ml alamethicin) (n = 3 uavhengige eksperimenter). B. Mitokondrier isolert fra muselever eller HME-1, PC-3, HCT-116, HT-29 og Jurkat-cellelinjer ble inkubert i 45 minutter ved 30 ° C med økende konsentrasjoner av ABT-737 og supernatantene ble utsatt for cytokrom c immunoblot (NT: ubehandlet, Ala: alamethicin 20 ug /ml).
ABT-737-indusert MOMP i kreftcellen mitokondriene er forbundet med Bak og /eller Bak oligomerisering
Vi deretter undersøkt om ABT-737-indusert OMP var selektiv i cytokrom c eller kanskje tillate utgivelsen av andre apoptogenic mitokondrielle faktorer (fig. 3). Isolert muselever, PC-3 og Jurkat mitokondrier ble behandlet med Bak BH3, ABT-737 eller t-Bud og supernatantene utsatt for immunoblotting. Smac /DIABLO (23 kDa) og Omi /HtrA2 (37 kDa) ble frigjort fra PC-3 og Jurkat mitokondrier, mens AIF (56 kDa) var ikke (fig. 3), noe som tyder på at disse forbindelsene induserte en mitokondrier ombygging ikke tilstrekkelig for AIF utgivelse. Vi neste brukte isolerte mitokondrier fra Bax og /eller Bak knock-out HCT-116 cellelinjer, hvor fravær av Bax og /eller Bak ble undersøkt ved immunblot (Fig. 4A). Vi fant ut at ABT-737 indusert cytokrom c frigjøring fra Bax +/- og Bak – /- mitokondrier, men ikke fra Bax – /- eller Bax /Bak dobbel knock-out mitokondrier (fig 4B.). Denne informasjonen påpekt den kritiske rollen Bax i virkningsmekanismen til ABT-737. Videre ble t-Bud og ABT-737-indusert MOMP styres av et overskudd av Bcl-xL (fig. 4C), eller Bcl-2 (ikke vist) rekombinante proteiner, støtter hypotesen om en formasjon av en spesiell kanal ved den ytre membranen [31]
Isolert mitokondrier fra muselever, PC-3 og Jurkat-celler var ubehandlet (NT) eller inkubert enten med alamethicin (Ala; 20 ug /ml, positiv kontroll)., Bak BH3 peptid (10 mm), ABT-737 (1 mm) eller rekombinant t-Bud (1 nM) i 45 min. Mitokondrie supernatanter ble utsatt for immundeteksjon av cytokrom c, Smac /DIABLO, Omi /Htra2 og AIF (Western blot er representative for 3 uavhengige eksperimenter). Merk at cytokrom c (15 kDa), Smac /DIABLO (23 kDa), og Omi /Htra2 (37 kDa), men ikke AIF (56 kDa) er løslatt fra kreft celle mitokondriene.
A. Totalt celleekstrakter fra HCT-116 Bax +/-, Bax – /- Bak – /- og Bax /Bak – /- (DKO) cellelinjer ble utsatt for Bax og Bak immunoblot å kontrollere sin Bax og Bak innhold. B. Mitokondrier isolert fra HCT-116 +/- Bax, Bax – /-, Bak – /- og Bax /Bak – /- (DKO) cellelinjer ble inkubert med økende konsentrasjoner av ABT-737 og supernatanten ble underkastet immunblot påvisning av cytokrom c (NT: ubehandlet, Ala: alamethicin 20 ug /ml). C. Cytokrom c frigivelse indusert av t-Bud og ABT-737 blir inhibert av et overskudd av rekombinant Bcl-xL. PC-3 mitokondrier ble inkubert med ABT-737 (1 uM) eller t-Bud (1 nM) i 45 minutter etter en 5 min-forbehandling med rekombinant Bcl-xL (100 til 400 nm), og supernatanten ble underkastet anti- cytokrom c immunoblot (NT: ubehandlet, Ala: alamethicin 20 ug /ml). Merk at BCL-xL sterkt reduserer både t-Bud og ABT-737-indusert cytokrom c frigjøring (n = 2 uavhengige eksperimenter).
Etter å ha funnet ut at Bax forble bundet til mitokondrie OM selv etter en vaskes med en alkalisk homogeniseringsbuffer (pH 11,6) (ikke vist), noe som tyder på en innsetting av Bax inn i membranen [32], vi videre ønsket å undersøke om ABT-737 kan indusere oligomerisering av Bax og Bak bassenger som allerede er knyttet til tumorcelle mitokondriene . I likhet med t-Bud og Bim eller Bak BH3 peptider, ABT-737, indusert Bax og /eller Bak oligomerisering i PC-3 og Jurkat mitokondrier, som objectived ved hjelp av kryssbindingsmiddel 1,6-bismaleimidohexane (BMH, Fig. 5 ). Mutert [L78A; D83A] Bak BH3 peptid var ineffektivt å indusere cytokrom c release og Bax /Bak oligomeriseringsprosessen da lagt til PC-3 mitokondriene (Fig. 5A). I PC-3 mitokondrier som inneholder både Bax og Bak, en svak Bak oligomeriseringsprosessen skjedde med BH3 peptider eller ABT-737 som tyder på en stor rolle for Bax i utløser kanaler formasjon i denne cellelinjen (figur 5A;. Mellompaneler). Vi neste brukes (±) -1- (3,6-dibromocarbazol-9-yl) -3-piperazin-1-yl-propan-2-ol identifiseres ved BOMBRUN og medarbeidere [33] som et Bax kanalblokker ( BCB) i stand til å inhibere t-Bud-indusert cytokrom c meldingen [33], [34] (fig. 5A). Forbehandling av kreftcelle mitokondrier med dette BCB forhindret cytokrom c utgivelsen utløst av Bak BH3, Bim BH3, t-bud eller ABT-737 behandling (Fig. 5A). I tillegg fant vi at BCB forhindret Bax /Bak oligomerisering i respons til behandlinger med ABT-737, samt t-Bud og Bak eller Bim BH3 peptider (Fig. 5A og 5B).
Mitokondrier isolert fra PC-3 (A) og Jurkat (B) cellelinjer ble inkubert med eller uten BCB, en Bax Channel Blocker (2 uM (±) -1- (3,6-dibromocarbazol-9-yl) -3-piperazin- 1-yl-propan-2-ol) før behandling med en mikrometer Bim BH3, 10 mm Bak BH3, 10 mikrometer mutert Bak BH3, 1 nM t-bud eller indikerte konsentrasjoner av ABT-737. Supernatanter ble analysert for cytokrom c frigivelse (nedre paneler; NT: ubehandlet, Ala: alamethicin 20 ug /ml) og mitokondrielle pellets ble behandlet med den irreversible tverrbinder BMH (1 mM). Førti mikrogram protein fra hver reaksjon ble kjørt på SDS-PAGE og immunoblottet med anti-Bax (A) eller anti-Bak (A, B) antistoffer. Bax /Bak oligomeriseringsprosessen følger ABT-737-indusert cytokrom c utgivelse som hemmes av BCB.
Til sammen disse dataene antydet at ABT-737 utløste utgivelsen av apoptogenic proteiner fra kreft celle mitokondrier ved dannelsen av multimæriske Bax /Bak kanaler som vises av korrelasjon mellom Bax og Bak oligomerisering og cytokrom c frigjøring (fig. 5).
ABT-737-indusert MOMP i kreftcellen mitokondriene er assosiert med bestemte komplekse forstyrrelser, avhengig av mitokondrie typen
Som ble observert forskjeller i følsomhet mellom flere mitokondrie-typer som brukes i denne studien analyserte vi pro- og anti-apoptotiske Bcl-2 familiemedlemmer knyttet til mitokondrie membraner (fig. 6). Blant de anti-apoptotiske proteiner, BCL-2 var bare til stede i PC-3, Jurkat og HCT-116 mitokondrier, mens BCL-w, Bcl-xL og A1 ble påvist i alle mitokondrie typer (Fig. 6A). Interessant, Bcl-xL var kvantitativt mer viktig i kreftcelle mitokondrier enn i sin sunne motstykke. Anti-apoptotiske Mcl-1L var til stede i store mengder i PC-3 og Jurkat mitokondrier og i mindre mengde i HT-29 mitokondriene. Når det gjelder de pro-apoptotiske proteiner, mens Bak var til stede i alle mitokondrielle typer, Bax var til stede i PC-3, HT-29, HCT-116 og HME-1-mitochondria, men ikke i Jurkat og lever mitokondrier. Blant de BH3-bare aktivatorer, ble Bim funnet i kreftcellen mitokondriene, men ikke i de fra HME-1 og leveren (fig. 6B), mens Bid ikke kan påvises i noen av disse mitokondrielle typer (ikke vist). Blant de eneste BH3 sensibilisatorer, ble Bad detekteres ved PC-3, HT-29 og Jurkat mitokondrielle membraner (fig. 6B), mens Puma, Noxa, hrk, Bik, Bok og BMF ikke var (ikke vist). BCL-2, BCL-XL og BH3 bare allergifremkallende (ex BIM) kan godt være sentrale aktører, selv om det er vanskelig fra slike proteomikk analyse for å forklare forskjeller i følsomhet for ABT-737. Faktisk er det bemerkelsesverdig at HME-1 mitokondriene har verken Bim, eller BCL-2 og bare lavt nivå av BCL-XL, som kan skille dem fra sensitive kreft celle mitokondriene.
Totalt celleekstrakter (TE) og mitokondrielle ekstraktene (M) fra PC-3, HT-29, Jurkat og HCT-116 kreftcellelinjer eller fra friske HME-1-cellelinjen og muselever ble analysert ved hjelp av Western blot for påvisning av anti-apoptotiske (A) Bcl-2- , BCL-XL, Bcl-W, Mcl-1L og A1 proteiner og den pro-apoptotiske (B) Bak, Bax, Bim, Bad og MCL-1S proteiner.
Som ABT-737 er konstituert av komplekse avbrudd mellom pro- og anti-apoptotiske proteiner, vi neste undersøkt noen komplekse forstyrrelser av co-immunoprecipitation i PC-3, HT-29 og Jurkat mitokondrier behandlet med ABT-737 (fig. 7). Uansett cellelinjen vi har oppdaget lignende bindinger: BCL-XL til Bax og Bak, BCL-2 til Bax og svakt til Bak, Mcl-en bare Bak (Fig 7.) Og BCL-w for å Bax (ikke vist). Vi observerte at ABT-737-indusert cytokrom c utgivelsen er korrelert med Bax, Bak (Fig. 7) og Bim (ikke vist) frigjøring fra BCL-XL og BCL-2. Imidlertid, ABT-737 hadde ingen virkning på Bak og Bim deponering av Mcl-1 (fig. 7), eller Bax beslaglegging av Bcl-w (ikke vist), er disse kompleksene som er igjen etter behandlingen. Disse resultatene antydet at Bax, Bak og Bim frigjøring fra BCL-2 og Bcl-xL svar på ABT-737 var ansvarlig for kanaler dannelse og cytokrom c utgivelse i PC-3 (Fig. 8) og Jurkat mitokondrier. I kontrast, HT-29 mitokondriene inneholder mindre Bim og blir fratatt BCL-2 ble mindre følsom for ABT-737 behandling, tyder på en stor rolle for BCL-2 og Bim i ABT-737 følsomhet.
Mitokondrier isolert fra PC-3 (A), HT-29 (B) og Jurkat (C) celler ble ubehandlet (NT) eller behandlet med t-Bud (Bid, 2 nM) og ABT-737 (ABT, 1 uM) før å bli immunoutfelt av antistoffer rettet mot Bcl-2, Bcl-xL og Mcl-1 anti-apoptotiske proteiner. Mitokondrie samlede ekstrakter (TE, positiv kontroll av immunoblot; 25 ug) ble anvendt som kontroll, mens en mitokondriell lysat ble underkastet immunoutfelling prosess uten antistoff (C; negative kontroll av immunpresipitering). Dermed ble utført Western blot analyse for å fastslå bindinger mellom anti-apoptotiske proteiner og pro-apoptotiske Bax og Bak proteiner (representative vestlige blotter av 3 uavhengige eksperimenter).
A. Bax, Bak og Bim er sequestred av BCL-2, Bcl-xL og Mcl-en på ytre mitokondrie membran. B. Som svar på ABT-737, er Bax, Bak og Bim proteiner frigjort fra BCL-2 og Bcl-xL men ikke fra Mcl-1L. Dermed Bim kan direkte forbedre Bax og Bak oligomeriseringsprosessen utløser MOMP dannelse (C) og frigjøring av pro-apoptotiske proteiner som cytokrom c i cytosol.
Diskusjoner
I denne studien, vi brukte høykvalitets kontrollerte isolerte mitokondrier å sammenligne effekten av antatte BCL-2-hemmere og prøver å utforske virkningsmekanismen av ABT-737. Vi brukte fem forskjellige parametere for å evaluere deres integritet og functionnality: cytokrom c oksidase tilgang til eksogen cytokrom c (ikke vist), respiratoriske kontrollverdier, kapasitet for matrise hevelse, transmembran mulige verdier, og frigjøring av apoptogenic faktorer som cytokrom c (OMP) (Fig . 1). Sammenligning av forbindelser-effekt på hver mitokondrie typen krever tilsvarende høye nivåer av renhet og intactness av mitokondrielle preparater uansett hvilke kilder (dyrkede celler eller sunt vev). Dette ble løst ved storskala cellekulturer og rensing av mitokondria ved differensialsentrifugeringer pluss Percoll tetthetsgradient. Ved hjelp av denne metoden, både isolerte mus leveren og kreft celle mitokondrier stede tilsvarende kvalitet og respons på kalsium (Fig. 1).
Overraskende nok de fleste forbindelser identifisert som BCL-2-hemmere ble funnet å handle på sunn mitokondrier minst på en integritet parameter. For eksempel, observerte vi at HA-14,1, Chelerythrine, Gossypol og EM20-25 indusert MMP i muselever mitokondriene, mens andre Bcl-2-familie inhibitorer ble funnet å være inaktive (YC-137 og TW-37). Appart fra t-Bud, Bak BH3, Bim BH3 som er fra protein opprinnelse, bare ABT-737 demonstrerte selektive tumor mitochondrio målretting indikert av OMP og frigjøring av pro-apoptotiske faktorer (fig. 2). Tidligere observasjoner har vist at ABT-737 kan indusere OMP enten når mitokondrier stammer fra celler «primet» med dødssignaler (for eksempel i IL-3-belastede lymfocytter [28], eller i TNF-pulset HeLa-celler [35]), eller når isolerte mitokondrier er co-behandlet med BH3 peptid (for eksempel med Noxa BH3 på MEF mitokondriene [13]). For første gang, demonstrerte vi at ABT-737 i seg selv kan indusere OMP på mitokondriene isolert fra ikke-primede tumorcellelinjer. Når det gjelder t-Bud, vår isolerte lever og HME-1 sunne mitokondrier var ikke følsom for rekombinant protein t-bud. Denne mangel på virkning på lever mitokondriene kan forklares ved den høye renhet og stabilitet av de mitokondrielle preparater. Bcl-2-familieproteiner detektert på både normale og kreftceller mitokondrier (fig. 6) minne til stede etter alkaliske vaskinger (ikke vist) som indikerer at de ikke er forbundet ved elektrostatisk vekselvirkning med den mitokondrielle membraner og ikke kommer fra rest cytosol eller endoplasmatiske retikulum .
Det rekombinante t-Bud protein, Bak BH3, Bim BH3 og ABT-737 utløst en utgivelse av apoptogenic proteiner fra PC-3 og Jurkat mitokondrier ved dannelsen av kanaler som er store nok til å frigjøre proteiner som Omi /HtrA2 (37 kDa) (fig. 3). OMP vises uavhengig av PTP, siden det ikke inhiberes ved hjelp av kjente PTP-hemmere som ADP, cyklosporin A og bongkrekic syre (ikke vist). Fraværet av mitokondrie membran endringer (ingen hevelse og ΔΨm tap) (Fig. 2A) og utslipp av de minste apoptotiske faktorene er under behandling (Fig. 3) antydet at ABT-737 indusert dannelse av en bestemt kanal og ikke en mitokondriemembran brudd, på samme måte som Bax [53-86] BH3 peptid i Polster
et al.
[36]. Følgelig har diskriminerende utgivelsen av apoptogenic faktorer allerede blitt vist i isolerte HeLa mitokondriene behandlet med t-Bud [37]. Dette funnet er kompatibelt med den tidligere beskrivelse av en apoptosome avhengig løkke der nedstrøms caspases må være aktivert for å utløse mitokondrie frigjøring av AIF og EndoG, sekundært til utgivelsen av cytokrom c, Omi /HtrA2 og Smac /DIABLO [37]. I cellulær modell, ble ΔΨm tap og cytokrom c frigivelse samtidig detekteres i respons til ABT-737 [38], [39] i motsetning til hva som ble observert med våre betingelser i cellefritt system. Vår screening metoden ser ut til å være en sanntid prosess som tillater påvisning av direkte og tidlige effekter av forbindelser på mitokondriene, uten forstyrrelser forårsaket av cytosolic rommet.
Vi har også vist at (1) HCT-116 Bak- /-, men ikke Bax – /-, mitokondrier er følsomme for ABT-737, (2) ABT-737-indusert cytokrom c frigivelse på PC-3 mitokondriene er styrt av et overskudd av Bcl-xL (figur (figur 4A.). 4C) og (3) hemming av Bax og Bak oligomerisering av BCB er tilstrekkelig til å blokkere cytokrom c frigivelse (fig. 5A og B). Disse funnene tyder på at likevekt mellom pro-apoptotiske og anti-apoptotiske medlemmer av BCL-2 familien spiller en viktig rolle i ABT-737 virkningsmekanisme.
Vi har dermed vist at Bax og Bak oligomerisering på PC-3 mitokondriemembranen er indusert av Bak og Bim BH3 peptider, t-Bud eller ABT-737 behandling (fig. 5A), Bax og Bak begge er innført som en monomer form i ubehandlet normal (HME-1) og tumoral (PC -3) celle mitokondrier. Imidlertid har tallrike studier blitt utført som viser Bax oligomerisering og etterfølgende innsetting av membranen ved anvendelse av rekombinante Bax og isolerte mitokondrier eller liposomer [40] – [42]. Disse studiene har ført til motsatte konklusjoner om den kinetiske av Bax porene aktivering. Imidlertid, mer nylig, har det vist seg at oligomerisering av Bax skjer på den mitokondrielle nivå i stedet for i cytosol [43] – [45]. Således, ved hjelp av c-myc null-celler, Annis og medarbeidere viste at Bax-indusert mitokondrielle permeabiliseringen resultater fra oligomerisering av transmembran-monomerer i stedet for innsetting som på forhånd dannede oligomerer [43].
Noen av Bcl-2-familieproteiner, slik som BH3 eneste aktivator Bim eller anti-apoptotiske proteiner BCL-2 og Mcl-1L er spesielt til stede på kreft celle mitokondriene. I motsetning til tidligere observasjoner [28], [29], [46], Mcl-1L ekspresjon i mitokondriene var ikke tilstrekkelig i våre hender for å hindre MOMP-dannelse i respons til ABT-737. For eksempel, PC-3 og Jurkat mitokondrier er følsomme overfor lave konsentrasjoner av ABT-737 til tross for en høy Mcl-1L innhold (fig 2 og 6), mens HT-29 mitokondrier med lavt nivå av Mcl-1L er forholdsvis motstandsdyktig mot ABT- 737. Vi viser her at på molekylært nivå, gjør at ABT-737 pro-apoptotiske proteiner Bcl-2 og Bcl-xL men verken Mcl-1L eller BCL-w for å frigjøre Bax, Bak og Bim (figur 7 og 8).
