Abstract
De fleste kreftceller uttrykker høye nivåer av telomerase og sprer ubestemt tid. I tillegg til sin funksjon telomere vedlikehold, har telomerase også en pro-overlevelsesfunksjonen som resulterer i en økt motstand mot DNA-skade og redusert apoptose-induksjon. Imidlertid, de molekylære mekanismene for denne beskyttende funksjonen forblir unnvikende, og det er uvisst om det er koblet til telomere vedlikehold eller er snarere en ikke-telomeric funksjon av telomerase protein, TERT. Det ble vist nylig at proteinet subenhet av telomerase kan shuttle fra kjernen til mitokondriene ved oksidativt stress der det beskytter mitokondriefunksjon og reduserer intracellulær oksidativt stress. Her viser vi at endogene telomerase (TERT-protein) transporterer fra kjernen inn i mitokondriene ved oksidativt stress i kreftceller og analysert kjernefysiske eksklusjons mønstre av endogene telomerase etter behandling med hydrogenperoksyd i forskjellige cellelinjer. Cellepopulasjoner ekskludert TERT fra kjernen på oksidativt stress i et heterogent måte. Vi fant en signifikant korrelasjon mellom kjernefysiske lokalisering av telomerase og høy DNA-skader, mens celler som utelukket telomerase fra kjernen viste ingen eller svært lav DNA-skader. Vi modellert atom og mitokondrielle telomerase ved hjelp av organspesifikke vektorer lokalisering og bekreftet at mitokondrie lokalisering av telomerase beskytter kjernen fra påførte DNA-skade og apoptose, mens, i motsetning, nukleær lokalisering av telomerase korrelert med høyere mengder av DNA-skade og apoptose. Det er kjent at atom DNA-skade kan forårsakes av mitochondrially genererte reaktive oksygenarter (ROS). Vi viser her at mitokondrie lokalisering av telomerase spesifikt forhindrer atom DNA-skade ved å redusere nivåene av mitokondrie ROS. Vi foreslår at denne nedgangen av oksidativt stress kan være en mulig årsak til høyt stress motstand av kreftceller og kan være spesielt viktig for kreftstamceller
Citation. Singhapol C, Pal D, Czapiewski R, Porika M, Nelson G, Saretzki GC (2013) Mitokondrie Telomerase Beskytter kreftceller fra å Nuclear DNA Damage og apoptose. PLoS ONE 8 (1): e52989. doi: 10,1371 /journal.pone.0052989
Redaktør: Janine Santos, medisinske og odontologiske av New Jersey, USA
mottatt: 14. august 2012; Godkjent: 27 november 2012; Publisert: 09.01.2013
Copyright: © 2013 Singhapol et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Chatchawan Singhapol ble finansiert av et stipend fra thailandske regjeringen. Glyn Nelson ble støttet av BBSRC tilskuddet nr. BB /C008200 /1 (CISBAN). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser. Gabriele Saretzki er en PLoS ONE redaktør og redaksjonelle styremedlem. Dette endrer ikke forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikk på deling av data og materialer.
Innledning
Telomerase er et enzym best kjent for sin rolle i telomere vedlikehold. Celler med lav eller ingen telomerase uttrykk miste telomere gjentar under celledeling, til slutt resulterer i mobilnettet senescence. De fleste kreftceller, kjønnsceller og embryonale stamceller uttrykker høye nivåer av telomerase, og dermed bidra til pluripotency og udødelighet. For å opprettholde telomerer enzymet må dens katalytiske subenhet (TERT), så vel som RNA-komponent (TERC eller TR) som inneholder templat for syntese telomere.
I de senere år har imidlertid bevis akkumulert på at telomerase , og spesielt dens katalytiske subenhet TERT, er involvert i en rekke ikke-telomere-relaterte funksjoner, slik som regulering av genekspresjon, vekstfaktorer og celle proliferasjon [1] – [6]. I tillegg har forskjellige grupper vist at tert skyttel fra kjernen og translocates til mitokondrier på eksogen spenning [7] – [12]. Vi og andre har vist en beskyttende rolle av telomerase i mitokondriene [10] – [12], mens manglende evne av telomerase skyt fører til cellulært stress, forhindrer immortalisering og øker følsomheten mot genotoksiske stress, slik som vist nylig av Santos «gruppe [13] – [ ,,,0],15].
De fleste kreftceller uttrykker høye nivåer av telomerase, en viktig forutsetning for ubestemt spredning og udødelighet. I tillegg bidrar telomerase til tumorgenese via ikke-telomere avhengige mekanismer som ikke er godt forstått enda [16].
Telomerase er således blitt foreslått å være en viktig anti-kreft målet, med de første kliniske forsøk i telomerase inhibitor imetelstat med hell i gang [17], [18]. Telomerase er regulert på flere nivåer og subcellulær lokalisering er en av dem. Kreft celle overlevelse etter terapeutiske behandlinger kan være heterogene med noen celler reagerer på behandlingen, mens andre ser ut til å være motstandsdyktig, bidrar til svulst celle overlevelse. En bedre innsikt i de biologiske konsekvensene av ulike subcellulære lokaliseringer av TERT kan føre til utvikling av mer effektive anti-kreft behandlinger.
Her er vi preget utelukkelse av telomerase fra kjernen på stresset søknad og fant en heterogen stresset respons i kreftcellepopulasjoner. Viktigere var det en slående korrelasjon mellom telomerase /TERT holdt tilbake inne i kjernen og høy DNA-skade. I kontrast, celler som ekskluderte telomerase raskt fra kjernen akkumulerte ingen eller meget lave mengder av DNA-skade. Ved å modellere de ulike subcellulære lokaliseringer av telomerase bruker organelle målrettede «shooter» vektorer vi viser her at mitokondrie telomerase hindrer atom DNA skader samt induksjon av apoptose etter behandling med H
2o
2 og bestråling. Vi foreslår at redusert produksjon av mitokondrie reaktive oksygenforbindelser (ROS) kan være den underliggende mekanisme for å forklare hvordan mitokondrie TERT hindrer atom DNA-skader.
Dermed utelukkelse av telomerase fra kjernen etter stress, slik som anti-kreft terapeutisk behandling kan være en beskyttende mekanisme som reduserer atom DNA-skade og apoptose ved å redusere oksidativt stress i mitokondriene. Dette kan bidra til økt motstand av disse kreftcellene mot ulike kreftbehandlinger.
Diskusjon
subcellulære skyt av TERT protein fra kjernen til mitokondriene Resultater og hadde blitt vist tidligere i ulike celletyper , inkludert kreft celler [7], [10] – [12]. Vi har bekreftet denne skyt av endogene telomerase etter H
2o
2 behandling i HeLa og MCF7-celler (Fig. 1A) fra kjernen til mitokondriene og kvantifisert utelukkelse sammenlignet med MRC-5 /hTERT-celler (tabell 1). For å evaluere Den pendlende kinetikken av TERT i mer detalj analyserte vi 3 cellelinjer, blant annet 2-cancercellelinjer, så vel som hTERT over-uttrykker MRC-5 fibroblaster, og fulgte dem over 5 dager.
eksempel gjengitt 3D volum projeksjoner av dekonvolveres confocal bilder fra HeLa og MCF7 celler ubehandlet (kontroll, venstre panel) eller behandlet med 400 mikrometer H
2o 2 til 3 timer (høyre panel)
. Grønn representerer mitotracker grønn fluorescens, rød anti-TERT immuno-fluorescens og blå kjerne-DNA (DAPI). Merket colocalization mellom mitotracker grønn og TERT vises ved rød-grønne blanding vises som gult. B-D: tert lokaliseringskinetikk i 3 cellelinje populasjoner etter behandling med 400 mikrometer H
2o
2 over 5 dager. B: HeLa C: MCF7- D: MRC-5 /hTERT. Svarte striper: atom TERT, røde søyler: cytoplasma TERT. Barer er midler ± SE fra minst 30 celler per tidspunkt og cellelinje fra 3 uavhengige eksperimenter.
I alle tre cellelinjene atom TERT utelukkelse startet rundt 45 minutter etter utbruddet av H
2o
2 behandling. I hTERT over-uttrykker fibroblaster utelukkelse nådd sitt høyeste på 60% etter 3 timer mens det tok begge kreftcellelinjer opp til en dag å nå en utelukkelse nivå på 50-60% (Fig. 1B-D). Dette samsvarer godt med den mitokondrielle TERT ko-lokalisering av data fra våre konfokale bilder av de tre cellelinjer (tabell 1). Forbløffende nok atom utelukkelse nivå på 50-60% faste i alle tre cellelinjene opp til 5 dager, de lengste tidspunkter vi analysert (Fig. 1B-D og S1). Dermed er atom TERT utelukkelse en heller vedvarende prosess som kan vare opp til flere dager etter en bolusdose på 400 mikrometer H
2o
2. Så vidt vi vet er dette første gang at tert eksklusjonskinetikk er blitt undersøkt i detalj og sammenlignet i tre forskjellige cellelinjer enn en 5 dagers tidsramme. Den lange utholdenhet av TERT protein utenfor kjernen i kreftcellelinjer kan være en viktig bidragsyter til økt motstand og redusert apoptose i kreftceller etter behandling eller bestråling sammenlignet med ikke-kreftceller som i de fleste tilfeller uttrykker ingen eller snarere lave nivåer av telomerase. Vi har tidligere vist at telomerase negative fibroblaster er mye mer mottagelige for apoptose etter behandling med H
2o
2 og etoposid enn deres telomerase overuttrykkende motstykker [10]. Vi hadde også vist tidligere [10] som TERT utelukkelse fra kjernen er reversibel over en tidsramme på rundt 10 dager. Men vi vet ikke om den vedvarende TERT proteinet i mitokondriene kommer alltid fra kjernen eller om nylig syntetisert TERT protein er direkte importert til mitokondriene. Dette spørsmålet krever ytterligere etterforskning.
Neste vi korrelert telomerase utelukkelse for hver enkelt celle med sin DNA-skader nivå på 3 timer etter at H
2o
2 behandling. Vi kvantifisert TERT utelukkelse nivået for hver enkelt celle som enten atom, hvis mer enn 75% av den totale TERT var i kjernen, eller cytoplasmiske /mitokondriell hvis mer enn 75% av TERT var utenfor kjernen med de gjenværende cellene ble klassifisert som en middels fenotype.
Vi fant en klar heterogenitet for atom TERT utelukkelse mellom celler i en populasjon (fig. 2A og S2A). Forbløffende nok har vi funnet at celler som hadde utelukket telomerase 3 timer etter behandling viste ingen eller svært lav DNA-skader, mens de med kjernefysisk telomerase hadde et betydelig høyere beløp av atom DNA-skader i alle 3 cellelinjer (Fig. 2). Også celler med en mellomliggende utelukkelse mønster viste et mellomliggende nivå skade, fremdeles vesentlig høyere enn celler med helt utelukket telomerase men ikke vesentlig forskjellig fra de med overveiende atom telomerase. Disse data antyder at en høy grad av kjerne utelukkelse (mer enn 75%) og mitokondrielle lokalisering av TERT er nødvendig for å utøve sin beskyttende funksjon [10] – [15]. Absolutte DNA skade nivåene var forskjellig mellom de 3 cellelinjer med de to kreftcellelinjer som viser mye høyere skadenivå enn TERT over-uttrykker fibroblaster. Vi målte også de absolutte TERT signalintensitetene for de 3 forskjellige lokaliseringer og fant at mitokondrie TERT signal var alltid lavere enn det i kjernen eller i den mellomliggende tilstand (fig. S2B). Det hadde vært vist tidligere at TERT protein nivået er nedregulert i mitokondriene etter H
2o
2 behandling som kan forklare denne observasjonen [19].
mens mitokondrie telomerase forhindrer det. A-C: Representative bilder av TERT lokalisering (grønn), og γH2A.X farging (rød). Blå: DAPI atom counterstain A: HeLa B: MCF7- C: MRC-5 /hTERT celler. Cellene ble behandlet i 3 timer med 400 mikrometer H
2o
2. TERT lokalisering ble bestemt som beskrevet for Figur 1B og gruppert i 3 kategorier: atom TERT (N) TERT (C) og mellomledd TERT (I) lokalisering. Eksempler på de 3 ulike lokaliseringer, er angitt med piler. D: Sammenheng mellom subcellulære TERT lokalisering og kjernefysiske DNA-skader nivåer (antall γH2A.X foci). Cytoplasmatiske TERT lokalisering korrelerer med lav atom DNA-skader i alle 3 cellelinjer mens atom tert lokaliserings gir høy atomskade etter tre timer med behandling med 400 mikrometer H
2o
2. Mellomledd TERT lokaliserings resultater i mellom DNA skade nivåer. Svarte striper: HeLa, røde søyler: MCF7-, grønne linjene: MRC-5 /hTERT. Barer er gjennomsnitt ± SE fra minst 40-100 celler per cellelinje i gjentatte forsøk. * P. 0,05
En sammenheng mellom høyere DNA-skader i kreftceller og nukleært begrenset telomerase stand til shuttle skyldes en mutasjon i sitt atom eksport signal ble beskrevet nylig av Kovalenko og kolleger [13]. Den muterte TERT induserte en økning i spontan telomeric så vel som ikke-telomeric nukleær DNA-skade i 2 cancercellelinjer sammenlignet med de samme celler uten mutasjonen TERT [13]. I tillegg har kreftceller med en mutant TERT som ble begrenset til kjernen og ute av stand til pendel mistet sin evne til spredning, var ikke i stand til å danne kolonier i myk agar og viste en økt mengde av mitokondrie DNA-skade [13]. Sammen tyder disse resultater på at sub-cellulære skyt av TERT kan ha viktige implikasjoner for følsomheten av celler mot DNA-skade. Denne økte motstand på grunn av høy telomerase uttrykk og kjernekraft utelukkelse av TERT kan favorisere overlevelse av kreft stamceller som kan føre til tilbakefall etter behandling [17]. Det er også tidligere publiserte data for en beskyttende rolle av kjernefysisk TERT mot staurosporin apoptose [9]. Imidlertid er staurosporin en protein-kinase-inhibitor som aktiverer apoptose på en rask måte uten å indusere DNA-skade og uavhengig fra mitokondrier. Vi foreslår derfor en annen virkningsmekanisme i begge forsøkene.
neste modellert de ulike tert lokaliseringer separat av over-uttrykke kjernekraft og mitokondrie organelle spesifikke vektorer som uttrykker den katalytiske telomerase subenheten TERT smeltet til en myc-tag i tre kreft cellelinjer: HeLa, MCF7- og U87 glioblastom (fig. 3). Forbigående transfekterte celler ble behandlet enten med H
2o
2 eller bestråling og analysert for γH2A.X DNA skade foci og TERT lokalisering ved hjelp av smeltet myc-tag. Lokalisering for mitokondrie (mito TERT) og kjernekraft TERT er vist i fig. 3A og B (øverste panelene). Det var ingen forskjell i DNA-skade nivåer mellom celler transfektert med enten vektor eller ikke-transfekterte celler før behandling. Imidlertid har vi funnet at det i alle 3 cellelinjer og begge behandlingene, celler med en mitokondriell TERT lokalisering hadde signifikant mindre DNA-skade sammenlignet med de celler som uttrykte enten atom TERT eller var un-transfektert (fig. 3 A-D). For å utelukke at endogen telomerase samhandlet med over-uttrykte skytespill TERT protein vi gjentok eksperimentet i en SV40 udødelig MRC-5 cellelinje som opprettholder sine telomerer via en alternativ forlengelse mekanisme [20]. Post bestråling, fant vi den samme beskyttende effekten av mitokondrie telomerase (Fig. 3 E). Vi har også brukt et antistoff mot 53BP1, et annet protein som er involvert i DNA skade respons for å bekrefte våre resultater at DNA-skade foci er høy i celler transfektert med atom TERT mens i motsetning de transfektert med mitokondrie-TERT vise mindre DNA skade enn un-transfekterte celler ( fig. S3).
H
2o
2 behandling i forhold til atom TERT lokalisering i 4 forskjellige cellelinjer. A: organspesifikke tert vektorer transfektert inn i HeLa celler. Øvre panel: representative bilder av celler transfektert med mitokondrielle og atom TERT skytter vektorer med og uten behandling med 200 pM H
2o
2 til 3 timer. TERT flekker (ved hjelp av myc-tag) smeltet til TERT protein (grønn) og γH2A.X farging (rød) for DNA-skade foci. Pilene viser transfekterte celler. Nedre panel: Kvantifisering av celler med høye nivåer av DNA-skader foci for transfektert og un-transfekterte celler med og uten H
2o
2 behandling. Barer er gjennomsnitt ± SE fra 3 uavhengige eksperimenter, * P 0,05. B: organspesifikke tert vektorer transfektert inn MCF7 celler. Paneler som beskrevet for A. C-F: Kvantifisering av celler med høye nivåer av DNA-skade foci for transfektert og un-transfekterte celler med og uten røntgenbestråling. C: MCF7- etter 20 Gy X- bestråling. D: U87 etter 20 Gy X-bestråling. E: MRC-5 /SV40 etter 10 Gy X-bestråling. Stolper gjennomsnitt ± SE fra 3 uavhengige eksperimenter. * P. 0,05
Siden store mengder atom DNA-skade er tenkt å redusere overlevelse av celler vi analysert hvorvidt de benyttede stressbehandlinger vil også svekke celle overlevelse og indusere apoptose. Vi behandlet 3 cellelinjer transfektert med både TERT shooter vektorer med H
2o
2 og X-bestråling og bestemt apoptoseinduksjon bruker et antistoff mot aktivert caspase 3. Forbløffende nok ikke en eneste celle transfektert med mitokondrie-TERT viste noen tegn av apoptose mens rundt 20% av un-transfekterte celler og mellom 40-60% av celler som uttrykker atom skytteren apoptotiske (fig. 4). Dette resultatet bekrefter at faktisk den induserte DNA skade funnet i celler med atom tert lokalisering virker direkte på celle overlevelse mens mitokondrie TERT effektivt beskytter mot apoptose. For å belyse mekanismen som mitokondrial TERT kan beskytte cancerceller fra atom DNA skade målte vi mengden av mitokondriell ROS etter H
2o
2 rensing og bestråling ved å bruke mitosox flekker som et mål for mitokondriell superoksyd-generering i tillegg til mYC-tERT farging for kjernekraft og mitokondrie «shooter» vektorer i de samme 3 kreftcellelinjer (fig. 5 A-E). Mitosox fargestoff blir tatt opp av mitokondrier i en membranpotensial bestemt måte. For å utelukke at ulike membranpotensialet forårsaket effekter, målte vi mitokondriemembranen potensial i HeLa og MCF7 celler transfektert med både tert skyttere og sammenlignet dem med un-transfekterte celler etter H
2o
2 behandling samt X -irradiation. I henhold til våre tidligere funn av økt mitokondriemembranen potensial i MRC-5 /hTERT forhold til foreldre fibroblaster bekrefte resultatene betydelig høyere membranpotensialet i cellene over-uttrykker mitokondrie TERT, som er i HeLa celler allerede tydelig selv før noen stress behandling (fig. S4). Derfor mitosox nivåene funnet i våre eksperimenter virkelig representerer forskjellige ROS-nivåer som er avhengig av TERT lokalisering. Vi fant at overuttrykk av mitokondriell TERT i alle celletyper resulterte i betydelig lavere ROS nivåer etter H
2o
2 behandling og bestråling i forhold til FN-transfekterte celler eller de som over uttrykt atom TERT (Fig. S4 )
Representative bilder av aktivert caspase 3 (vist i rødt) i A:. Hela, B: MRC /SV40, C: U87-celler transfektert med mito TERT og kjernekraft TERT (myc-tag, vist i grønt) etter 400 mikrometer H
2o
2 behandling i 3 timer eller bestråling med 20 Gy. D: Kvantifisering av andelen av apoptotiske celler av de 3 cellelinjer etter H
2o
2 behandling, E: Kvantifisering av andelen av apoptotiske celler av de 3 cellelinjer etter X-bestråling. Barer stede gjennomsnitt og standardfeil fra rundt 45 transfekterte celler per tilstand og cellelinje. * P 0,05
Øvre panel. Representative bilder av ROS farging (rød, mitosox) og TERT lokalisering (myc-tag, grønn) etter organspesifikk TERT transfeksjon og 100 mikrometer H
2o
2-behandling i 3 timer i HeLa-celler. Øvre rad: mito- TERT, nedre rad: atom TERT. Pilene viser transfekterte celler. Nedre panel: Kvantifisering av ROS-nivåer målt i prosent av mitosox positiv område fra hele cytoplasma hjelp ImageJ i transfekterte og un-transfekterte celler. B: MCF7 celler, paneler som beskrevet for A. C: Kvantifisering av ROS i U87-celler etter 3 timer på 100 mikrometer H
2o
2 behandling. D-F: Kvantifisering av ROS-nivåer etter X-bestråling. D: MCF7- etter 20 Gy X-bestråling. E: U87 etter 20 Gy X-bestråling F: MRC-5 /SV40 etter 10 Gy X-bestråling. Barer representerer gjennomsnitt ± SE fra 3 uavhengige eksperimenter. * P. 0,05
Igjen brukte vi MRC-5 /SV40 celler uten endogen telomerase å bekrefte resultatene fra de tre kreftcellelinjer og fant den samme beskyttende effekten av mitochondrially lokalisert TERT på ROS nivåer ( fig. 5F). ROS-nivåer i celler som uttrykker atom TERT «skyter» vanligvis var ikke forskjellig fra ikke-transfekterte celler med unntak av MCF7 og MRC-5 /SV40-celler etter bestråling, hvor atomskyter transfekterte celler viste lavere ROS-nivåer enn un-transfekterte celler.
Disse dataene tyder på at ved skyt i mitokondriene telomerase /TERT ikke bare beskytter organeller, men ved å redusere mitokondrie superoxide produksjon også indirekte beskytter kjernen fra DNA-skader. Lignende observasjoner av telomerase skytteltrafikk fra nukleoplasma til nucleoli hadde blitt rapportert tidligere i henhold ioniserende stråling i grunnskolen og kreftceller [21]. Forfatterne har spekulert på at telomerase kan negativt påvirke reparasjonsenzymer i kjernen under betingelser med øket DNA-skade og belastning. Våre resultater synes å støtte dette forslaget som telomerase kan være «uønsket» i kjernen under forhold med DNA-skader. Telomerase har vist seg å «gro» kromosomer ved å forsøke en form for DNA-reparasjon ved å legge telomere sekvenser brutt telomere ender [22]. Dette kan imidlertid ikke føre til riktig DNA-reparasjon, som er kjent for å være utført av virkelige DNA-reparasjonssystemer.
Våre resultater viser at mitokondrie telomerase lokalisering spesifikt avtar mitokondrie ROS generasjon og cellulær oksidativ stress etter induksjon av eksogent spenning generert av H
2o
2 eller bestråling i kreftceller og kan dermed forhindre skader på kjerne-DNA. Det kan også forklare hvorfor skyt av telomerase fra kjernen til mitokondriene synes å fremme celle overlevelse, mens i cellene der telomerase er ikke i stand til å forlate kjernen DNA skader akkumulering er observert.
Diehn og kolleger rapporterte nylig at kreft stamceller som produserte mindre ROS grunn av høyere antioksidant uttrykk akkumulert mindre DNA skader etter ioniserende stråling [23]. Det ville være interessant å undersøke om disse cellene har også mer ekskludert telomerase enn ikke-kreftstamceller etter bestråling. Det er blitt vist at kreftstamceller uttrykker høy telomeraseaktivitet nivå; men ingenting er kjent om TERT skyt i disse cellene [24].
Vi har vist tidligere at eksogene ROS generasjon ved bestråling i fibroblaster skader mitokondrier og akselererer atom DNA-skader og skaper en positiv feedback loop [25]. Vi foreslår at en slik funksjonell interaksjon mellom mitokondrier og kjernen finnes også i kreftceller og andre telomerase-positive celler, hvor telomerase trer mitokondriene for å redusere ROS som er indusert av kjemoterapeutiske medikamenter og bestråling. Dermed ser det ut til at anti-kreft behandlinger kan indusere en roman, hittil ukjente mekanismen for telomerase skyt som hindrer atom DNA-skade ved å redusere mitokondrielle ROS generasjon via induksjon av telomerase skytteltrafikk. På grunn av sin heterogene mønster kan det også forklare motstanden av noen, men ikke alle, kreftceller mot terapeutiske behandlinger.
Materialer og metoder
Cells
HeLa, MCF7, U87 og MRC5 /SV40 celler stammer fra ATCC. MRC5 ble kjøpt fra ECACC (London). hTERT overekspresjon ble utført ved anvendelse av retrovirale transfeksjon av hTERT som tidligere beskrevet [10]. U 87 og MRC5 /SV40-celler ble dyrket i MEM og DMEM supplert med henholdsvis 1% ikke-essensiell aminosyre, 10% FCS (Sigma), 2 mM glutamin og 1% penicillin /streptomycin. Alle andre celletyper ble dyrket i DMEM (PAA) inneholdende 10% FCS (Sigma), 1% penicillin /streptomycin (PAA) og 2 mM glutamat (Gibco). Cellene ble inkubert ved 37 ° C ved omgivende oksygen og 5% CO
2.
Behandlinger
-celler ble sådd ut 1 eller 2 dager før behandling på 19 mm dekkglass i 12 brønners plater for immuno-fluorescens farging (5 × 10
4 per brønn).
H
2o
2 (SIGMA) behandlingen ble utført i serumfritt medium i de angitte tidsrom og konsentrasjoner. Den brukte H
2o
2 konsentrasjonen var blitt optimalisert for hver annen type eksperiment. X-bestråling på 10 Gy og 20 ble utført ved anvendelse av en Faxitron (Elektron Technology, UK). For alle bestrålingsforsøk (med unntak av apoptose-analyse) celler ble fiksert og analysert 20 minutter etter behandling. Celler ble løst ved hjelp av 4% paraformaldehyde i PBS i 10 min.
Immuno-fluorescens Farging og Imaging
Celler ble festet på dekk bruker 4% paraformaldehyde i 10 min. Enkel eller dobbel immunofarging ble utført med følgende primære antistoffer: mus γH2A.X (Upstate), kanin anti-TERT (Rockland), kanin anti-Ki67 (Abcam) og anti myc-tag (Abcam). Spesifisitet og mangel på bakgrunnsfarging av den brukte TERT antistoffet er blitt bekreftet (fig. S5). Sekundære antistoffer var: geit-anti-mus og kanin Alexafluor 594 og 488 (Molecular Probes /Invitrogen). Nuclear farging ble observert ved hjelp av DAPI. Bilder for hver kanal ble oppnådd ved anvendelse av en AxioImager Z1 mikroskop (Zeiss) som er utstyrt med egnede filter kuber til spektralt skille Alexafluor
488 og Alexafluor
594, sikrer ingen bleedthrough inn i /fra enten fluorofor (etableres tidligere, data ikke vist) . Bilder ble deretter analysert ved hjelp ImageJ. Terskler ble definert for hvert bilde individuelt.
Confocal Fluorescensmikroskopi og samlokalisering analyse
Celler ble lastet med 400 nM mitotracker grønn (Molecular prober) i 30 minutter ved 37 ° C før fiksering og deretter farget med anti-tERT-antistoff og Alexa Fluor® 594. Bilder ble tatt med et Zeiss LSM 510 er utstyrt med en 63 x 1,4 NA mål med den pinhole satt til en Airy enhet (Zeiss, Tyskland). Z stabler ble oppnådd hver 100 nm for hver celle (sampling 2 × Nyquist-kriterier). Bilder ble dekonvolveres og deretter analysert for objekt samlokalisering i 3D ved hjelp av Huygens-programvare (SVI, Nederland). For colocalization analyse og bilde forberedelse ble dekonvolveres bildene gjengis i 3-dimensjonal volumer. Enkeltceller ble isolert i bildet og enkelt, enhetlig objekter (mitokondrie og tert) ble identifisert ved hjelp av «Object colocalization «i Huygens med en cut-off for å utelukke eventuelle objekter som er mindre enn en mitokondrie i mitotracker grønne kanalen. Huygens så beregnet en Pearsons korrelasjon koeffisient for hver celle for 3 dimensjonal colocalization mellom mitokondrier og Tert farging. Dette gjorde oss i stand til å forutsi sant colocalization (innenfor rammene av diffraksjon begrensning) av de to fargestoffer uavhengig av deres ulike bølgelengder.
Organelle Spesifikk Transfeksjon
TERT inneholder atom og mitokondrie organelle spesifikke vektorer ( pCMV-myc-mitoTERT og pCMV-myc-nucTERT var en slags gave fra J. Haendeler og Joachim Altschmied, Düsseldorf, Tyskland og beskrevet tidligere [9], [11]). Transient transfeksjon ble utført ved hjelp lipofektamin ™ 2000 (Invitrogen, USA) av mito-TERT og NUC-hTERT «shooter» vektorer. De gjennomsnittlige transfeksjonseffektiviteter 48 timer etter transfeksjon var mellom 25 og 30%. Forbigående transfekterte celler ble behandlet 2 dager etter transfeksjon enten med H
2o
2 eller bestråling.
Fastsettelse av ROS nivå
Celler ble farget med fem mikrometer mitosox (Invitrogen, USA ) i 15 minutter etter at H
2o
2 behandling eller bestråling før fiksering og antistoff farging. ROS-nivåer ble bestemt som prosentandelen av cytoplasmatiske mitosox signal fra total cytoplasma området ved hjelp av Image J (https://rsbweb.nih.gov/ij/).
Analyse av DNA Damage
Analysis av DNA-skade ble utført ved anvendelse av immuno-fluorescens, enten som en enkelt farging med γ-H2A.X eller dobbel farging med TERT. Celler ble løst, permeabilized med PBG (PBS, BSA, fishskin gelatin og 0,5% Triton) og γ-H2A.X antistoff ble brukt til cellene og deretter farget med Alexa Fluor® 594. Anti myc-tag og Alexa Fluor® 488 var brukes til å visualisere transfekterte TERT protein. Objektglassene ble undersøkt ved bruk av et Zeiss Axiovision fluorescens mikroskop (Zeiss, Tyskland). For analyse av DNA-skade antall DNA-skade foci ble tellet for hver type TERT lokalisering separat fra 20-40 celler pr gruppe og cellelinje.
Måling av tert-Exclusion Rate
For hver enkelt celle, tERT lokalisering ble manuelt kvantifisert ved å sammenligne telomerase signaler i og utenfor kjernen bruker bilde~~POS=TRUNC J. subcellulære områder ble bestemt for kjernekraft og cytosoliske regioner ved hjelp frihånd valg. Expression signaler i det valgte området ble vurdert ved hjelp av arealberegning funksjon etter terskel å fjerne støy. Resultatet av hver enkelt celle antydet en prosentandel av TERT signal uttrykt i subcellulære rommet:
% TERT atom uttrykk = TERT signal i kjernen område /totalt TERT signal × 100, etter
% TERT cytoplasma uttrykk = TERT signal i cytosol området /total TERT signal × 100. Den gjennomsnittlige andelen av kjernekraft og cytoplasma lokalisering av TERT fra minst 30 individuelle celler ble tatt for å bestemme den gjennomsnittlige andelen av hele befolkningen.
Korrelasjonen av Cellular TERT lokalisering og DNA Damage nivå
klassifisert lokalisering av tERT inn i 3 klasser: kjerne tERT (N): 75% -100% av tERT signal befinner seg i kjernen, cytoplasmiske tERT (C): 75% -100% av tERT signal ligger utenfor kjernen, og alle andre prosenter for klassen av mellomliggende lokalisering (i). For hver av de 3 klassene vi bestemt antall γH2A.X foci fra rundt 40-100 celler per cellelinje.
Analyse av apoptose
Hela, U87 og MRC /SV40 celler ble transfektert med kjernekraft og mitokondrie TERT skytespill. Etter 2 dager ble de behandlet enten med 400 mikrometer H
2o
2 eller 20 Gy bestråling og venstre for en mer dag (U87 og MRC /SV40) eller 2 dager for HeLa skyldes en kjent forsinkelse i apoptoseinduksjon i disse cellene. Etter fiksering ble cellene farget med myc-tag for TERT og aktivert caspase 3 (Abcam) for å merke apoptotiske celler. Resultatene har blitt bestemt fra 30-150 transfekterte celler per cellelinje og tilstand.
statistikker
En måte ANOVA ble utført ved hjelp av Sigma Plot (Systat Software Inc, USA).
Hjelpemiddel Informasjon
Figur S1.
Immuno-blot av kjernekraft og mitokondrie fraksjonen i Hela og MCF7 celler behandlet med 400 mikrometer H
2o
2 i 5 dager.
