Abstract
gaffelhodeboks M1 (FOXM1) er en spredning assosierte transkripsjonsfaktor avgjørende for cellesyklusprogresjon. Tallrike studier har dokumentert at FOXM1 har flere funksjoner i tumorigenesis og dens forhøyede nivåer er ofte assosiert med kreft progresjon. Her, preget vi rollen som ERK /FOXM1 signalisering i formidling av metastatisk potensial for eggstokkreft celler. Immunhistokjemisk (IHC), immunoblotting og semi-kvantitativ RT-PCR-analyser fant at både fosfor-ERK og FOXM1 ofte ble oppregulert i eggstokkreft. Forbløffende nok den uttrykt fosfo-ERK (
p
0,001) og FOXM1 (
p
0,001) var signifikant korrelert med høy grad ovarietumorer med aggressiv atferd som for eksempel spredning lymfeknute (5 av 6). Videre uttrykk for fosfor-ERK og FOXM1 hadde signifikant positiv korrelasjon (
p
0,001). Funksjonelt, ektopisk uttrykk for FOXM1B bemerkelsesverdig forbedret celle migrasjon /invasjon, mens FOXM1C ikke bare økt celledeling, men også fremmet celle migrasjon /invasjon. Motsatt, hemming av FOXM1 uttrykk ved enten Thiostrepton eller U0126 kunne gi en betydelig svekke FOXM1 mediert onkogene kapasiteter. Imidlertid er nedregulering av FOXM1 ved enten tiostrepton eller U0126 kreves tilstedeværelse av p53 i eggstokkreft celler. Samlet våre data tyder på at overuttrykk av FOXM1 kan stamme fra konstitutivt aktiv ERK som gir de metastatiske evner til eggstokkreft celler. Nedskrivningen av metastatisk potensial av kreftceller ved FOXM1 hemmere understreker sin terapeutiske verdi i avanserte ovarietumorer
Citation. Lok GTM, Chan DW, Liu VWS, Hui WWY, Leung THY, Yao KM, et al. (2011) Aberrant Aktivering av ERK /FOXM1 signalkaskade utløser Cell migrasjon /Invasion i eggstokkreft celler. PLoS ONE 6 (8): e23790. doi: 10,1371 /journal.pone.0023790
Redaktør: Maria G. Castro, University of Michigan, USA
mottatt: 9 desember 2010; Godkjent: 26 juli 2011; Publisert: 17 august 2011
Copyright: © 2011 Lok et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Denne studien ble støttet av Wong Cheuk Hun Charitable Foundation. Denne støtten er bidrag fra privatpersoner, og ingen Funder nettsted er tilgjengelig. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Eggstokkreft er en av de mest dødelige gynekologiske kreftformer over hele verden. På grunn av uspesifikke symptomer, er de fleste av eggstokkreft tilfeller presenteres med avansert stadium sykdom og forbinder med høy dødelighet [1]. I avansert eggstokkreft, kreftceller er meget inngripende og den påfølgende kreft metastase fører til død [2]. Både cellemigrering og invasjon bidra metastatisk evne til tumorceller og den genetiske mekanismen som regulerer metastase forblir stort sett ukjent. Derfor er det av avgjørende betydning å identifisere molekylære meklere overdragelse av metastatisk potensial til eggstokkreft celler som kan brukes som tumormarkører i å forutsi risikoen for kreft progresjon eggstokkreft.
gaffelhode Box M1 (FOXM1) er en typisk transkripsjon faktor som tilhører gaffelhode Box familien [3]. FOXM1 er velkjent for sin kritisk rolle i cellesyklusprogresjon ved å regulere G1 /S og G2 /M-fasene av cellesyklusen overgang og å sikre en skikkelig gjennomføring av mitotisk celledeling [3], [4], [5]. Imidlertid montering bevis støtter en kobling mellom avvikende ekspresjon av FOXM1 og humane karsinomer, for eksempel kreft i bukspyttkjertelen, basalcellekreft, glioblastom og livmorhalskreft [6], [7], [8], [9]. Enda viktigere, har den økte ekspresjon av FOXM1 bemerkelsesverdig korrelasjon med de progressive stadier av mange humane cancere [6], [9], [10], [11], [12]. Derfor FOXM1 ikke bare fremmer tumordannelse ved endowing proliferativ kapasitet og fører til ukontrollert celledeling i den første perioden av kreftutvikling, men også forbedrer andre tumorigen atferd i andre stadier av kreftutvikling [12], [13], [14]. Hittil har flere linjer med bevis vist at FOXM1 kunne forbedre angiogenese i glioma celler [15], forankringsuavhengig vekst evne i livmorhalskreftceller [6], tumorvekst evne glioma celler [7] og metastasering av hepatocellulært karsinom celler i nakne mus [16], noe som tyder på de ulike rollene FOXM1 i tumorigenesis. Nylig har Cancer Genome Atlas Research Network brukte en probabilistisk grafisk modell (PARADIGM) for å bevise at FOXM1 signale kritisk assosiert med serøs eggstokkreft patofysiologien [17]. Men uttrykket status og funksjonelle roller FOXM1 i eggstokkreft, spesielt i celle migrasjon /invasjon er i stor grad spekulativ. Dette fremhever et presserende behov for å avgrense den molekylære mekanismen bak kreft progresjon for å øke overlevelsen av pasienter med eggstokkreft.
konstitutiv aktivering av ERK signal er vanligvis forbundet med neoplastisk transformasjon som ukontrollert cellevekst av stimulering av celleoverlevelsesreaksjonsveien og å øke celle motilitet [18], [19], [20], [21]. Tidligere studier har rapportert at ERK opptrer oppstrøms for FOXM1 og fosforylering av FOXM1 av ERK er nødvendig for kjernen translokasjon og påfølgende transaktivering [22]. I tillegg har FOXM1 vist seg å være en av de ERK effektorer i human leverkreft og brystkreft [23], [24]. Men funksjonen av ERK /FOXM1 signalkaskade i regulering av cellemigrasjon /invasjoner er ennå ikke klart belyst.
I denne studien har vi først analysert uttrykket status og clinicopathological korrelasjon av FOXM1 i eggstokkreft. Flere tumorigene analyser ble utført i eggstokkreft cellemodeller ved hjelp av gevinst-og tap-av funksjon FOXM1 gjennom tvungen uttrykk for FOXM1 eller hemming av endogen FOXM1 av Thiostrepton eller U0126. Vi ga også data som viser viktigheten av p53 status i bruken av FOXM1 inhibitorer. Videre tilbyr vi den første
in vitro
bevis på ERK /FOXM1 signalkaskade i å fremme celle migrasjon /invasjon i eggstokkreft celler. Dette overfører en oppmuntrende mål i kampen mot avansert eggstokkreft.
Resultater
FOXM1 er over-uttrykt og korrelerer med ekstra fordel uttrykk og høyverdig subtype av eggstokkreft
For å studere betydningen av FOXM1 uttrykk i eggstokkreft utvikling, IHC analyse på en kommersiell vev utvalg av 97 eggstokkene vevsprøver, inkludert to normal, 2 godartet, en border cystademoma og 96 ondartede kreftprøver ble gjennomført. Høy FOXM1 uttrykk var signifikant korrelert med høy grad av tumorer (grad 3) (
P
0,001), hvor 73,33% av Grad 3 svulster tilfeller utstilt over-uttrykk for FOXM1 mens 68% av klassetrinn 1 og 2 svulster tilfeller viste lav uttrykk for FOXM1 (tabell 1). Når det gjelder tumor-subtype, ble ekspresjonen av FOXM1 høyt korrelert med endometriod adenocarcinoma (
P
0,05), i hvilken 74,07% av tilfellene viste over-ekspresjon av FOXM1 (tabell 1). I tillegg fem av seks tilfeller med lymfeknutemetastase viste over-uttrykk for FOXM1 (data ikke vist). Til tross for den begrensede utvalgsstørrelsen, kan det være en referanse for en sammenheng mellom FOXM1 og fjernmetastaser. Dessuten ble en bemerkelsesverdig sammenheng oppdaget mellom oppregulering av både FOXM1 og perk (
P
0,001) (tabell 1). I likhet med FOXM1, ble en signifikant korrelasjon oppdaget mellom uttrykket av Perk og høyverdig svulster (
P
0,001), hvor 66,67% av Grad 3 svulster viste høy uttrykk for Perk (tabell 2). Konkordant svak til meget sterk farging av Perk og FOXM1 ble også observert fra border cystademoma til grad 3 svulst, implicating betydningen av de to proteinene i tumor progresjon av kreft i eggstokkene (Fig. 1a).
(A) Representant IHC viste immunoreaktivitetene av FOXM1 og Perk i grenseland, Grade 1, klasse 2 og klasse 3 svulst på en eggstokkreft vev array (OVC1021) (x20). Økende farging av både FOXM1 og perk ble observert sammen med utviklingen av kreft som impliserer deres potensielle roller i tumorigenesis. (B) Western blotting viste uttrykk for Perk, ERK og FOXM1 i slanger og eggstokkreft cellelinjer. (C) Real time QPCR analyse avslørte uttrykk for FOXM1 isoformer;
FOXM1B Hotell og
FOXM1C
i slanger og eggstokkreft cellelinjer.
FOXM1A
ble neglisjert i dette forsøket fordi det ble rapportert som transcriptionally inaktiv.
For cellelinjer studien uttrykk for Perk og FOXM1 også demonstrert en god korrelasjon i et panel av eggstokkreft og slanger cellelinjer. Begge proteiner ble sterkt uttrykt i kreftcellelinjer, spesielt i OVCAR3, SKOV3, OVCA429 og A2780cp, mens de viste lavere uttrykk i HOSE cellelinjer (Fig. 1B). Tilsvarende sanntid QPCR analyse ved hjelp av spesifikke primere ifølge tidligere rapport [12] viste at både
FOXM1B plakater (27-250 ganger) og
FOXM1C plakater (25-172 ganger) var opp -regulated i eggstokkreft cellelinjer som sammenlignet med SLANGE cellelinjer (Fig.1C). Dette resultatet var konsistent til resultatene av Western blot-analyse, og viste også at det var ingen forskjell av uttrykket mønsteret mellom to isoformer i eggstokkreft celler. Sammen er disse data tyder på at både ERK aktivitet og FOXM1 uttrykk er oppregulert og positivt korrelert i eggstokkreft, spesielt i aggressive høyverdig svulster, som impliserer deling av en felles vei i kreft progresjon eggstokkene.
FOXM1 fremmer celledeling og cellemigrasjon /invasjon
Gitt at høyverdig svulster var svært proliferativ og metastatisk, begrunnet vi at FOXM1 spiller en viss rolle i å regulere cellemotilitet og invasjon. For å sondere onkogene roller FOXM1 i eggstokkreft, vurdert vi de funksjonelle effekter av to aktive FOXM1 isoformer, FOXM1B og FOXM1C, på A2780cp og OVCA433 celler (fig. 2A). I samsvar med tidligere rapporter [14], [25], FOXM1C kunne øke kapasiteten celleproliferasjon i A2780cp (
P
0,005) og OVCA433 (
P
= 0,006) eggstokkreft celler, mens FOXM1B bare viste liten økt effekt (fig. 2A). På den annen side, kan ektopisk ekspresjon av FOXM1B og FOXM1C fremme hurtigere sårheling i A2780cp og OVCA433 eggstokkreft celler ved sårheling assay (fig. 2B). Ved Transwell migrasjon /invasjon analyser, innføring av FOXM1B og FOXM1C viste også en betydelig økt celle migrasjon (
P
0,05 i A2780cp og
P
0,005 i OVCA433). (Fig 2C ) og celle invasjon (
P
0,05 i A2780cp og
P
. 0,01 i OVCA433) (figur 2D) evner i A2780cp og OVCA433 celler sammenlignet med vektor kontrollene. Interessant, FOXM1B hatt relativt sterkere innflytelse for å fremme celle migrasjon og invasjon sammenlignet med FOXM1C. Samlet utgjør disse dataene konferere at FOXM1 isoformer kan forskjellig fremme celleproliferasjon, migrasjon /invasjonen i eggstokkreft celler.
(A) XTT celleproliferasjon analysen viste at FOXM1C kunne gi vesentlig økt celleproliferasjon av i A2780cp (*
P
0,005) og OVCA433 (**
P
= 0,006) eggstokkreft celler, mens FOXM1B bare hadde litt effekt. Western blotting viste uttrykk for FOXM1B (1B) og FOXM1C (1C) i A2780cp og OVCA433 celler ved hjelp av anti-FOXM1 (K19). Den tomme vektor ble anvendt som negativ kontroll (V). (B) sårtilheling analysen viste raskere sårheling frekvensen av FOXM1B eller FOXM1C ektopisk uttrykker A2780cp (*
P
0,05) og OVCA433 (**
P
0,01) celler sammen med vektor kontroll (*
P
0,05). (C) Transwell migrasjon analysen og stolpediagrammet viste høyere trekkhastighet i FOXM1B og FOXM1C ektopiske uttrykker cellene A2780cp (*
P
0,05) og OVCA433 (*
P
0,005 ) sammenlignet med deres vektorkontroll (V). (D) Transwell celle invasjon analysen og stolpediagrammet viste høyere invasjon hastighet gjennom Matrigel belagt membran i FOXM1B og FOXM1C ektopisk uttrykker celler A2780cp (*
P
0,05) og OVCA433 (*
P
0,01) sammenlignet med deres vektorkontroll (V). De ovennevnte eksperimenter ble utført tre ganger uavhengig og resultatet ble plottet.
Effektiv hemming av FOXM1 uttrykk ved Thiostrepton krever p53
thiazole antibiotika Thiostrepton kan spesifikt hemme uttrykket av FOXM1 på genet promoter nivå i brystkreftcellelinjer [26], og derfor ble det brukt til å utarme uttrykk for FOXM1 i eggstokkreft celler. Ved Thiostrepton behandling, observerte vi ulike reaksjoner fra FOXM1 i eggstokkreft cellelinjer som bærer ulike p53 genotypiske statuser: OVCA433 (p53 villtype), A2780cp (p53 mutant) og SKOV3 (p53 slettet). OVCA433 og A2780cp celler viste en markert nedgang av FOXM1 ekspresjon i en tids- og doseavhengig måte, så vel som en økt ekspresjon av p53 ved høyere dose (20 uM) fra tiostrepton (fig. 3A). På den annen side, SKOV3 var motstandsdyktig mot tiostrepton og FOXM1 ekspresjon opprettholdes ved 10, 30 og 50 uM. Disse funnene tyder på at p53 kan være involvert i Thiostrepton fungerende mekanisme. Tatt i betraktning de svært motsatte roller p53 og FOXM1 i cellesyklus regulering og den negative virkningen av p53 på FOXM1 uttrykk vist i forrige mikromatriseresultat [5], [27], [28], [29], [30], vi vurderes uttrykk for FOXM1 ved endring av p53 uttrykk i eggstokkreft celler. Transient transfeksjon av p53 bemerkelsesverdig redusert FOXM1 ikke bare på protein-nivå (fig. 3B), men også i mRNA nivå (Fig. 3C) i OVCA433, A2780cp og SKOV3. Disse resultatene indikerer at p53 negativt regulerer både mRNA og proteinnivåene av FOXM1 og p53 er avgjørende for tiostrepton å utøve hemming på FOXM1 ekspresjon i eggstokkreft celler.
(A) Western blotting avslørte nedregulering av FOXM1 og oppregulering av p53 i ovarie cancer cellelinjer; OVCA433 og A2780cp, men ikke i SKOV3 ved behandling av tiostrepton under forskjellige doser og tidsintervaller. (B) Western blotting viste at transient transfeksjon med p53 kan undertrykke FOXM1 uttrykk i eggstokkreft celler (OVCA433, A2780cp og SKOV3). (C) Real time PCR indikert nedregulering av
FOXM1
transkripsjoner ved transient transfeksjon av p53.
nedregulering av FOXM1 svekker celle migrasjon /invasjon
Vi antok at Thiostrepton kan undertrykke eggstokkreft celle migrasjon /invasjon ved å hemme uttrykket av FOXM1. Siden Thiostrepton kan indusere apoptotisk effekt på kreftceller [26], XTT analyser ble utført tre ganger for å utelukke faktor på redusert celle levedyktighet som kan påvirke nøyaktigheten av å bruke sårheling tid for celle migrasjon evaluering. Faktisk cellelevedyktigheten av de ovennevnte cellelinjene viste ingen signifikante endringer ved behandling av doseringsområdet fra 0 til 10 uM tiostrepton (fig. S1). Ved behandling med tiostrepton, OVCA433 celler viste en tydelig undertrykkelse av cellemigrering, med ~ 50% reduksjon for sårheling hastighet sammenlignet med den ubehandlede kontroll i sårheling assay (
P
0,05) (Fig. 4A ). Det ble observert tilsvarende inhiberende effekt på cellemigrering i A2780cp-celler (data ikke vist). Men behandling på SKOV3 viste ingen signifikant innvirkning på celle trekkfugl hemming (fig. S2). Videre behandling av 10 mikrometer Thiostrepton på OVCA433 også dramatisk redusert ca 37% cellemigrasjon (
P
0,05), og 75% celle invasjon (
P
0,05) evner i forhold med kontroller i Matrigel-analyse (fig. 4B). Samlet utgjør disse data tyder på at FOXM1 regulerer celleproliferasjon og cellemigrasjon /invasjon i eggstokkreft celler betydelig.
(A) sårtilheling analysen viste lavere lukking av sår rate av Thiostrepton behandlet OVCA433 celler sammenlignet med ubehandlet kontroll (*
P
0,05). (B) Transwell migrasjon analysen og stolpediagrammet viste signifikant lavere antall trekkende cellene gjennom Matrigel belagt membran i FOXM1-utarmet OVCA433 celler enn kontrollgruppen (*
P
0,05) (
over
). Transwell celle invasjon analysen og stolpediagrammet viste lavere invasjon rate i FOXM1-utarmet OVCA433 celler etter Thiostrepton behandling sammenlignet med kontrollgruppen (*
P
0,05) (
lavere
). (C) Western blotting avslørte nedregulering av FOXM1 i ovarie cancer-cellelinjer (OVCA433 og OV2008) ved behandling med U0126 i forskjellige tidsintervaller. (D) sårtilheling analysen viste lavere lukking av sår sats på U0126 behandlet OVCA433 celler sammenlignet med ubehandlet kontroll (*
P
0,05). Tre uavhengige eksperimenter ble utført og resultatet ble plottet.
ERK aktivitet regulerer cellemigrasjon formidlet av FOXM1 i eggstokkreft celler
Som ovennevnte studien underforstått den plausible sammenslutning av ERK aktivitet og FOXM1 uttrykk (fig. 1A og 1B), er det interessant å undersøke den underliggende molekylære mekanismen. OVCA433 og OV2008 celler ble behandlet med MEK hemmer U0126 og nivåene av Perk og FOXM1 ble evaluert ved ulike tidspunkt av western blot analyse. En bemerkelsesverdig reduksjon av ekstra fordel nivået ble observert i begge cellelinjer så tidlig som 30 minutter, og det var en samtidig reduksjon av FOXM1 ekspresjon (Fig. 4C). Dessuten, inhibering av FOXM1 ekspresjon opprettholdes så lenge som ERK-aktiviteten forble trykt (fig. 4C). Siden ERK ligger opp-stream of FOXM1 [23], [24], begrunnet vi at hemming av ERK aktivitet bør oppheve celle migrasjon av eggstokkreft celler gjennom nedregulere FOXM1. Faktisk, ved hjelp av sårheling assay, OVCA433 celler behandlet med U0126 viste en signifikant økning av sårlukking tiden (to ganger mer) sammenlignet med kontrollgruppen (
P
0,05) (Fig. 4D). På den annen side var det ingen reduksjon av FOXM1 ekspresjon og celle motilitet i SKOV3-celler (p53 slettet) ved behandling av U0126 (fig. S3), noe som indikerer at tilstedeværelse av p53 er nødvendig for U0126 eller tiostrepton mediert FOXM1 hemming. Samlet utgjør disse funnene støtter en viktig rolle FOXM1 i formidling effekten av ERK på celle migrasjon i eggstokkreft celler.
MMP-9 og uPAR er FOXM1 nedstrøms mål regulerer cellemigrasjon /invasjon
ekstracellulære proteaser som metalloprotease-9 (MMP-9) og urokinase reseptor (uPAR) er markører til oppkjøpet av metastatisk evne [2]. Derfor, vi undersøkte nivåene av
MMP-9 Hotell og
uPAR
å bekrefte effekten av FOXM1 på cellemotilitet og invasjon. Ved å undertrykke FOXM1 uttrykk med 5 og 10 mm Thiostrepton i OVCA433, nivåene av både
MMP-9 Hotell og
uPAR
ble redusert med om lag 20 til 30% (Fig. 5). Omvendt, forbigående over-uttrykk for FOXM1 økt
MMP-9 Hotell og
uPAR
nivåer ved ~1.7-fold og ~2.4 ganger i henholdsvis (Fig. 5). Disse dataene antyder at FOXM1 regulerer cellemigrasjon /invasjon gjennom transcriptionally opp-regulerer uttrykk for
MMP-9 Hotell og
uPAR
.
Semi-kvantitativ RT-PCR viste at hemming av FOXM1 uttrykk ved Thiostrepton (5 og 10 mm) i OVCA433 forårsaket en nedgang på
MMP-9 Hotell og
uPAR
uttrykk (
venstre
), mens forbigående transfeksjon med FOXM1 uttrykk plasmid (1 og 2 mikrogram) i OVCA433 viste en økning på
MMP-9 Hotell og
uPAR
uttrykk (
midt
). Tallverdien under hvert panel henvist til mRNA uttrykket nivå i forhold til kontrollgruppen.
Diskusjoner
I denne studien har vi vist at FOXM1 var abnormt oppregulert i eggstokkreft , spesielt i høy grad undertype. Tilsvarende økte fosfor-ERK ved samtidig med FOXM1 var signifikant forbundet med høy grad av eggstokkreft. Vi derfor foreslått at FOXM1 overekspresjon kan stamme fra konstitutivt aktivert ERK signal som bidrar til metastatisk evne i kreftceller. Vår studie viser at ERK /FOXM1 signalkaskade kan være et lovende mål for terapeutisk intervensjon i eggstokkreft.
Vi og andre grupper har tidligere rapportert at FOXM1 ofte deregulert i en rekke av kreft hos mennesker [31]. Viktigere, den økte FOXM1 ekspresjon var forbundet med tumorutvikling av humane cancere [6], [9], [10], [11], [12]. Men de funksjonelle rollene FOXM1 i eggstokkreft forblir stort sett uutforsket. Her viste vi at både mRNA og proteinnivåer FOXM1 var oppregulert i eggstokkreft vev og cellelinjer. FOXM1 overekspresjon var signifikant korrelert med høy grad av ovarietumorer, noe som indikerer at FOXM1 kan spille en onkogen rolle i eggstokkreft, spesielt i høy grad undertype. Vi utforsket derfor effekten av FOXM1 i celle migrasjon /invasjon som er en vanlig tumorigen scenario observert i aggressive høyverdig svulster
Begge transcriptionally aktive spleisevarianter av FOXM1.;
FOXM1B Hotell og
FOXM1C
er vist å være forhøyet i en rekke humane kreftformer. Spesielt FOXM1B ble demonstrert for å fremme angiogenese, tumorvekst av gliomceller og metastasering av HCC i fravær av Arf mens FOXM1C ble funnet å forbedre cellevekst og forankrings-uavhengig evne til cervikale kreftceller [6], [7], [15 ], [16]. Her håndheves uttrykk for enten FOXM1B eller FOXM1C kan fremme celleproliferasjon, migrasjon og invasjon i eggstokkreft celler. Selv om våre funn viste at FOXM1C helst økt celledeling mens FOXM1B fremmet celle migrasjon /invasjon, samtidig reduksjon av både FOXM1 isoformer bruker Thiostrepton ført til tilsvarende effekter i både celledeling samt celle migrasjon /invasjon. Effekten av FOXM1 ble ytterligere bekreftet ved å undersøke uttrykk for kjente merker i celle migrasjon /invasjon,
MMP-9 Hotell og
uPAR
, som er i tråd med metastatisk rolle FOXM1 rapportert i andre humane cancere [9], [16], [32], [33]. Enten FOXM1 direkte regulere disse markørene eller andre nedstrøms effektorer krever videre undersøkelser. Likevel, alle disse observasjonene tyder på at avvikende oppregulering av FOXM1 attributter de tumorigene egenskaper i høy grad eggstokkreft.
ERK er en av en viktig mediator i Raf /ERK /MAPK signaliserer akse opprettholde diverse mobil funksjon, inkludert celle proliferasjon, apoptose samt migrasjon [34]. Tidligere har ERK er vist å være konstitutivt aktiv i eggstokk-kreft og vår identifisering av høy ekspresjon grad av ekstra fordel i histologiske høy grad av ovarialcancer, og cellelinjer som indikerer dens avgjørende rolle i å forårsake aggressiv tumorigenesis [35]. Forbløffende nok fant vi at perk og FOXM1 nivåer ble tett korrelert under kreft progresjon, spesielt i høyverdig eggstokkreft. Vi har spekulert i at forhøyet FOXM1 ekspresjon er utløst av konstitutiv aktivering av ERK, noe som fører til økt celle motilitet i eggstokkreft. Som forventet, ble forholdet bekreftet ved å manipulere aktiviteten av ERK, noe som resulterte i parallelle endringer av FOXM1 uttrykk. I en annen studie er motivene likner ERK-target-sekvensen er funnet i FOXM1 og aktivering av ERK-aktivitet ble påvist å indusere transaktive evne FOXM1C [22]. Dermed undertrykke ERK aktivitet ved U0126 vil redusere FOXM1 fosforylering som til slutt fører til hemming av FOXM1 uttrykk ved å forstyrre sin egen positive feedback loop [36]. Selv om det ga oss en anelse om at den trans av FOXM1 avhengig fosforylering av ERK på post-transkripsjonsnivået, det er mangel på rapporter om de funksjonelle egenskapene til aktivert ERK /FOXM1 signaliserer akse i eggstokkreft. I sårheling studien, faktisk sterkt antyder reduksjonen i sårheling hastigheten på grunn av hemmet ERK-aktivitet og reduksjon av FOXM1 uttrykk ved U0126 behandling som FOXM er en av de store nedstrøms effektorer av ERK-signalering. Videre tiostrepton og U0126 trykkes celle migrering til en tilsvarende grad (40% sammenlignet med 50%). Til sammen tror vi at oppregulert ERK aktivitet og den påfølgende økningen av FOXM1 uttrykk bidra ytterligere induksjon av onkogene atferd, støtter at ERK /FOXM1 signaliserer akse letter cellemigrasjon i eggstokkreft.
Tidligere studier har vist lovende virkning av tiostrepton i å svekke de tumorigene atferd mediert av FOXM1 [26], [37], [38]. Gitt forskjellig sensitivitet av FOXM1 til nedregulering av tiostrepton behandling i cellelinjer med ulike status av p53, er det fristende å spekulere betydningen av p53 for innvirkning av tiostrepton. Basert på det faktum at tap av p53-funksjon er et vanlig arrangement i tumorer og FOXM1 er negativt regulert av p53, spekulert vi at miste p53-ekspresjon kan føre til at deregulering av FOXM1 og derved forårsake cellulær katastrofe og med kreft. Her, p53 slettet cellelinje SKOV3 viste ingen reaksjon fra FOXM1 til ulike doser av Thiostrepton samt MEK inhibitor, U0126, mens FOXM1 kan lett bli undertrykt på flere doser i OVCA433 og A2780cp som bærer villtype og muterte p53-gener hhv. Tidligere studier viste at tiostrepton kan utløse apoptotisk virkning på kreftceller ved å stabilisere p53-ekspresjon [39] og den opp-regulering av p53 ved høyere dosering kan videre hjelpe undertrykkelse av FOXM1. Interessant, tiostrepton eller U0126 hadde ingen innflytelse på SKOV3 som bærer p53-genet slettet, mens ektopisk ekspresjon av p53 avskaffet ekspresjonen av FOXM1 både RNA og proteinnivå, i samsvar med andre studier [28], [30]. Dette avdekker den nødvendige rollen til p53 i mediering av den hemmende effekten av tiostrepton på FOXM1 uttrykk. Bortsett fra å forringe cellemigrering /invasjon evne, en annen gruppe viser også at bruk av tiostrepton kan også øke apoptose og proliferativ arrest i humane kreftceller som ytterligere understreker den terapeutiske verdi av tiostrepton [26], [37], [38], [39], [40]. Samlet vår studie støtter at Thiostrepton funksjoner ved å undertrykke FOXM1 uttrykk via p53 til senere å lindre tumorigenitet og opp regulerende p53 å indusere celledød.
I konklusjonen, vår studie viste en sammenheng mellom ERK /FOXM1 signale akse og metastatisk oppførsel av eggstokkreft celler. Videre avdekket vi en kritisk rolle av p53 i mediering av virkningen av tiostrepton. Derfor både U0126 og Thiostrepton representerer lovende utgangspunkt for å etablere anti-kreft terapi i eggstokkreft gjennom undertrykkelse av FOXM1.
Materialer og metoder
Cellelinjer og cellekultur
Fem udødeliggjort menneskelige eggstokkreft overflate epitelceller ble brukt: HOSE10-2, HOSE11-12, HOSE17-1, HOSE20-3 og HOSE21-3 (fra professor George Tsao, The University of Hong Kong). Ni eggstokkreft cellelinjer ble brukt: A2780s A2780cp, OV2008, C13 (fra professor Benjamin Tsang, The University of Ottawa), OV420, OV429, OV433, OVCAR3 og SKOV3 (American Type Culture Collection, Rockville). Alle cellelinjer ble inkubert ved 37 ° C i 5% CO
2 enten i minimum essensielt medium eller Dulbeccos modifiserte Eagle medium (Gibco-BRL, Gaithersburg) med 10% føtalt bovint serum (Gibco) og 1% penicillin-streptomycin ( Gibco).
plasmider og transfeksjon
De lentiviral pCDH-FOXM1B og pCDH-FOXM1C plasmider ble generert ved subkloning FOXM1B og FOXM1C cDNA fra pcDNA3-FOXM1B og pcDNA3-FOXM1C plasmider inn pCDH-MSCV- MCS-EF1-GFP-Puro lentiviral plasmid (SBI, Mountain View, California) hhv. Den pRcCMV-p53 plasmid var fra professor Randy YC Poon (Seksjon for biokjemi og cellebiologi, Hong Kong University of Science and Technology, Hong Kong). LipofectAMINE ™ 2000 transfeksjon reagens (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, California) ble brukt for celle transfeksjon i henhold til produsentens instruksjoner. De pCDH-MSCV-MCS-EF1-GFP-Puro og pcDNA3.0 tomme vektorer ble brukt som negative kontroller. Å etablere FOXM1B og FOXM1C stabilt uttrykker celler, ble lentiviral infiserte celler velges av 2 mikrogram /ml puromycin (Sigma) i 2 uker og verifisert av western blot analyse.
Semi-kvantitativ (SQ-PCR) og kvantitativ ( QPCR) revers transkriptase-polymerase kjedereaksjon
Totalt RNA ble isolert ved hjelp av TRIzol (Invitrogen) i følge produsentens protokoll. Komplementær DNA ble syntetisert ved hjelp av revers transkripsjon reagenssett (Applied Biosystems, Foster City). Deretter cDNA ble brukt til å utføre PCR med bestemte gener primere av
FOXM1B plakater (forover, 5′-TTGCCCCCAAGGTGCTGCTA-3 «og omvendt, 5’GGAGATTGGGACGAATCCTC-3»),
FOXM1C product: ( fremover, 5′-CACCCATCACCAGCTTGTTT3 «og omvendt, 5′-GGAGATTGGGACGAATCCTC-3»),
MMP9 plakater (forover, 5’CATCGTCATCCAGTTTGGTG og omvendt, 5′-GCCTTGGAAGATGAATGGAA-3 «) og
uPAR
(forover, 5′-GCCTTACCGAGGTTGTGTGT-3 «og omvendt, 5′- GGCAGATTTTCAAGCTCCAG -3») under forutsetning av 94 ° C (5 minutter), etterfulgt av 30-35 sykluser på 95 ° C (30 sek), 57 ° C (30 sek) og 72 ° C (30 sek), og til slutt 72 ° C (10 min) og 4 ° C. Den relative mengden av genet ble normalisert mot GAPDH mRNA.
Q-PCR ble utført av TaqMan® genuttrykk Analyser og SYBR Grønn Gene Expression analysen. For å validere uttrykk for
FOXM1
isoformer, spesifikke primere rettet mot mot
FOXM1B Hotell og
FOXM1C
ble utformet i henhold til Kalin
et al product: [11] og innkjøpt fra Applied Biosystems. For å undersøke ekspresjon av p53, spesifikke TaqMan prober (Applied Biosystems) inkludert i PCR-blanding ble utsatt for PCR under forutsetning av 95 ° C i 2 minutter, 40 ° C sykluser ved 95 ° C i 15 sekunder og 60 ° C i 1 minutt. Relative mengden av RNA i hver prøve ble bestemt ved sammenlignende CT fremgangsmåte med 7500 System SDS software (versjon 1.3.1), fra hvilken ganger forskjell ble sammenlignet med den interne kontrollen
18S
og
TBP
og den relative fold forskjellen var så normalisert til kalibratoren. Den relative Ekspresjonsnivået av mål-genet ble tolket som den ganger forskjell til den endogene kontrollen.
Western blotting og immunhistokjemisk (IHC) analyserer
Total-protein ble fremstilt ved tilsetning av passende mengde 1x lysisbuffer til cellepelleten.
