Abstract
Mens farmakologisk hemming av Akt kinase har vært ansett som en lovende anti- kreftstrategi, de fleste av Akt hemmere som har blitt utviklet er enzymatisk hemmere som er rettet mot kinase aktive området av Akt. En annen nøkkel cellulær regulatoriske hendelser Akt aktivering er den translokasjon av Akt-kinase til cellemembranen fra cytoplasma, noe som oppnås ved hjelp av pleckstrin homologi (PH) domene av Akt. Men forbindelser spesielt i samspill med PH domenet Akt å hemme Akt aktivering er i dag begrenset. Her har vi identifisert en forbindelse, lancemaside A (LAN-A), som spesifikt bindes til den PH domenet av Akt kinase. Først vår massespektra analyse av cellulær Akt kinase isolert fra celler behandlet med LAN-A viste at LAN-A binder spesifikt til pH domenet av celle Akt kinase. For det andre, observerte vi at LAN-A hemmer translokasjon av Akt kinase til membranen og dermed Akt aktivering, som undersøkes av fosforylering av ulike nedstrøms mål av Akt som GSK3p, mTOR og dårlig. For det tredje, i et ko-dyrket celle inneholdende modell humane lunge epiteliale kreftceller (A549) og normale humane lungefibroblaster primære, LAN-A begrenser spesifikt veksten av A549-celler. LAN-A vises også anti-proliferative effekter på ulike menneskelige kreftcellelinjer. Til slutt, i A549-luciferase-mus transplantat modell, LAN-A effektivt inhiberte A549 cellevekst med lite tydelig cytotoksisitet. Faktisk, den terapeutiske indeks av LAN-A i denne musen modellen var 250, støtter at LAN-A er en potensiell leder sammensatt for PH domenemålretting som en trygg anti-kreft Akt hemmer
Citation: Joh. EH, Hollenbaugh JA, Kim B, Kim DH (2012) Pleckstrin homologi Domain of Akt kinase: En Proof of Principle for svært spesifikke og effektiv ikke-enzymatisk Anti-Cancer Target. PLoS ONE 7 (11): e50424. doi: 10,1371 /journal.pone.0050424
Redaktør: Jin Q. Cheng, H. Lee Moffitt Cancer Center Research Institute, USA
mottatt: 24 juli 2012; Akseptert: 23. oktober 2012; Publisert: 26.11.2012
Copyright: © 2012 Joh et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Denne studien ble støttet med tilskudd fra National Institutes of Health A1077401 (BK), National Institutes of Health stipend T32 DA07232 (JAH) og World Class Universitetet Program gjennom National Research Foundation of Korea finansiert av departementet for utdanning, vitenskap og teknologi ( R33-2008-000-10018-0). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:. Forfatterne ønsker å erklære at Baek Kim er en PLoS ONE Editorial styremedlem, men dette ikke endrer forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikk på deling av data og materialer.
Innledning
En langsiktig celle overlevelse fenotype er etablert av sensing av ulike cellulære hendelser , og de mekanismene som er involvert i anerkjennelse og levering av stress signaler er høyt konservert blant pattedyrceller. Den PI3K /Akt veien er en sentral regulerende nettverk som styrer de cellulære hendelsene vesentlig for transkripsjon, celleoverlevelse [1], vekst [2], differensiering [3], migrasjon [4], metabolisme [5], og angiogenese [6] . Den feilregulering av PI3K /Akt veien er ofte observert i mange menneske kreft, noe som åpner for langsiktig overlevelse og utvekst [7], [8], [9]. Dermed farmakologiske hemmere rettet mot denne pro-overlevelse veien har blitt grundig undersøkt som potensielle anti-kreft agenter [10]. Siden Akt er en sentral regulator som kontrollerer aktiviteten av mange nedstrøms mål gjennom dets kinaseaktivitet, har Akt inhibitorer vært fokus for flere studier [10], [11], [12]. Men de fleste av Akt hemmere som har blitt testet i hovedsak være rettet mot kinase aktive området eller ATP-bindingssetet av Akt [13], [14], [15], [16] og utviser potensielle uønskede off-target effekter for en rekke andre mobil kinaser.
Viktigere for Akt kinase for å bli aktivert, må proteinet for å migrere fra cytoplasma til cellemembranen hvor NH
2-terminale pleckstrin homologi (PH) domene av Akt kommuniserer med PI3K. Når på plasmamembranen, konstitutivt aktiv 3-phosphoinositide-avhengig kinase 1 (PDK1), en oppstrøms kinase, aktiverer Akt ved fosforylering ved Thr
308 etterfulgt av en ytterligere fosforylering ved Ser
473, noe som kan forekomme ved mTOR -rictor komplekset [17], proteinkinase Cβ [18], integrin-bundet kinase [19] og av autofosforylering [20]. PH-domene kan bli funnet i en rekke intracellulære signaleringsproteiner og er behov for å reise til ulike cellulære membran kamrene [21]. Dette domenet forenkler også dimer dannelse åpner for lipid bindende funksjon som gjenkjenner spesifikt fosforylerte phosphoinositides [22]. I løpet av PI3K /Akt aktivering, er PIP2 fosforylert til PIP3 av PI3K, og deretter den forhøyede PIP3 membranen konsentrasjon initierer aktivisering av PDK1 etterfulgt av membrantranslokasjon av Akt og aktivering av Akt-aktivitet [22].
Various kreft cellemodeller og celler som uttrykker onkogener, som oppviser en cytobeskyttende fenotype via aktivering av PI3K /Akt vei, har blitt brukt som skjermsystemer for potensielle Akt inhibitorer [23], [24], [25]. Vi har nylig etablert en unik cellebasert anti-PI3K /Akt inhibitor screening system [26], som anvender ekspresjonen av ikke-onkogent humant immunsviktvirus (HIV-1) Tat. I motsetning til andre virale onkogener så som E1A av humant papilomavirus [27], Skatte av human T-celle leukemivirus [28] og NS5A av hepatitt virus C [29], HIV-1 Tat ikke direkte aktiverer Akt pathway. Den ser ut til å ha negativ regulere PTEN, som er en fosfatase som negativt regulerer PI3K ved å senke PIP3 konsentrasjon ved cellemembranen [30]. På grunn av PTEN negativ regulering aktivitet, Tat uttrykk i en human microglial cellelinje (CHME5) overfører en forhøyet cellebeskyttelse fenotype under cytotoksiske LPS behandling [31]. Denne cytobeskyttende fenotypen til Tat-baserte CHME5 system ble nylig anvendt for screening og identifisert anti-PI3K /Akt forbindelser som avskaffet Tat-induserte fenotype cytobeskyttende [26]. Mer interessant er disse forbindelsene målrettet ulike trinn av PI3K /Akt vei, å validere PI3K /Akt pathway inhibitor screening systemets kapasitet [26].
Her har vi karakterisert lancemaside A (LAN-A), hvilken var en av flere forbindelser tidligere identifisert av Tat uttrykke CHME5 system fra biblioteker som havn pre-utvalgte ikke-giftige forbindelser [26]. I denne studien ble LAN-A undersøkt for sin anti-Akt handling mekanisme, selektiv anti-kreft effekt
in vitro
, og anti-kreft-effekt i en musemodell. Faktisk, LAN-A entydig binder til PH domenet av cellulær Akt kinase, hemmer translokasjon av Akt kinase, som er avgjørende for Akt-aktivering, og viser anti-sprednings /anti-kreft effekt i en musemodell med en stor terapeutisk indeks hvilken resultatene fra giftfri natur denne forbindelsen
Materialer og metoder
Kreft cellelinje kultur og måling av cytotoksisitet
A549 (human lungekarsinom;. KCLB No. 10185), KATO III (gastrisk karsinom, KCLB No. 30103), MCF-7, (brystkreft, KCLB No. 30022) ble kjøpt fra Korea cellelinje bank (Seoul, Korea) på 2010-11-25. Den A549-luc-c8 cellelinje ble kjøpt fra Sylinder Lifescience (Hopkinton, MA, USA) på 2011-04-20. Alle cellelinjer ble dyrket i RPMI 1640 medium supplert med 10% varme-inaktivert føtalt kalveserum, 2 mM L-glutamin og 1 mM natriumpyruvat i en fuktet 5% CO
2 atmosfære ved 37 ° C. Celler ble sådd ut i 96-brønners plater i en tetthet på 1 x 10
5-celler per brønn, 24 timer før tilsetning av forbindelsene. Forbindelser ble oppløst i 100% etanol og deretter tilsatt i de angitte konsentrasjoner. Etter 24 timer inkubasjon ble døde celler vurdert ved hjelp FACS cytometri (Accuri C6 flowcytometer, Accuri). Alle studiene ble utført i tre eksemplarer.
Co-dyrkning av primære og kreftceller
Å kultur forskjellige par av celletyper, mediet av den primære celletype, ikke svulsten cellelinje, var anvendes. For ko-dyrkning av humane lungefibroblaster og lunge epitelial tumorcellelinje A549-luc-c8, ble cellene dyrket i minimalt essensielt medium (Invitrogen) inneholdende 10% føtalt bovint serum. Bilder ble tatt ved 0, 6, 12 og 24 timer etter behandling ved hjelp av et fluorescens mikroskop (Zeiss).
immunoblotanalyse
cellesupernatanten ekstrakter fremstilt fra makrofager ble separert ved 10% SDS -siden og overført til polyvinylidendifluorid (PVDF-membraner). Membranene ble blokkert med 5% ikke-fett-tørkede melkeproteiner i 0,05% PBST, deretter probet med antistoffer. Etter vasking med PBST, ble proteiner påvist med HRP-konjugerte sekundære antistoffer for 50 min. Bånd ble visualisert med forsterket kjemiluminescens (ECL) reagens.
Analyse av Lancemaside A og Akt-binding ved hjelp av MS /MS
A549-luc-c8-celler ble dyrket i 6-brønns plater i RPMI 1640 medium med eller uten lancemaside A i 2 timer. Cellene ble lysert med 300 ul lyseringsbuffer per 100-mm kulturskål. Lysater (3 ml) ble tilsatt 9 ml NET buffer [50 mM Tris-HCl (pH 7,4), 150 mM NaCl, 5 mM EDTA og 0,05% NP-40] og inkubert over natten ved 4 ° C med 10 ul Akt eller β-aktin-antistoff (200 ug /ml). Å utfelle immunkomplekser, ble lysater ble inkubert med 50 ul protein A /G PLUS-Agarose (Santa Cruz, L.A., USA) i 1 time ved 4 ° C. Bead-bundne komplekser ble vasket tre ganger med kald NET buffer og denaturert i 5 min ved 100 ° C, sentrifugert og påvist ved anvendelse av MS /MS-system som tidligere beskrevet [32]. Elektrospray ionisering massespektrometri (ESI-MS) og tandem MS /MS-analyser ble utført på en LCQ DECA XP-MS (Thermo Finnigan, CA, USA) utstyrt med en elektrospray ione kilde. Alle ionefelle analyseparametere var optimalisert i henhold til produsentens instruksjoner. I masse eksperimenter, spray spenningen var 4,5 kV i positiv modus og 4 kV i negativ modus etter N
2 hylsteret gass-strømmen ved 50 arbitrære enheter. Den kapillære Temperaturen ble holdt ved 275 ° C. To mikroliter av prøvene ble injisert i kolonnen. Totalt ionekromatogrammer fra
m /z
150 til 2000 i ESI negativ modus ble oppnådd. For tandem massespektrometri, den maksimale ion injeksjon tid, aktiveringstid, og isolert ion bredde ble satt til 500 ms, 30 ms og 2,0 Th, henholdsvis. Kollisjonsenergien med helium ble satt til 30% av den radiofrekvens (5 V) påført den ionefelle analysatoren.
Anti-tumor-aktivitet i naken mus tumor xenograft modell
A549- luc-C8-celler ble høstet, suspendert på nytt i fosfat-bufret saltvann, og injisert subkutant i venstre ben (10
6 celler /ben) av 8 uker gamle hunn-nakne mus som tidligere rapportert [33]. Når tumorer nådde omtrent 50 mm
3, ble dyrene randomisert og oralt dosert med 5, 10 og 20 mg /kg /dag lancemaside A eller vehikkel (0,2 ml 10% Tween 80) 6 dager per uke. Hver gruppe besto av 9 mus. Lancemaside A ble suspendert i 10% Tween 80. tumorstørrelsene ble målt hver 3-4 dager etter å ha nådd 50 mm
3. Til slutt, vi injisert intraperitonealt luciferin-reagenset (150 mg /kg, Sylinder Lifescience) etter den siste administrering av lancemaside A og målt tumorstørrelser med
in vivo
luminescens avbildning.
In vivo
luminescens avbildning ble utført ved hjelp av Maestro I (MA, USA Woburn,) Vivo multispektrale Imaging System. Data ble kvantifisert med Maestro programvare (versjon 2.10.0, CRi Inc.) ved hjelp av absolutte fotontelling.
Menneskelige A549 celler transfektert med PH-GFP eller GFP vektorer
A549-luc- c8-celler ble transfektert med PH-GFP eller GFP-vektoren og ble dyrket i 6-brønns plater i RPMI 1640 medium med eller uten lancemaside A (1 uM) for 100 min. Cellene ble lysert med 300 ul lyseringsbuffer per brønn. Lysater ble supplert med 5 ml NET buffer [50 mM Tris-HCl (pH 7,4), 150 mM NaCl, 5 mM EDTA og 0,05% NP-40] og inkubert over natten ved 4 ° C med 10 ul av GFP-antistoff (200 ug /ml). Å utfelle immunkomplekser, ble lysater ble inkubert med 50 ul protein A /G PLUS-Agarose (Santa Cruz, L.A., USA) i 1 time ved 4 ° C. Bead-bundne komplekser ble vasket tre ganger med kald NET buffer og denaturert i 10 minutter ved 100 ° C før den ble sentrifugert for å fjerne rusk. Supernatanter ble inndampet til tørrhet og resuspendert i 50 ul MeOH.
Resultatene
Vi tidligere hadde identifisert LAN-A som et anti-PI3K /Akt pathway inhibitor ved hjelp av et HIV-Tat-uttrykkende cellelinje CHME5 [26]. Vi for det første undersøkte evnen til LAN-A for å hemme denne veien i flere forskjellige tumorceller. Som vist i figur 1A, økende konsentrasjoner av LAN-A redusert celleoverlevelse i A549 (adenokarsinom epitelcelle), KATO III (gastrisk karsinom celle) og MCF-7 (bryst carcinoma cell)-celler på en doseavhengig måte, noe som fører til signifikante forskjeller sammenlignet med kontroll (ubehandlede) celler med så lite som 2 mikrometer av narkotika. Ved 20 uM LAN-A, den høyeste konsentrasjonen som brukes, er større enn 60% reduksjon i levedyktighet detektert for alle tre cellelinjer. Videre bekreftet western blot analyse reduksjonen i pakt nivåene for de tre cellelinjer (figur S1). De A549-Luc-c8 celler ble også brukt i denne studien, og vi bekreftet at LAN-A behandling også forårsaket en tilsvarende reduksjon i celle levedyktighet (figur 1B). A549 celler har en rund morfologi som vist i figur 1B bunnplater, noe som er en viktig faktor når undersøke de ko-kultur-eksperimenter (nedenfor).
(A) A549, KATO III og MCF-7-celler ble behandlet i 24 timer i fravær eller nærvær av forskjellige konsentrasjoner av LAN-A. Etter behandling ble cellene oppsamlet og levende celler ble bestemt ved FACS-analyse. (B) A549-luc-C8-celler ble behandlet med 5 og 10 uM LAN-A i 24 timer. Bildene viser mindre konfluent monolag av celler med LAN-A behandling. Cellelevedyktigheten ble bestemt og relative verdier plottet i forhold til den for kontrollcellene (100%). ANOVA-analyse ble utført på datasett, og statistisk signifikante forskjeller fra kontrollgruppen er markert med stjerne (* =
p
0,05).
For ytterligere å validere LAN-A som et PI3K /Akt pathway inhibitor i A549 celler, ble western blot analyse utført for fosforylering status av ulike nedstrøms mål: PDK1, Akt, PTEN, GSK3p, IKK-a, mTOR og dårlige proteiner. Som vist på figur 2A-E (og fig S2), fosforylering av Akt og nedstrøms mål for Akt-kinase: p-GSK3P, p-mTOR, p-BAD og p-IKK-α ble signifikant redusert på en doseavhengig måte med LAN -En behandling. Imidlertid LAN-A behandling førte ikke til reduksjon av cellulære nivåer av PTEN (figur 2F), p-PDK1 (figur 2G) eller PI3K (figur 2 H). Videre LAN-A redusert PI3K aktivitet i A549 celler (Figur S3) og hemmet Akt trafficking til plasmamembranen (figur S4). Disse resultatene er i samsvar med våre publiserte funn [26] at LAN-A er et PI3K /Akt pathway inhibitor.
(A) A549 celler ble ubehandlet eller behandlet med 5, 10 eller 20 mikrometer LAN-A for 24 timer. Western blot-analyse ble utført på cellelysatene (Supplementary figur 2), og tyder på en reduksjon i fosforylert Akt (Ser
473). (B-E) Analyse av Akt nedstrøms mål vises. Fosforyleringen nivåer for GSK3p, IKK-α, mTOR og BAD ble undersøkt og er redusert i LAN-et behandlet grupper. (F) Cellular PTEN holdt seg konstant med LAN-A behandling. (G) Phospho-PDK1 nivå forble uendret med LAN-A behandling. (H) PI3K nivå forble uendret med LAN-A behandling. Datasettene ble gjort i duplikat. ANOVA-analyse ble utført på datasettene med * =
p
0,05, ** =
p
0,01 og *** =
p
0,001 .
Neste, vi testet om LAN-A cytotoksiske effekten var spesifikk for tumorceller. For denne testen, vi ko-dyrket 1) MRC-5, et føtalt primære humane lunge fibroblast [34], og 2) A549-luc-C8, adenokarsinom human alveolar basale epitelceller transdusert til å uttrykke luciferase [35], under forskjellige konsentrasjoner av LAN-A for 12 timer (figur 3A, øverst). MRC-5 celler forble levedyktig over doseområdet LAN-A behandling (figur 3A; bunnen graf), mens A549-luc-c8 celler vist betydelig død ved 10 og 20 mikrometer. En kinetisk analyse ved bruk av 10 uM LAN-A behandling ved 0, 6, 12 og 24 timer ble også utført (figur 3B, øverst). Igjen, A549-luc-c8-celler var signifikant mer utsatt for celledød sammenlignet med MRC-5-celler (figur 3B, bunn graf). Selv etter 24 timer av LAN-A behandling, MRC-5 celler forble levedyktig, mens A549-luc-c8 celleviabilitet fortsatte å falle. Til sammen tyder disse data på at LAN-A viser et spesifikt anti-kreft-effekt i den menneskelige lunge normale og kreftcelle ko-kulturmodell.
(A) Representative bilder for de ulike behandlingsgrupper ble tatt 12 timer etter behandling. (B) fra tre uavhengige eksperimenter ble manuelt telles for levende /døde celler for de ulike behandlingsgruppene. Data ble plottet, og viser prosentandelen av levende celler. Student T testen ble utført på datasett for å bestemme signifikante forskjeller (* =
p
0,05). (C-D) Co-dyrkede celler ble eksponert for 10 uM LAN-A og deretter overvåket i celledød på ulike tidspunkter etter behandling. Celledød ble bestemt som beskrevet ovenfor. Dataene er hentet fra tre uavhengige eksperimenter.
Deretter undersøkte vi virkningen mekanismen av LAN-A ansette en rekke massespektrene teknologier. For dette A549 cellene ble pre-inkubert med LAN-A før lysering og immunutfelling (IP) av Akt. Pull-downs ble analysert ved hjelp av masse spektralanalyse. Figur 4A viser den ESI-MS-analyse av LAN-A (standard). Den sammensatte struktur er vist, og en sporprofil med LAN-A ved MW 1190 er gitt. En IP-Akt prøve for LAN-A behandlet A549 celler ble analysert (figur 4C), og viste en topp for LAN-A. Viktigere, kontrollprøvene, ingen LAN-A behandling av A549 celler (figur 4B) og β-aktin IP med LAN-A behandling (figur 4D), viste ikke topper for LAN-A interaksjon. Neste, for ytterligere å bekrefte at LAN-A interaksjon med Akt ble tandem MS /MS analyse gjort. Vi har tidligere utviklet en følsom HPLC-MS /MS-analyse for LAN-A (MW 1190) og dets metabolske derivater, lancemaside X (MW 648) og echinocystic syre (MW 472) [32]. Standarden spor profilen til LAN-A bare er vist i figur 4E, mens IP Akt prøven viser klart de to fragmentene – MW 648 MW og 472 (figur 4F). Disse data viser klart at LAN-A fysisk samvirker med Akt i cellen.
(A), elektrospray ionisering masse-spektrometri (ESI-MS) for LAN-A standard vist. LAN-A molekylær er vist å ligge på MW 1190. ESI-MS analyse av IP Akt prøver fra ubehandlet (B) LAN-A behandlet (C) A549 celler er vist. (D) ESI-MS-analyse av IP β-aktin fra LAN-A-behandlede celler er vist. (E) Tandem MS /MS analyse av LAN-A viser de to tidligere identifiserte fragmenter Lancemaside X (MW 648) og echinocystic syre (MW 472) for LAN-A [32]. (F) Tandem MS /MS-analyse for IP Akt prøve fra LAN-A behandlede celler.
Vi har tidligere beskrevet at LAN-A hemmer trans av Akt fra cytosol til plasma membran ([26 ]; Figur S4). Derfor postulerte vi at LAN-A samhandler direkte med PH domenet Akt. For å teste dette, ble PH domain-GFP fusjon og GFP vektorer transfektert inn i A549 celler, etterfulgt av IP av GFP. Prøvene ble så behandlet for og analysert ved hjelp av HPLC-MS /MS [32]. IP-GFP prøven (figur 5A) som produseres mange topper, men ingen var spesifikk for LAN-A (figur 5B; standard only). Men MS /MS analyse av IP PH-GFP prøve produserte riktig metabolitt derivater topper (MW 648 og MW 472) for LAN-A (se også figur 4E og F). Derfor er disse massespektra eller data understøtter en modell hvor LAN-A direkte interagerer med PH domene av Akt, som begrenser Akt migrering og senere inhiberer Akt-aktivering.
GFP og PH domene-GFP vektorene ble transfektert inn i A549- luc-C8-celler og celler ble behandlet med 100 uM LAN-A i 1 time. IP mot GFP ble utført og prøver ble analysert ved ESI-MS. (A) IP GFP prøven viste ingen fremtredende topp for LAN-A, (B), mens IP PH domene-GFP prøve hadde den spesifikke topp for LAN-A. (C) For å ytterligere bekrefte dette ble LAN-A, tandem MS /MS-analyse av IP PH domene-GFP prøve viste to fragmenter for LAN-A (se også figur 4E og F).
til slutt testet vi effekten av LAN-A på A549-luc-c8 vekst i en naken mus modell. For denne testen, ble A549-luc-c8-celler injisert inn i det venstre benet på nakne mus for å etablere tumorer. Når tumoren nådde 50 mm
3, ble mus randomisert og behandlet oralt med 10 og 20 mg /kg /dag lancemaside A eller vehikkel (10% Tween 80) 6 dager per uke. LAN-A har en ED
50 = 4,09 mg /kg og LD
50 = 1 g /kg. Derfor er den terapeutiske indeks 250 (data ikke vist). Tumorer ble målt fra dagene 10 til 45. LAN-A behandling tumor redusert veksttakt som vist ved reduserte tumorvolum sammenlignet med kontrollgruppen (figur 6A). På dag 45 ble mus IP injisert med luciferin reagent for
in vivo
imaging (Figur 6B).
In vivo
luminescens er større for kontrollgruppen sammenlignet med enten 10 eller 20 mg /kg LAN-A-grupper. De relative intensitetene av luminescens er vist (
n
= 5). Musene ble avlivet og tumorene fjernet. Relative volumer ble bestemt og ble plottet (
n
= 9) for tumormasse (figur 6C). Svulster ble deretter farget med anti-Pakt og DAPI (figur S5) og vises en LAN-en konsentrasjonsavhengig reduksjon av Pakt i svulstvev. Samlet konkluderer vi med at LAN-A har en anti-tumor effekt
in vivo
.
(A) Tumor volum ble målt fra dagene 10-45 i hårløse mus behandlet med kontroll (con) og 10 eller 20 mg /kg /dag LAN-A (9 mus /gruppe). (B) På dag 45 ble musene injisert med luciferin reagent for luminescens levende avbildning. Relative intensiteter for 5 mus /gruppe er vist, og den relative intensitet ble indikert sammenlignet med kontrollen (kontroll = 1). (C) Mus ble avlivet og tumorene fjernet. Svulster ble målt ved Maestro
In Vivo
multispektrale Imaging System og relative volum plottet. ble utført ANOVA analyse på datasett, og statistisk signifikante forskjeller fra kontrollgruppen er markert med stjerne (* =
p
0,05)
Diskusjoner
Tidligere screenet vi potensielle anti-kreft-midler, som viste minimalt cytotoksisitet og høye naturlige abundances, ved å anvende den sterke cytobeskyttende fenotype indusert ved ekspresjon av HIV-1 Tat-protein [26], som ble observert i både primære humane makrofager og en human mikroglia cellelinje [30], [31]. Blant de siktede forbindelser, behandling med LAN-A avskaffet Tat-indusert cytoprotective fenotype av CHME5 celler etter LPS /CHX behandling, mens LAN-A alene ikke overtale noen celledød i CHME5 kontrollcellene ikke uttrykker Tat [26]. LAN-A hører til den kjemiske familie kalt saponiner, som er kjent for å vise anti-inflammatorisk og anti-tumor egenskaper [33], [36], [37], [38]. LAN-A har vist seg å potente hemmere av kolitt via TLR-bundet NF-kB-aktivering i mus uten påvisbare cytotoksisitet [39], [40].
I denne studien ytterligere å karakterisere anti-kreft effekt av LAN-A. Ko-kultur forsøk under anvendelse av A549 og MRC-5-celler viser at LAN-A spesifikt inhiberer tumorcellelinjen og ikke primære celler. Dette var en veldig spennende resultat, og foreslo at LAN-A hadde en kreftcelle spesifikk effekt. Vi viser at behandling av celler med LAN-A fører til en reduksjon i fosforylering av Akt, men p-PDK1, som er nødvendig for Thr
308 fosforylering, og total PDK1 nivåer ble ikke påvirket av LAN-A-behandling. Videre nedstrøms mål inkludert p-GSK3p, p-mTOR, p-BAD og p-IKK-α ble redusert, mens PTEN og PI3K nivåer forble uendret (figur 2). Kollektivt disse dataene støtter våre tidligere funn om at LAN-A hemmer Akt aktivering [26].
Flere ulike mekanismer for Akt inhibisjon er rapportert. Først stoffer som Wortmannin, LY294002, PWT-458 [41] og PX-866 [42], [43], SF-1126 [44], IC87114 og TGX-115 [45] målrette oppstrøms PI3K effektor, hemme generasjon av fosfatidylinositol-3,4,5 trisphosphate, som aktiverer PDK1 fører til Akt fosforylering og aktivering. Andre legemidler har dual målretting for PI3K og mTORC2, inkludert NVP-BEZ235 [46]. Flere legemidler har blitt utviklet som mål PDK1 aktivitet. I motsetning til PI3K, som har flere isoformer, har PDK1 bare en enkelt isoform hos mennesker, noe som gjør det til et attraktivt mål for inhibering. UCN-01 er et slikt medikament under utvikling [47]. Den andre Akt fosforylering ved Ser
473 katalyseres av mTORC2 [48] og kan bli inhibert av rapamycin, temsirolimus, everolimus og deforolimus [49].
Akt har tre ulike isoformer og flere forskjellige grupper av Akt -inhibitorer har blitt utviklet. En gruppe av inhibitorer: GDC-0068 (Genetech [50]) og Akt Inhibitor IV (Millipore) rettet mot ATP aktive området av Akt [51]. En andre gruppe av inhibitorer målrette PH domene, som fører til avbrudd av membranen målretting [52], [53]. Akt-I-1/2 er syntetiske reversible allosterisk hemmer, som målrette PH domene beholder den i en inaktiv tilstand [54]. Perifosine er en annen PH domenemålretting narkotika og hemmer Akt, mTORC1 og mTORC2 [55].
For å bestemme spesifisiteten av LAN-A, vi tidligere utviklet en spesifikk HPLC-MS /MS-analyse for LAN-A [32 ]. Ved hjelp av denne teknologien, fant vi ut at LAN-A samhandler direkte med Akt gjennom PH domene (Figur 5). Vi har tidligere undersøkt oral dosering av mus med LAN-A og fant at tarmfloraen omdanner LAN-A i lancemaside X og deretter inn i echinocystic syre, som kan bli absorbert inn i blod [32]. Vi kan postulere fra våre data at echinocystic syre kan være den minste strukturen metabolitt fra LAN-A er nødvendig for PH domene bindende og Akt kinase hemming. Både lancemaside X og echinocystic syre vil bli undersøkt for sin terapeutiske effekt i fremtiden. Videre er i overensstemmelse med resultatene av våre Jo
in vivo
mus data
et al.
[53], som viser at målretting PH-domenet av Akt-kinase er meget effektiv ved å bremse tumorvekst.
det har vært omfattende etterforskning for å oppdage hemmere av PI3K /Akt /mTORC2 vei [56], [57]. Mange nye legemidler har for å håndtere toksisitet samtidig som det gir terapeutisk effekt. LAN-A gir lav toksisitet og inhibering av tumorvekst in vivo. Kollektivt, validerer vår studie av masse spektralanalyse at LAN-A er rettet mot PH domenet av Akt og gir en gyldig tilnærming for videre forskning på dette anti-kreft narkotika.
Hjelpemiddel Informasjon
Figur S1.
Western blot-analyse av A549, KATO III og MCF-7 celler. (A) Vist er representative vestlige blotter sondering for Pakt og total Akt med og uten 10 mm LAN-A. (B) Data fra to uavhengige eksperimenter ble fremstilt grafisk. ANOVA-analyse ble brukt for å bestemme signifikante forskjeller og er merket med stjerne (*** =
p
0,001)
doi:. 10,1371 /journal.pone.0050424.s001 plakater (TIF)
Figur S2.
Western blot-analyse. Dette er en sammensatt for en eller to western blot analyse brukes til å generere data for Figur 2.
doi: 10,1371 /journal.pone.0050424.s002 plakater (TIF)
Figur S3.
PIP3 analysen. A549-celler ble forbehandlet med den lancemaside A (Lan, 20 uM) eller Wortmannin (W, 0,1 mM) i 20 min. Deretter ble cellene behandlet med LPS for en ytterligere 60 min. Lysater ble fremstilt ved anvendelse av et kompartment proteinekstraksjon kit (Millipore, Bedford, MA, USA) fra et likt antall av de behandlede celler. Membran ekstrakt Lysatene ble analysert ved western dot blot analyse (Echelon, San Jose, CA, USA) og visualisert med anti-PIP3 antistoff
doi:. 10,1371 /journal.pone.0050424.s003 plakater (TIF)
Figur S4.
analyse av Akt membran translokasjon. Vi har uttrykt et GFP-protein fusjonert til PH-domenet av Akt, som er kjent for membranen migrasjon, i A549-luc-C8-celler. Når cellene ble transfektert med et plasmid som uttrykker den PH-Akt-GFP-protein, ble det observert dette fusjonsprotein i hele celler, men hovedsakelig lokalisert på plasmamembranen. LAN-A behandling viser GFP signal har beveget seg bort fra plasmamembranen. Bright feltet (BF) bilder er på venstre kolonne. Akt plasma membran lokalisering ble visualisert ved bevegelse av Akt-PH-EGFP bruke en fluorescens mikroskop (Zeiss)
doi:. 10,1371 /journal.pone.0050424.s004 plakater (TIF)
Figur S5.
Immunohistokjemi av Pakt i svulsten. Immunolocalization av pakt ble analysert ved hjelp av en to-trinns fargeprosedyre som består av sekvensiell inkubasjon med primære og sekundære antistoffer og med DAPI. Bilder ble tatt ved hjelp av en fluorescens mikroskop (Zeiss)
doi:. 10,1371 /journal.pone.0050424.s005 plakater (TIF)
