Abstract
Bakgrunn
Cell migrasjon er en svært komplisert prosess, regulert av flere gener , signalveier og eksterne stimuli. For å oppdage gener eller farmakologiske midler som kan modulere den vandrende aktiviteten av celler, screening strategier som muliggjør overvåking av diverse trekkende parametre i et stort antall av prøver er nødvendig.
Metodologi
I den foreliggende studie, beskriver vi å utvikle en kvantitativ, high-throughput cellemigrasjon assay basert på en modifisert phagokinetic spor (PKT) prosedyre, og bruke det for å identifisere nye pro-trekkende gener i en kreft-relaterte genbibliotek. I korte trekk, blir cellene sådd ut på fibronektin-belagte 96-brønners plater, dekket med et monolag av karboksylerte latekskuler. Bevegelige celler fjerne perlene, som ligger langs sine trekkveier, danner spor som er visualisert ved hjelp av en automatisert, overføres lys screening mikroskop. Sporene er så segmentert og preget av multi-parametrisk, morfometrisk analyse, å løse en rekke morfologiske og kinetiske egenskaper.
Konklusjoner
I denne skjermen vi identifisert 4 nye gener som stammer fra brystkreft relatert cDNA-bibliotek, som over-ekspresjon induserer vesentlig forandring i migrering av de stasjonære MCF7 celler. Denne tilnærmingen kan fungere for high throughput screening for nye måter å modulere cellulær migrasjon i patologiske tilstander som tumormetastase og invasjon
Citation. Naffar-Abu-Amara S, Shay T, Galun M, Cohen N, Isakoff SJ, Kam Z, et al. (2008) identifisering av nye Pro-Trekk, Cancer knyttet gener Bruke Kvantitativ, mikroskopi-basert screening. PLoS ONE 3 (1): e1457. doi: 10,1371 /journal.pone.0001457
Academic Redaktør: Neil Hotchin, University of Birmingham, Storbritannia
mottatt: 21 oktober 2007; Godkjent: 18 desember 2007; Publisert: 23 januar 2008
Copyright: © 2008 Naffar-Abu-Amara et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Denne studien ble støttet med tilskudd fra Israel Science Foundation og en NIGMS stipend for Cell Migration Consortium (NIH Grant U54GM64346), og ved Kahn fond for systembiologi ved Weizmann Institute
Konkurrerende interesser:. forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer.
Innledning
Cell migrasjon spiller en avgjørende rolle i en rekke fysiologiske prosesser, inkludert embryoutvikling, inflammatoriske responser, sårheling, og angiogenese, samt i patologiske tilstander slike som tumorinvasjon og metastase [1], [2]. For å utforske mekanismene bak reguleringen av cellevandring, har en rekke kvalitative og kvantitative tilnærminger blitt utviklet. Disse inkluderer 2- og 3-dimensjonale time-lapse filmer, sporing migrering av dyrkede eller vev-embedded celler [3], [4], sår-nedleggelse analyser [5] – [7], matrix-permeationsratene analyser [8] [9] og «opptak» av cellenes migrering «historie», basert på analyser som PKT formasjon [10]. Den sistnevnte analysen er mye brukt for å studere trekk aktivitetene til forskjellige celletyper [3], [11], matrisen ombygging [12], [13] og forstyrrelse av cellemigrasjon ved kjemiske eller genetiske modulatorer [14] – [19]. Slike studier er av særlig relevans for kreftcelle motilitet, som antas å reflektere den invasive eller metastatisk potensial av disse cellene in vivo [14], [20] – [23]. Dermed identifikasjon av kjemikalier som endrer cellemigrasjon, eller spesifikke gener som forstyrrelse påvirker cellemigrasjon kan potensielt brukes til modulering av metastatisk celle migrasjon.
Vårt mål i denne studien var å utvikle en PKT basert tilnærming for sporing av cellemigrering, som er reproduserbar, kompatibel med høy gjennomstrømming mikroskopi, og gir kvantitativ informasjon, morfologiske og dynamisk, på trekkprosessen. Vi viser her at mens PKT registrerer integrert historie trekkfugl aktivitet på ett tidspunkt, den kvantitative bildebehandlingsprogrammer, gjør det mulig for beregning av både «statiske» parametre som spor lengde og areal, og «dynamiske» parametere som migrasjonsrater , utholdenhet, og lamellær aktivitet.
høy gjennomstrømming migrasjon analysen beskrevet her, og bildebehandling programvare utviklet for å måle ulike funksjoner i den vandrende prosessen, gir en rask, pålitelig og kvantitativ tilnærming for å vurdere celle migrasjon i diverse celletyper, kultur under varierende forhold, og utsettes for en rekke kjemiske eller genetiske forstyrrelser.
Resultater
Utvikling av en perle-baserte high-throughput PKT analysen
Kritisk til utviklingen av dette PKT analysen var valget av riktige perler, med optimale dimensjoner og kjemiske egenskaper (Tabell S1). Kulene som ble funnet mest egnet for Pkt analyser anvendt på en rekke forskjellige celletyper ble karboksylat-modifisert lateks (CML) hvite polystyrenkuler med en gjennomsnittlig diameter på 340 nm, og en negativ ladning innhold på 184,7 μEq /g. Disse perlene danner en homogen og synlig mono; deres festing til underlaget er fast nok til å hindre spontan avløsning, men likevel utsatt for fjernelse av migrerende celler
overflatekjemi av perlene ble funnet å ha en sterk virkning på PKT analysen:. perler med et aldehyd -modifisert overflaten festet fast til underlaget, og kan ikke fjernes ved å migrere celler. Perler med en sulfatert overflate hadde en tendens til å aggregere, noe som ga en ikke-ensartet monolag. Karboksylerte perler, med eller uten ytterligere sulfatgrupper, hadde en tendens til å danne ganske homogene suspensjoner etter sentrifugering. Overflaten tettheten av karboksylatgrupper også påvirket spor formasjon: en lav ladningstetthet (23,9 μEq /g) forårsaket vulsten til å interagere sterkt med overflaten, slik at mange celletyper som ikke klarte å effektivt fjerne kulene som de overføres. Perler med karboksylatgrupper av mellomliggende tetthet (91,4 μEq /g) ble funnet å være optimalt for noen adherente celler (f.eks H1299, REF52), men ikke for celler med svakere sammenvoksninger (f.eks MCF7, B16-F10). Perler inneholdende karboksylgrupper med en tetthet på 160-185 μEq /g ble funnet å være optimalt for analyser anvendt på et bredt spekter av celletyper.
Videre er diameteren av kulene hadde en vesentlig effekt på sikten av sporene og på stabiliteten av monolaget. Således små perler ( 300 nm i diameter) kan neppe bli visualisert, mens store perler (~1,000 nm i diameter) hadde en tendens til å løsne fra overflaten og deretter spontant feste, noe som resulterer i dårlig definerte spor. Den optimale perle diameter for automatiserte Pkt analyser ble funnet å være ca 400 nm.
Utvikling av automatiserte mikros system
Pkt analysene ble registrert ved hjelp av en celle-screening mikroskop [24] utstyrt med en laser autofokus enhet [25]. Mikroskopet driftsprogram og bildeinnlastingen programvaren ble skrevet som en søknad innen UCSF PRIISM miljø (https://msg.ucsf.edu/ive). For denne søknaden, ble bildene tatt med et 10 × /0,4 objektiv under overført lys belysning. Et lys diffuser ble satt inn over multi-brønn plate, for å minimere ikke-homogen belysning og unngå skygger ofte forårsaket av trange brønnveggene
Den dedikerte anskaffelsesprogram styrer belysning.; autofokus og bildetakings trinnene for alle utvalgte områder innenfor hver brønn, og for alle valgte brønner i platen, mens optimalisere eksperimentelle detaljer (f.eks brønn nummer, posisjon på banen, eksponeringstid, objektiv, optisk innstilling, og lignende). For å spille inn et maksimalt antall av komplette celle spor, ble bilder av tilstøtende felt smeltet inn i en sømløs montasje, der spor strekker seg over mer enn ett bilde er slått sammen med høy presisjon (figur S1).
Kvantifisering av trekkfugl parametre, basert på PKT morfometri
for å identifisere individuelle spor, ble bildene utsatt for «flate», og dermed kompensere for ikke-homogen belysning, glatting og kontrastforbedring. Den resulterende intensiteten Histogrammet ga en hovedtopp svarende til uaffisert bakgrunnen (figur 1c, svart asterisk); en høy intensitetstopp som svarer til de kule-fri spor (figur 1c, blå asterisk); og lav intensitet piksler som tilsvarer perle belastede celler (Figur 1c, rød stjerne). Ved å anvende to binære terskler, celler (figur 1d), og spor (figur 1E) kan skilles fra hverandre. Debris, riper, spor med ingen eller flere enn én celle, kryssende spor og spor som strekker seg utover grensen av montasjen, ble identifisert og forkastet (Figur 1f, segmenter som er skissert i blått). For å få fin definisjon av spor grenser, som ble litt uskarpe ved glatting trinn (figur 1 g), spore grensene ble omregnet fra de originale bildene, ved hjelp av Multiscale segmentering analyse [26] (figur 1 t).
(a ) en montasje av 4 × 4-felt (1024 × 1024 piksler), hver ervervet ved hjelp av en 10 × /0,4 objektiv. (B) Et enkelt felt (512 x 512 piksler, binned 2 x 2) (c) Histogram av pikselintensiteten: den hovedtopp (*) tilsvarer bakgrunnselementer; den mindre topp av lys intensitet (*) tilsvarer spore piksler; og de mørke piksler representerer cellelegemer og rusk (*). De røde vertikale linjene markerer de to tersklene skille spor piksler fra cellene og bakgrunnen. (D, e) Binær bilder, etter bruk av terskler. Piksler med intensiteter under nedre terskel (celler og rusk) er farget hvit i (d), og piksler med intensiteter over høyere terskel (spor) er farget hvit i (e). (F) Alle tilkoblede komponentene i hele montasjen er skissert: Spor er skissert i rødt. Objekter enten for små eller for store i området som skal inkluderes i bildet analyser, eller som ligger på grensen til montage, er skissert i blått. (G) Utvidelse av en segmentert feltet etter binær segmentering. (H) Den samme område er vist i (g) etter multi-skala segmentering, og med den fine omriss av sporet og spor aksene. Skala barer: 250 mikrometer
Etter segmentering skritt, vi kvantifisert de ulike morfometriske parametere for hver celletype.. Sporet parametre som automatisk ble målt inkluderte spor areal, omkrets, hovedakse, lille aksen, aksial ratio og soliditet. Sporbanelengden og ende-til-ende-lengde ble målt manuelt. Sporet parametere beregnet fra disse morfometriske parametrene inkluderer utholdenhet, effektiv hastighet, gjennomsnittlig migrasjon hastighet, lamellær aktivitet, og generelle retningen. Disse morfologiske og «dynamiske» parametere er definert i Tabell S2, og presentert grafisk i figur 2.
automatisk beregning av de forskjellige morfometriske parametre som er benyttet i denne undersøkelsen, er vist ved hjelp av pk dannet av H1299, B16-F10 og MCF7 celler. De beregnede parametrene inkluderer: Total sporområde (mikrometer
2), avgrenset i rødt; net spor området etter celleområdet trekkes; små og store akser (mikrometer) av den optimale ellipse; forholdet mellom aksene; migrasjon hastighet [lengden på skjelett og grener (grønn + blå) /flyttingen], effektiv hastighet [ende-til-ende-avstand (farget rødt) /flyttingen]; spore omkretsen; ruhet [Perimeter
2 /(4π * Area)] og Soliditet [sporområde (blå) /område av konvekse skroget (rød + blå) omslutter sporet]. De angitte i figuren verdier refererer til enkeltsporet.
Spesielt, selv tilsynelatende lignende parametre (f.eks «migrasjon hastighet» og «effektiv hastighet») kan variere sterkt. For eksempel, B16-F10 celle, vist i figur 2, viste nesten den samme migreringshastighet (62,4 um /time) som H1299 celle (67,26 um /time), mens den sistnevnte celletype vises en mye høyere effektiv hastighet (57,26 um /time, sammenlignet med 20,4 um /time i B16-F10 celle), noe som indikerer en mer vedvarende migrering enn den førstnevnte. For å vurdere «lateral» lamellær aktivitet, noe som påvirker bredden og grovheten av spor grenser, målte vi sporet omkrets, og beregnede ruhet og soliditet parametere. Denne analysen viste at mens utkant sporene dannet av H1299 og B16-F10 celler var tilnærmet lik den ruhet parameter var betydelig høyere i B16-F10 celle (5,2) enn i H1299 celle (3.2), som indikerer høyere lamellære aktivitet i melanom celler. Dette funnet ble direkte bekreftet av time-lapse filmer (Figur 3 og Filmer S1 og S2).
Ulike tidspunkter vises hvor lateral lamellær aktivitet av en H1299 (øvre panel) eller B16-F10 (nedre panel) celler etterlater merker på formen og råhet av sporet grensen. (Full-lengde filmer er tilgjengelig på nettet som Movie S1 og Movie S2, henholdsvis.)
Bruk av PKT morfometri for måling celle-typespesifikke og narkotikainduserte virkninger på trekkende parametre
a) forskjellige celletyper produsere PKT med forskjellige egenskaper.
PKT analysen beskrevet heri ble anvendt for å teste vandringsadferd av en rekke forskjellige cellelinjer. Disse inkluderer: B16-F10 og B16-F1 melanomceller; MDA-MB-231 og MCF7 brystkreft celler, REF52, SV80 og NIH3T3 fibroblast linjer; H1299 lungekarsinom celler, og flere prostata karsinom linjer (DU145, PC3 og CL1). Fire av disse cellelinjene (MDA-MB-231, MCF7, H1299 og B16-F10) er benyttet for illustrasjonsformål (se figur 4a og Tabell S3). MCF7-celler, for eksempel, nesten ikke migrerer, som produserer bare en liten perle-fri sone rundt hver celle, med en gjennomsnittlig netto sporområde fra 4900 ± 2400 um
2 (n = 93). De B16-F10 melanomceller produserer forgrenet sporene på grunn av den utvidelse av flere filopodia og tynne lameller stort sett vinkelrett på hoved vandrende bane, med en gjennomsnittlig netto areal på 7400 ± 2800 um
2 (n = 124). De MDA-MB-231 celler er svært trekkmetastatiske celler, som produserer både lange og brede belter med en gjennomsnittlig nettoareal på 13 500 ± 6300 mikrometer
2 (n = 149). H1299 celler er preget av raske og svært vedvarende migrasjon, danner spor med en gjennomsnittlig nettoareal på 14 000 ± 7600 mikrometer
2 (n = 104).
(a) En montasje av 2 × 3 bilder av den PKT av MCF7-celler, så vel som for MDA-MB-231-celler, B16-F10 celler og H1299 celler. Legg merke til forskjellene i spor nettoareal (A
N) og aksial-forhold (X), avhengig av cellelinjen. (B) En montasje av 2 × 3-bilde av H1299 kontrollceller, som viser lange trekkveier som er svært vedvarende. Montage bilder av Latrunculin A (4 mm) – og Nocadazole (2,5 mm) -behandlet brønner indikerer hemmet cellemotilitet; PMA (100 ng /ml) -behandlet tillegg viser en økning i celle motilitet. Skala barer. 250 mikrometer
b) Effekten av cytoskeletal legemidler på Pkt strukturelle og dynamiske funksjoner
For å finne ut om vårt automatiske screening system var i stand til å oppdage endringer i. spesifikke trekkende funksjoner forårsaket av genetiske eller kjemiske forstyrrelser, behandlet vi H1299 celler med ulike forbindelser (for eksempel Latrunculin-A, nocodazol og PMA) er kjent for å påvirke cellemotilitet. Virkningen av hvert medikament på de forskjellige parametrene morfometriske ble deretter målt (figur 4b). Siden verdiene for hver PKT parameter ikke synes å ha normale statistiske fordelinger, basert vi vår sammenligning av endringer i persentil verdier for hver morfometrisk parameter, snarere enn på endringer i gjennomsnittsverdier (tabell S4). Analyse av PKT område av H1299 celler behandlet med forskjellige inhibitorer indikerte at Latrunculin-A eller nocodazol markert redusert sporområder, aksiale forholdstall, migreringshastigheter og ruhet, sammenlignet med kontrollceller. I PMA-behandlede celler, PKT området, hovedakse og beregnede flytte hastigheter økt (p 0,05), men den minste aksen, aksial forholdstall og soliditet var ikke signifikant forskjellig fra de av kontrollceller
Program. av PKT analysen til identifisering av pro-trekkende gener i en brystkreft-relaterte genet bibliotek (BC1000)
PKT analysen beskrevet her ble brukt til å screene et bibliotek av kreftrelaterte gener for deres evne til å indusere en trekkfugl fenotype i hovedsak stasjonære bryst epitelceller. For dette formål infiserte vi dyrkede MCF7 celler med retrovirale vektorer som koder for 55-gener som er valgt fra BC1000 biblioteket (tabell S5) og undersøkt deres vandrende aktivitet ved hjelp av kvantitativ PKT screening.
Som vist i figur 5a og Tabell S6 den PKT skjermen bidratt til å identifisere fire nye pro-trekkende kandidater: HOXB7, FGF7, ErbB3 og PKCζ. Den 80
persentil-verdier, samt den gjennomsnitt og standardavvik, er presentert i tabell S6. Mens alle fire genene stimulert MCF7- celle migrasjon, deres effekter på de ulike trekk parametere forskjellig. Således, mens FGF7 og PKCζ kloner induserte dannelsen av lange, vedvarende spor, på grunn av forbedring av retnings membran fremspring, de langstrakte spor, indusert av HOXB7 og ErbB3 kunne være forbundet med flere membranfremspring i alle retninger. Derfor, mens markering av retnings «termin utstikkere» ikke direkte kan vurderes etter spor morfometri, er det tydelig at forbedring av sporlengde som ikke er ledsaget av høye ruhets verdier er mest sannsynlig, drevet av økt retnings lamellipodial aktivitet (tabell S6 og figur 5). Det er interessant å merke seg at i skjermen på BC1000 bibliotek, endringer i vandringsmønstrene ble kjent for et annet gen, nemlig MFGE8 (også kjent som bryst epiteliale antigen BA46). Mens overekspresjon av dette genet indusert bare mindre forbedring i PKT området, gjorde det i stor grad forbedre spor ruhet, noe som tyder på at det forbedrer ikke-retnings membran protrusion (Naffar Abu-Amara, upubliserte data).
(a) En montasje av 4 × 4 bilder, sammenligne PKT produsert av GFP-MCF7 kontrollceller, til de som produseres av MCF7 celler som uttrykker de BC1000-avledet gener HOXB7, PKCζ, FGF7, og ErbB3. Forstørrelse: 10 ×. Skala barer: 250 mikrometer. (B) Beregnet forholdet mellom hver av de trekkende morfometriske parametere av de forskjellige BC1000 bibliotek kandidater, og de av kontrollceller (GFP-MCF7). Den primære statistiske tilnærmingen benyttet var basert på beregning for hver parameter, The normalisert effekten av GFP-kontroll er alltid definert som null «80
th persentil.»: En nullverdi indikerer ingen forskjell mellom «80
persentil «verdien av kandidaten genet, og av kontrollcellene. Tall som er høyere eller lavere enn null indikerer en økning eller nedgang, henholdsvis i 80
th persentil verdien av de testede parametre. (For flere detaljer, se tabell S6).
For å finne sammenhengen mellom de ulike trekk parametre, søkte vi Pearsons korrelasjon test for alle PKT produsert av uaffisert celler (Figur S2). Denne analysen viste, for eksempel, er at sporlengden (hovedakse og en aksial ratio) negativt korrelert med spor soliditet, noe som indikerer at produksjonen av langstrakte spor av kontrollcellene er høyt korrelert med den laterale protrusive aktivitet. Denne analyse ble også anvendt på de cellene som uttrykker de forskjellige pro-trekkende gener, for å bestemme deres evne til å forstyrre den tilsynelatende gjensidige avhengigheten mellom de forskjellige trekk parametere. Disse analysene viser at overekspresjon av PKCζ, HOXB7, og ErbB3 redusert den gjensidige forholdet mellom sporlengde og soliditet.
Når det gjelder forholdet mellom den aksiale forholdet og dimensjonene på lange og korte akser, kontroll cellene vise det dominerende bidrag til den lange aksen til den aksiale forholdsverdi, med den mindre aksen utøve en begrenset effekt. I celler som uttrykker FGF7 og PKCζ den aksiale forholdet var hovedsakelig korrelert til hovedaksen, mens ErbB3 og HOXB7 påvirkes den aksiale forholdet ved å endre sporvidden. Det ser dermed at forbedring av generelle celle migrasjon av ulike pro-trekkende gener kan oppnås ved selektiv modulering av en rekke dynamiske cellulære funksjoner som celle polarisering og protrusive membran aktivitet.
Diskusjoner
hoved~~POS=TRUNC med denne studien var å utvikle en kvantitativ analyse for cellemigrasjon, som kunne måle flere trekk funksjoner, og vil være forenlig med høy gjennomstrømming screening. Den store eksperimentelle utfordringen involvert i å utforme en slik analyse er den tilsynelatende konflikten mellom den raske oppkjøp av enorme mengden av migrasjon data, og behovet for å oppnå «høyt innhold» informasjon om vandringsmønstrene hos mange celler, inkludert dynamiske funksjoner som migrasjon hastighet og lamellipodial aktivitet. Siden innsamling av direkte dynamisk informasjon om cellemigrasjon er uforenlig med høy gjennomstrømning, valgte vi derfor å utforske indirekte, men likevel reproduserbar og robust, tilnærminger for å få slik informasjon. Vi foreslår her at detaljert morfometrisk analyse av PKT generert av private trekkende celler kan gi slike kvantitative, morfologiske og tilsynelatende dynamiske data
De nye aspekter ved denne studien som fortjener spesiell omtale er:. (I) valg av perler ; (Ii) spor segmentering og morfometri; og (iii) statistisk analyse av dataene. Utvelgelsen av perler for PKT analysen var basert på tre egenskaper av «migrasjons felt»: synligheten av sporet (først og fremst påvirkes av kulestørrelse, med en optimal perlediameter på 300-400 nm); deres evne til å danne et homogent lag (optimal med aldehyd eller karboksylerte flater, dårlig med sulfatperler modifisert), og evnen til å bli fjernet av migrerende celler (optimal med carboxylated- og dårlig med aldehyd-modifiserte perler). Spesielt, er mottakelighet av karboksylerte perler til fjernelse av migrerende celler inverst korrelert til overflaten tetthet av karboksylatgrupper, slik at «fininnstilling» av kulelaget for den spesielle celletype som skal testes.
PKT segmentering og morfometri gitt viktig innsikt i de grunnleggende funksjonene i den vandrende prosessen. Disse omfatter den generelle migrasjonsaktiviteten av cellen, tilsvarende det netto PKT området; migrasjon polaritet, svarende til lengden av den store akse av migrasjon (eller den aksiale forhold); og «lateral» lamellær aktivitet, målt ved sporet soliditet, blant andre verdier. Basert på disse målingene, ble flere dynamiske parametre beregnet, inkludert gjennomsnittlig og effektive migrasjon priser, og lamellær aktivitet. Naturligvis, dynamisk informasjon, bedømt fra den statiske PKT morfologi, er snarere indirekte, men de høyoppløselige data [spesielt grovheten på sporet grenser, målt ved Multiscale segmentering analyse [26]; (Figur 1 h)], som kan bli korrelert til dynamisk informasjon, basert på time-lapse videomikroskopi (figur 3). Når det er beregnet for hvert spor, kunne flere parametere være korrelert til hverandre, enten i kontrollceller, eller etter kjemisk eller genetisk forstyrrelse.
For vårt formål er det PKT analysen anvendes for å oppdage nye pro-trekkende gener i en brystkreft-relaterte genet bibliotek. Begrunnelsen bak denne tilnærmingen er at til tross for den åpenbare molekylære kompleksiteten av cellen migrasjonsprosessen, kan det være «master gener» som kan indusere trekkende funksjoner i en stasjonær celle. Den unike evne til PKT analysen vi utviklet for å synliggjøre og kvantifisere individuelle trekk ved den vandrende fenotype, kan deretter koble et gitt pro-trekkfugl genet til bestemte trekkmekanismer. De nye pro-trekkende gener identifisert her inkluderer: HOXB7, ErbB3, PKCζ og FGF7. Mens alle disse genene er kjent for å være «kreftrelatert», denne studien peker på muligheten for at deres bidrag til ondartet prosessen kan være relatert til deres pro-vandrende aktivitet.
Materialer og metoder
Utarbeidelse av perlebelagt 96-brønners plater
glassbunn 96-brønners plater (What, Inc., Clifton, NJ, USA, Cat. # 7706-2370) ble inkubert i 2 timer ved værelsestemperatur med 50 ul av 10 ug /ml fibronektin oppløsning oppløst i PBS (fibronektin, F-1141; Sigma Chemical Co., St Louis, MO, USA). Brønnene ble deretter vasket to ganger med PBS og belagt med 340 nm hvit polystyren latexkuler (Interfacial Dynamics Corporation-Molecular Probes Sfærer Technologies, USA; Produkt nr 2-300;. Batch no 1344.). Den perlesuspensjon (3,2 ml) ble sentrifugert i 5 minutter ved 20 800 x g og pelleten resuspendert i 4 ml PBS, inntil alle synlige kule klumper ble dispergert. Sedimentering Prosedyren ble deretter gjentatt en gang, hvoretter kulene ble resuspendert i 7 ml PBS, til en sluttkonsentrasjon på 0,9
12 partikler /ml. Alikvoter på 70 ul av perlesuspensjon ble tilsatt til hver brønn, som hadde blitt forhåndsbelagt med fibronektin, og inkubert ved 37 ° C i 2 timer, fulgt av forsiktig vasking med PBS (x 5) ved hjelp av en platevasker (Colombus Plus , Tecan, Sveits). Før cellepletteringen ble PBS erstattet med 50 ul kulturmedium som passer for den spesielle celletype som brukes i den analysen (se figur S3).
Cell forberedelse for den PKT analysen
MCF7 (ATCC -HTB-22), MDA-MB-231 (ATCC-HBT-26), og B16-F10 (ATCC CRL-6475)-celler ble dyrket i Dulbeccos modifiserte Eagles medium (DMEM); H1299-celler (ATCC CRL-5803-) ble dyrket i RPMI-1640. Begge kulturmedium supplert med 10% FCS, 2 mM glutamin, 100 internasjonale enheter /ml penicillin og 100 ug /ml streptomycin (Biological Industries, Beit HaEmek, Israel), og holdt i en 5% CO
2 fuktet inkubator ved 37 ° C. For PKT analysen, 200-400 celler (i 50 ul medium), ble dyrket i hver brønn. Avhengig av de typiske spordimensjoner, som bestemt i preliminære eksperimenter, ble antallet belagte celler, og tiden for inkubering kalibrert for å maksimalisere antall enkelt, ikke-kryssende celle spor. Vanligvis var 200-400 celler /brønn og 7 timers inkubasjon funnet å være optimale parametre for de fleste celler.
Farmakologiske forstyrrelser av PKT formasjon
For å fastslå effekten av ulike farmakologiske hemmere på H1299 cellelinje, ble cellene sådd ut og inkubert i en time, hvoretter de ble behandlet med enten 4 uM Latrunculin A; 2,5 mikrometer nocodazol; eller 100 ng /ml PMA (Phorbol 12-mirystate 13-acetat). Cellene ble deretter inkubert i ytterligere 4 timer, fiksert med 3% paraformaldehyd og vasket to ganger med PBS. Platene ble enten undersøkt umiddelbart ved hjelp av en screening autofokus mikroskop, eller lagret ved 4 ° C for senere inspeksjon.
Screening for migrasjonsinduserende gener
For å screene for migrasjonsinduserende gener, vi valgte 55 kandidat gener fra BC1000 bibliotek: (https://www.hip.harvard.edu/research/breast_cancer/index.htm), samlet ved Harvard Institute of Proteomics bruk av litteratur-mining programvare [27]. Dette biblioteket består av en samling av full-lengde cDNA som er kjent for å være assosiert med utvikling av brystkreft. CDNA blir klonet inn i en puromycin- valgbar retroviral vektor (JP1520) [28] med Skaperen ™ rekombinasjon system (Clontech, Mountain View, California). De 55 gener testet (se tabell S5) ble tilfeldig valgt fra dette biblioteket, og ble sjenerøst gitt av professor Joan Brugge (Department of Cell Biology, Harvard Medical School, USA). Gener ble innført i MCF7-celler ved hjelp av retroviral infeksjon. Hver klon ble testet for sin effekt på cellemigrering, ved hjelp av PKT analysen. Som kontroller vi også generert JP1520 GFP-uttrykke MCF7 celler. Den PKT Analysen ble utført i 96-brønners plater. Fire hundre celler per brønn var seeded og 8 brønner ble testet for hver klone. Cellene ble inkubert i 7 timer, og deretter festes ved hjelp av 3% PFA. Data ble samlet inn ved hjelp av autofokus-screening mikroskop.
Statistical Analysis
Siden fordelingen av sporparametere viser ikke-normalfordelinger, vi brukte persentil statistiske verktøy for å estimater parametere variabilitet. For eksempel, den 80
th persentil for sporområdet er verdien under som 80% av sporene området er funnet.
Forskjeller mellom kontroll og behandlede kulturer ble evaluert for signifikans ved hjelp av to-utvalg Kolmogorov- Smirnov godhet-of-fit hypotesetest. En p-verdi på 0,05 ble ansett for å være statistisk signifikant
Pearsons korrelasjonstest ble utført med verdier i området fra 1 (en perfekt positivt lineært forhold mellom to testede variabler) -1 (en perfekt. negativ lineær sammenheng). En p-verdi på 0,0014 ble ansett som statistisk signifikant
Hjelpemiddel Informasjon
Tabell S1.. Host Sammenligning av egenskapene til ulike perler som brukes til PKT analysen
doi:. 10,1371 /journal.pone.0001457.s001 plakater (0,03 MB DOC)
Tabell S2.
Parametere merknad
doi:. 10,1371 /journal.pone.0001457.s002 plakater (0,03 MB DOC)
tabell S3.
PKT analyse for de ulike cellelinjer
doi:. 10,1371 /journal.pone.0001457.s003 plakater (0,03 MB DOC)
Tabell S4.
PKT analyse av H1299 celler behandlet av ulike rusmidler
doi:. 10,1371 /journal.pone.0001457.s004 plakater (0,03 MB DOC)
Tabell S5.
Liste over testede genene
doi:. 10,1371 /journal.pone.0001457.s005 plakater (0,04 MB DOC)
Tabell S6.
PKT analyse av MCF7 celler som overuttrykker en gitt pro-trekkfugl genet
doi:. 10,1371 /journal.pone.0001457.s006 plakater (0,05 MB DOC)
Figur S1. , En ordning som beskriver bildet oppkjøpet og vise prosessen. (A) en mal av en 96-brønns plate. (B) Posisjonene til 52 felt som kan erverves innen ett godt, med en 10 × objektiv. (C) En montasje av 4 × 4 bilder (1024 × 1024 piksler), tilsvarende det markerte området av brønnen. (D) En full oppløsning bilde av ett felt (512 × 512 piksler) i montasje (markert med c). Skala:. 250 mikrometer
doi: 10,1371 /journal.pone.0001457.s007 plakater (2,03 MB TIF)
Figur S2.
Auto-korrelasjon mellom PKT morfometriske parametere i kontrollceller, og i celler som uttrykker pro-trekkende gener. Auto-korrelasjon mellom de forskjellige morfometriske parametrene ble beregnet for kontrollen (GFP-MCF7) biblioteket, samt for celler som overuttrykker de ulike pro-trekkende gener som er beskrevet i figur 5. Hvert rektangel er delt av en hvit linje i to trekanter; hver trekant viser korrelasjonen test av en annen kandidat. P-verdien for hver korrelasjons resultat indikeres under sammenhengen poengsum nummer
doi:. 10,1371 /journal.pone.0001457.s008 plakater (4,16 MB TIF)
Figur S3.
Skjematisk skisse av 96-brønns plate forberedelse til PKT analysen
doi:. 10,1371 /journal.pone.0001457.s009 plakater (0,96 MB TIF)
Movie S1.
PKT formasjon ved H1299, belagt på isopor perler.
