Abstract
Eggstokkreft presenterer terapeutiske utfordringer på grunn av sin typisk sent deteksjon, aggressiv metastaser, og terapeutisk motstand. Transkripsjonsfaktor Krüppel-lignende faktor 4 (KLF4) har vært innblandet i humane kreftformer som en tumor suppressor eller onkogen, selv om dens rolle avhenger i stor grad på mobil sammenheng. Rollen KLF4 i eggstokkreft er ikke utredet i mekanistisk detalj. I denne studien undersøkte vi hvilken rolle KLF4 i eggstokkreft celler ved transducing eggstokkreft cellelinjer SKOV3 og OVCAR3 med doksycyklin-induserbar KLF4 lentiviral vektor. Overekspresjon av KLF4 redusert celleproliferasjon, migrering og invasjon. Den epitelcelledifferensiering markørgenet E-cadherin var signifikant oppregulert, mens mesenchymale celle markørgener vimentin, twist1and snail2 (slug) ble nedregulert i både KLF4-uttrykke SKOV3 og OVCAR3 celler. KLF4 hemmet transformerende vekstfaktor β (TGFB) -indusert epitelial til mesenchymale overgang (EMT) i eggstokkreft celler. Til sammen våre data viser at KLF4 fungerer som en tumor suppressor genet i eggstokkreft celler ved å hemme TGFB-indusert EMT
Citation:. Chen Z, Wang Y, Liu W, Zhao G, Lee S, Balogh A , et al. (2014) Doxycycline induserbare Kruppel-Like Faktor 4 Lentiviral Vector formidler Mesenchymale til epithelial Overgang i eggstokkreft celler. PLoS ONE 9 (8): e105331. doi: 10,1371 /journal.pone.0105331
Redaktør: Chunming Liu, University of Kentucky, USA
mottatt: 18 mars 2014; Godkjent: 20 juli 2014; Publisert: 19 august 2014
Copyright: © 2014 Chen et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet:. Den authors bekrefte at alle data som underbygger funnene er fullt tilgjengelig uten restriksjoner. Alle relevante data er i avisen og dens saksdokumenter filer
Finansiering:. Dette prosjektet ble delvis støttet av National Institute of Health (HL095957, HD061420 til JY, og CA092160 til GT) og UTHSC oppstart finansiering, Vest-klinikk Cancer Center (JY) og kinesiske regjeringen (2010CB530204 til CL, 112,102,310,110 til YG, 2011DFA33290 til WG). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:. Junming Yue er en PLoS ONE Editorial styremedlem. Dette endrer ikke forfatternes tilslutning til PLoS ONE redaksjonelle retningslinjer og kriterier. Alle Forfatterne har ingen konkurrerende interesse å fortolle.
Innledning
Eggstokkreft har en høy dødelighet, angivelig fører til 15.000 dødsfall årlig i USA [1]. Selv om betydelige forbedringer har blitt gjort i deteksjon av eggstokkreft i det siste tiåret, er mer enn 20.000 nye tilfeller diagnostisert hvert år [1], [2]. De terapeutiske muligheter for ovarial cancer er begrenset på grunn av dens motstand mot kjemo- og stråleterapi som fører til hyppige tilbakefall [3], [4].
KLF4 har vist seg å regulere celleproliferasjon og differensiering, og har sin rolle blitt grundig undersøkt i flere kreft hos mennesker ved hjelp av gevinst-og tap-av-funksjon tilnærminger. I tykktarm og prostata cancer, KLF4 fungerer som et oncogen [5], [6]. I motsetning til dette, spiller det en tumor suppressor rolle i neuroblastom, lungekreft, magekreft, lymfekreft, livmorhalskreft, bukspyttkjertel ductal kreft, og hepatocellulært karsinom [7], [8], [9], [10], [11], [12], [13]. Brystkreft, kan KLF4 fungere både som et oncogen [14], [15] og en tumor suppressor [16], [17], [18]. Rollen KLF4 i eggstokkreft har ikke vært tilstrekkelig og mekanistisk adressert. En tidligere studie tyder på at uttrykket nivået av KLF4 ble betydelig redusert i eggstokkreft sammenlignet med normal eggstokk epitel, noe som tyder på at KLF4 kan potensielt fungere som en tumor suppressor i eggstokkreft [19].
KLF4 spiller en unik rolle i stamcelle omprogrammering ved å tilrettelegge mesenchymale å epitel overgang (MET) [20]. Den cellulære fenotypiske bryteren fra epitelial til mesenchymale celle overgang (EMT) er en fundamental prosess i metastase som er et fremtredende trekk ved eggstokkene karsinomer. The MET eller EMT fører til endringer av epitel og mesenchymale markør genuttrykk som inkluderer snail1 2, Zeb 1 2, Twist, vimentin, E-cadherin [18], [21], [22]. EMT er regulert av flere signalveier, som inkluderer WNT, TGFfi, og Notch. [23], [24], [25]. Nyere studier tyder på at mirnas regulere EMT eller MET veier ved å målrette epitelceller eller mesenchymale celle markørgener som inkluderer MIR-194, MIR-203, og MIR-200c [22], [26]. KLF4 har vist seg å regulere EMT i flere forskjellige kreftceller. I leverkreft, bryst, prostata og kreftceller, aktiverer KLF4 transkripsjonen av epitelceller markørgenet E-cadherin og undertrykker mesenchymale cellen markørgenet snegl 2 (slug) ved binding til de respektive aktivatorer. KLF4 i disse kreftformene fremmer MET og hemmer tumorcellevekst [10], [24], [27]. I denne studien undersøkte vi hvilken rolle KLF4 i eggstokkreft celler ved hjelp av en doksycyklin (Dox) -avhengig KLF4-induserbar lentiviral vektor (Tet-on) og funnet at induserbar overekspresjon av KLF4 redusert celleproliferasjon, migrering og invasjon gjennom å fremme MET i eggstokkreft celler.
Materialer og metoder
Cell kultur
eggstokkreft cellelinjer SKOV3, OVCAR3 og brystkreft cellelinje MCF7 ble hentet fra ATCC og dyrket i Dulbeccos modifiserte Eagle-medium (DMEM) supplert med 10% FBS (Hyclone, Logan, UT), 100 U /ml penicillin og 100 ug /ml streptomycin (Invitrogen, Carlsbad, CA). HEK293 FT-celler ble dyrket i DMEM medier med 10% FBS, 100 U /ml penicillin, 100 ug /ml streptomycin, 1% glutamin, 1% ikke-essensiell aminosyre, og geneticin med en sluttkonsentrasjon på 1 ug /ml.
lentiviral vektor produksjon
Dox-induserbar KLF4, reverse transaktivatorprotein (rtTA-M3), og EGFP lentiviral vektorer ble pakket i HEK293FT celler og produsert som beskrevet tidligere [28]. Stabile cellelinjer med overekspresjon av KLF4- eller EGFP- ble generert av co førende de SKOV3, OVCAR3, og MCF7 celler med lentiviral vektorer KLF4, EGFP med rtTA-M3 og valgt med 5 mikrogram /ml puromycin. For å indusere KLF4 og EGFP uttrykk, ble Dox lagt inn normal vekst medium som angitt.
Cell kolonidannelse analysen
SKOV3, MCF7 og OVCAR3 celler transduced med KLF4 eller EGFP overekspresjon virus (200 celler /vel hver) ble sådd ut i triplikat i 6-brønns plater og dyrket i 2 uker. De ble deretter beiset med 0,1% krystallfiolett, og cellekolonier ble tellet som tidligere beskrevet [29].
MTT-analysen
Celler ble platet 8000 per brønn i 96-brønners plater og dyrket i 24 timer. Deretter ble 10 ul av MTT-reagens tilsatt til hver brønn og inkubert i ~4 timer. Reaksjonen ble avsluttet ved tilsetning av 100 pl detergentreagens; platene ble inkubert ved 22 ° C i mørket i 2 timer; og deretter absorbansen ble målt ved 570 nm bølgelengde.
Cell migrasjon analysen
transduced celler (3 x 10
5 celler per brønn) ble sådd i tre eksemplarer i seks-brønns plater og dyrket i 24 timer. Celleoverflaten ble ripet med en pipettespiss og vasket tre ganger med PBS. Friskt vekstmedium ble tilsatt i ytterligere 24 timer. Migrasjonen ble beregnet ved hjelp av følgende formel: (område av såret området på 0 h – såret området ved 24 h) /såret området på 0 h. Transwell migrasjon Analysen ble utført ved anvendelse av en modifisert kammer (BD Falcon, San Jose, CA). Disse kamre ble satt inn i en 24-brønns plate. Celler (3 x 10
4) i 300 ul serumfritt DMEM ble tilsatt til det øvre kammer. Den kjemotiltrekkende i DMEM ble tilsatt i det nedre kammeret til hver brønn og cellene ble inkubert i 24 timer. Mediet og ikke-migrerte celler på den øvre kammer ble fjernet, mens, ble de migrerte cellene i den nedre side av membranene fiksert med metanol og farget med krystallfiolett. Bildene ble tatt på 10X forstørrelse. Celler i minst tre ulike felt ble talt opp.
Cell invasjon analysen
SKOV3 og OVCAR3 celler (5 × 10
5) transduced med EGFP og KLF4 overekspresjon virus ble sådd i serum- fritt DMEM på innsatser forhåndsbelagt med Matrigel (BD BioCoat, 24-brønners Tumor Invasion system (BD Biosciences, San Jose, CA). DMEM inneholdende 10% FBS ble tilsatt til den nederste kammeret i invasjon system som kjemotiltrekkende. Etter 24 timer, transwell innsatsene var farget med 4 ug /ml Calcein AM (Life Technologies, Grand Island, NY) ved 37 ° C i 1 time. det fluorescerende intensitet ble målt ved bruk av BioTek Synergy (Winooski, VT) plateavleser ved eksitasjon og emisjon bølgelengder av 485 nm og 528 nm, henholdsvis.
Soft agar assay
for bunnen agar, 0,6% Noble agar i DMEM inneholder 10% FBS ble lagt til seks-brønns plater. To millioner celler i DMEM inneholdende 10% FBS og 0,35% Noble agar ble tilsatt til bunnen agar. vekst~~POS=TRUNC medium~~POS=HEADCOMP ble deretter tilsatt til den toppagar når det hadde størknet og cellene ble matet med friskt vekstmedium hver 5 d, og koloniene ble tellet i henhold et lysmikroskop etter 2 uker.
Immunofluorescent flekker
for å påvise uttrykk av EMT-forbundet markørgener, KLF4-uttrykke og kontrollere SKOV3 cellene fiksert i 10 minutter ved hjelp av 4% PFA, vasket tre ganger med 0,1% Tween 20 i PBS (PBST), og inkubert med blokkeringsbuffer (5% normalt geiteserum, 3% bovint serum-albumin, og 0,1% Triton-X-100 i PBS) i 1 time. De primære antistoffer mot E-cadherin, snail2, og vimentin (1:200 fortynning, Cell Signaling, Danvers, MA), ble inkubert med faste celler over natten. Etter skylling tre ganger i 5 minutter med PBST, Alexa 488 eller 594 konjugert geite-anti-kanin (1:200 fortynning, Life Technologies) antistoffer ble tilsatt i 1 time ved romtemperatur. Cellekjerner ble kontra med DAPI (Vector Laboratories, Inc .; Burlingame, California). Bilder ble tatt med et Nikon invertert fluorescens mikroskop.
Chromatin immunoprecipitation (chip)
brikken ble utført ved hjelp av chip-IT Express Enzymatisk kit (Active Motif, Carlsbad, California) i henhold til produsentens bruksanvisning. I korthet KLF4-uttrykkende og styrer SKOV3-celler ble kryssbundet med 1% formaldehyd i 10 minutter ved romtemperatur. Celler ble høstet og ultralydbehandlet for å skråstille kromosomalt DNA. Immunoutfelling ble utført ved å binde 10 ug av kanin anti-KLF4 antistoff eller IgG (Santa Cruz Inc., Dallas, Texas) for å lysatene og inkubert ved 4 ° C med rotasjon natten over. Kromatin kompleksene ble eluert fra magnetiske kuler ved omvendt-tverrbinding. Kromatin DNA ble renset ved anvendelse av QIAquick PCR Purification Kit (Qiagen, Valencia, CA) og eluert i 40 ul vann. DNA (4 mL) ble benyttet for kvantitativ PCR-reaksjonen for å detektere nærværet av E-cadherin-promoteren. Primere som brukes til å påvise formidler av E-cadherin var 5′-TAG AGG GTC ACC GCG TCT AT-3 «(fremover) og 5»-TCA CAG GTG CTT TGC AGT TC-3 (revers) som beskrevet tidligere [16].
Western blot
eggstokkreft og brystkreft celler ble samlet i RIPA buffer (Thermo Scientific, Rockford, IL) inneholder 1% Halt Proteinase Inhibitor Cocktail (Thermo Scientific, Rockford, IL). En lik mengde protein (40 ug /spor) ble applisert på 10% SDS-PAGE-geler og overført til nitrocellulosemembraner. Membranene ble blokkert med 5% fettfri melk i 1 time og inkubert med primære antistoffer mot KLF4 (Cell Signaling), GAPDH (Sigma, St. Louis, Missouri), vimentin, E-cadherin, eller snail2 (cellesignalisering).
Statistisk analyse
Signifikante forskjeller ble bestemt ut fra to eller tre uavhengige eksperimenter utført i triplikat og presentert som gjennomsnitt ± SD ved hjelp av Student
t
-test.
p
. 0,05 ble betraktet som signifikant
Resultater
Overuttrykte KLF4 i eggstokkreft celler ved hjelp av Tet-på systemet
For å finne ut hvilken rolle KLF4 i eggstokkreft celler, konstruerte vi en induserbar lentiviral vektor, karakterisert ved at KLF4 genet ble drevet av tetracycline- (Tet) eller et Dox-responsive promoter (TRE tett). Revers transkripsjon aktivator rtTA-M3 ble drevet av en konstitutiv humant allestedsnærværende C-promoteren klonet inn i en separat lentiviral vektor (figur S1A). KLF4 ekspresjon kan aktiveres ved rtTA-M3 i nærvær av Dox på en doseavhengig måte. En EGFP-induserbar lentiviral vektor ble konstruert og fungerte som kontroll. For å undersøke den induserte ekspresjon av KLF4 og EGFP i ovarian cancer-cellelinjer og SKOV3 OVCAR3, ble Dox tilsatt ved en sluttkonsentrasjon på 1 ug /ml, og ekspresjonen av KLF4 og EGFP ved forskjellige tidspunkter ble påvist ved Western blot. Uttrykk for EGFP og KLF4 økt gradvis over en 24 timers periode (figur S1B). EGFP ekspresjon i SKOV3 og OVCAR3 eggstokkreft celler ble visualisert ved hjelp av fluorescerende microcopy 48 timer etter tilsetning av Dox (fig. S2A, B). Dox behandling ført til endringer i cellen morfologi SKOV3 celler. En avrundet epitelial celle-lignende morfologi ble observert i KLF4-transduserte SKOV3-celler sammenlignet med avflatet multipolar epitelial celle-lignende form av EGFP eller KLF4 kontrollceller ved 48 og 72 timer (fig. S1C og S2C fig.). Men morfologi i KLF4-transduced OVCAR3 celler ble ikke endret ved Dox behandling sammenlignet med kontrollceller (data ikke vist).
KLF4 hemmer celledeling og kolonidannelse
For å undersøke hvilken rolle KLF4 i ovariecancer celleproliferasjon, ble MTT-analysen utført i KLF4-transduserte SKOV3 og kontrollcellene. Etter Dox behandling, spredning i KLF4-overekspresjon celler var betydelig hemmet i forhold til EGFP eller KLF4 (ikke-Dox) kontrollceller (figur 1A). Vi utførte også kolonidannelse analyser på SKOV3 og OVCAR3 celler transduced med KLF4 og EGFP kontroll vektorer. Antallet kolonier i KLF4-overuttrykkende celler ble signifikant redusert sammenlignet med EGFP og KLF4 kontrollceller (figur 1B, C). I tillegg ble soft agar-kolonidannelse analyser også utført for å bestemme hvorvidt KLF4 påvirker forankringsuavhengig cellevekst. Tilsvarende resultatene indikerte at KLF4 inhiberer celleproliferasjon i de halvfaste kulturmediet sammenlignet med kontrollceller (figur 1D).
A. Celleproliferasjon av SKOV3-celler transdusert med enten EGFP eller KLF4 ble undersøkt ved hjelp av MTT-analysen ved forskjellige tidspunkter etter Dox behandling. Overekspresjon av KLF4 betydelig redusert celleproliferasjon sammenlignet med det i Dox-behandlede kontrollceller (*
p
0,05). B. 200 SKOV3-celler transdusert med lentivirale KLF4 eller EGFP kontroll vektorer ble sådd i hver brønn av en 6-brønns plate og dyrket i 14 d. Cellekoloniene ble telt etter krystallfiolett farging. Antallet kolonier i KLF4-overuttrykkende celler ble signifikant redusert sammenlignet med den i Dox-behandlede kontrollceller (***
p
0,001). C. Antallet kolonier i KLF4-overekspresjon OVCAR3-celler ble signifikant redusert sammenlignet med det i Dox-behandlede kontrollceller (**
p
0,01). D. myk agar-kolonidannelse analyse ble utført in triplo ved bruk av SKOV3-celler. Kolonier ble fotografert og tellet etter 3 uker. Antallet kolonier i KLF4-overekspresjon celler ble betydelig redusert i forhold til at det i Dox-behandlede kontrollceller (***
p
0,001).
KLF4 reduserer celle migrasjon og invasjon
En viktig egenskap ved invasive kreftceller er deres økt mobilitet. For å undersøke om KLF4 påvirker celle migrasjon i eggstokkreft cellelinje SKOV3, sårhelende Analysen ble utført ved hjelp av KLF4-omsatte SKOV3 og kontrollceller. Som vist i figur 2A, ble cellemigreringshastigheten betydelig redusert i KLF4-overuttrykkende celler i forhold til priser i EGFP- og KLF4-transduserte kontrollceller. Cell kjemotakse ble undersøkt ved hjelp av transwell migrasjon analysen. Som vist i figur 2B og C, ble overført cellene betydelig redusert i KLF4-overekspresjon og SKOV3 OVCAR3 celler sammenlignet med celler EGFP og KLF4 kontroller. For å undersøke om KLF4 påvirker celle invasjon, ble en celle invasjon analysen utført på KLF4-omsatte SKOV3 og OVCAR3 celler ved hjelp av Matrigel-belagte Transwell plater. Overekspresjon av KLF4 betydelig redusert celle invasjon sammenlignet med kontroller i både cellelinjer (figur 3A, B).
A. Sårhelende analysen ble utført for å undersøke migrasjonsrate av SKOV3 celler transduced med KLF4 og EGFP lentiviral vektorer. Fotografier ble tatt ved 0 og 24 timer etter den første grunnen. Migrasjonsrater ble kvantifisert ved å måle tre forskjellige sår områder. Tre separate eksperimenter ble utført. Migrasjon hastigheten ble betydelig redusert i KLF4-overekspresjon celler sammenlignet med i Dox-behandlede kontroller (**
p
0,01). B, C. Transwell migrering Assayet ble utført i SKOV3 og OVCAR3 celler. Overekspresjon av KLF4 betydelig redusert celle migrasjon i SKOV3 (B) og OVCAR3 (C) celler sammenlignet med i Dox-behandlede kontroller (***
p
0,001).
A, B. celle invasjon analysen ble utført ved anvendelse av Matrigel-belagte plater for Transwell SKOV3 (A) og OVCAR3-celler (B). Invasjonen hastigheten ble betydelig redusert i KLF4-overekspresjon celler sammenlignet med i Dox-behandlede kontrollceller fra både SKOV3 og OVCAR3 celler (**
p
0,01). Data ble samlet inn fra tre separate forsøk og analysert ved hjelp av Student
t
-UNDERSØKELSER.
KLF4 fremmer MET i eggstokkreft celler
For å undersøke om KLF4 regulerer EMT i eggstokkreft celler, epiteliale cellemarkør gen E-cadherin og mesenchymale markørgener snail2 og vimentin ble undersøkt i KLF4-omsatte SKOV3 og OVCAR3 celler ved hjelp av Western blot. Den epitel markør E-cadherin var signifikant oppregulert, mens mesenchymale markører vimentin og snail2 ble betydelig redusert i KLF4-overekspresjon celler i forhold til EGFP og KLF4 kontroller (figur 4A, B). Vi utførte også farging på KLF4-overekspresjon og kontrollceller til å undersøke MET markører. Både E-cadherin og vimentin flekker var fremtredende i cellemembraner, mens snail2 farget cellekjerner. I likhet med de vestlige blotter, farging viste at E-cadherin uttrykk ble oppregulert, mens vimentin og snail2 ble nedregulert (figur 4C, D og E). Vi har også undersøkt uttrykk for twist1 bruker realtime RT-PCR i KLF4 omsatte SKOV3 celler og fant at twist1 var signifikant nedregulert i KLF4 uttrykke SKOV3 celler sammenlignet med kontroll (Fig. S4). Disse resultatene støtter hypotesen om at KLF4 fremmer MET i eggstokkreft celler. For ytterligere å undersøke om E-cadherin oppregulering ble forårsaket av transkripsjonen aktivering, utførte vi kromatin immunoprecipitation i KLF4-uttrykke og kontrollere SKOV3 celler, og arrangøren regionen E-cadherin ble forsterket fra beriket kromatisk DNA ved real-time PCR som beskrevet tidligere [ ,,,0],16]. KLF4 uttrykk i SKOV3 celler førte til en ca 15 ganger anrikning av E-cadherin sammenlignet med kontroller (Figur 4F), noe som indikerer at KLF4 binder seg til arrangøren av E-cadherin og aktiverer E-cadherin uttrykk i eggstokkreft celler.
A. B. Western blot ble utført i KLF4- og EGFP-transduserte SKOV3 (A) og OVCAR3-celler (B) med eller uten Dox induksjon. E-cadherin uttrykk var signifikant oppregulert (***
p
0,001), mens vimentin (**
p
0,01) og snail2 (***
p
0,001) ble nedregulert i KLF4- overekspresjon SKOV3 celler sammenlignet med kontrollceller (A). E-cadherin (**
p
0,01) ble oppregulert, mens vimentin (*
p
0,05) og snail2 (***
p
0.001) ble nedregulert i KLF4-overekspresjon OVCAR3-celler sammenlignet med Dox-behandlede kontrollceller (B). E-cadherin (C) og vimentin (D) ble immunfarget i cellemembraner i KLF4-uttrykkende og kontrollere SKOV3-celler. E. Snail2 var farget i cellekjernene i KLF4-uttrykke og kontrollere SKOV3 celler. F. KLF4 binding til arrangøren av E-cadherin i SKOV3 celler ble undersøkt av kromatin immunpresipitering hjelp KLF4 antistoff og oppdaget av real-time PCR ved hjelp av E-cadherin-spesifikke primere. Chip-beriket DNA-nivåer ble normalisert til innspill DNA, etterfulgt av subtraksjon av ikke-spesifikk binding bestemmes av kontroll IgG (***
p
0,001)
KLF4. hemmer TGFB-indusert EMT i eggstokkreft celler
for å undersøke mekanismen om KLF4 regulerer TGFB indusert EMT i eggstokkreft celler, ble SKOV3 og OVCAR3 celler behandlet med ulike doser av TGFB. Uttrykk for de EMT markørproteiner E-cadherin, vimentin, og snail2 ble undersøkt ved hjelp av Western blot. Våre data tyder på at TGFB fremmet EMT i eggstokkreft celler ved downregulating E-cadherin og oppregulering snail2 og vimentin (figur 5A, B). Videre, når vi behandlet KLF4-uttrykkende og kontrollere SKOV3 og OVCAR3 celler med økende doser av TGFp, KLF4 ekspresjon hemmet signifikant TGFp-indusert EMT i begge cellelinjer (figur 6A, B).
Menneske ovarie cancer-cellelinjer SKOV3 (A) og OVCAR3 (B) ble behandlet med forskjellige doser av TGFp i 48 timer. EMT-forbundet markørgener, inkludert E-cadherin, snail2, og vimentin ble undersøkt ved hjelp av Western blot. Betydninger ble bestemt ved å sammenligne TGFB behandlet for ikke-behandling (* p 0,05, ** p 0,01, *** p 0,001).
Eggstokkreft cellelinjer SKOV3 (A) og OVCAR3 (B) transdusert med lentiviral KLF4 overekspresjon og kontroll vektoren ble behandlet med TGFp i 48 timer, og protein uttrykk for EMT-tilknyttet markørgener E-cadherin, snail2 og vimentin ble undersøkt ved hjelp av Western blot. Signifikante forskjeller ble sammenlignet mellom KLF4 uttrykke og kontrollgruppen (** p 0,05, *** p 0,001)
Diskusjoner
I denne studien har vi undersøkt rollen. KLF4 i eggstokkreft celler ved hjelp lentiviral vektor mediert induserbar uttrykk. Tidligere studier har vist at KLF4 ble nedregulert i eggstokkreft sammenlignet med kontroller og at KLF4 ikke påvirker celleproliferasjon men økte BCL-2 /Bax forhold og hemmet apoptose [19]. I motsetning til dette, fant vi at KLF4 hemmer proliferasjonen av SKOV3-celler i kolonidannelse og MTT-analyser (fig. 1 A, B og C). Avviket kan skyldes den lave transfeksjon effektivitet i den studien sammenlignet med våre svært effektiv induserbar lentiviral transduksjon. Vi fant også at KLF4 hemmer celledeling i OVCAR3 celler (Fig. 1C). Våre data viser at KLF4 hemmer celledeling, migrering og invasjon, derav det fungerer som en tumor suppressor i begge SKOV3 og OVCAR3 celler.
KLF4 kan ha en dobbel effekt enten som et onkogen eller en tumor suppressor i bryst kreftceller [14], [16], [18], [30]. Å sammenligne handlingene til KLF4 i MCF7- brystkreft med det i eggstokkreft celler, utførte vi lignende eksperimenter ved hjelp av samme lentiviral Tet-på induserbar vektor-transduced i MCF7 celler. Vi fant at KLF4 inhiberer MCF7 celleproliferering (fig. S3A). Våre funn er lik de resultater som er vist i MCF10A celler ved Yori et al. [16]. Yu et al., Viste imidlertid at KLF4 fungerer som et onkogen i MCF7-celler [14], som er motsatt til våre funn.
Morfologien i KLF4 uttrykke SKOV3-celler i nærvær av Dox ble tydelig forandret fra kontrollceller uten Dox på ulike tidspunkter (fig S2C); Men vi fikk ikke observere tydelig morfologisk endring i OVCAR3 celler etter induksjon av KLF4 uttrykk. En av grunnene forårsaker dette fenomenet er at KLF4 også indusert celle apoptose i eggstokkreft celler basert på våre upubliserte data. De morfologiske forskjeller kan være forårsaket av de forskjellige reaksjoner på KLF4 indusert apoptose i begge cellelinjer. I begge SKOV3 og OVCAR3 celler epitelcelle markørgenet E-cadherin er oppregulert, og den mesenchymale markørgener vimentin og snail2 ble nedregulert etter induksjon av KLF4 overekspresjon (fig. 4A, B). Til sammen disse dataene tyder på at KLF4 primært fremmet MET i eggstokkreft celler. Uttrykket av EMT forbundet markørgener i eggstokkreft celler er i likhet med hva vi har observert i MCF7 brystkreftceller, selv om den endogene uttrykk for vimentin i MCF7- var ikke påvises i KLF4-overekspresjon eller kontrollceller. Dette kan være forårsaket av lav endogen uttrykk nivå vimentin i MCF7 celler. Våre data støtter hypotesen om at KLF4 er en viktig regulator fremme MET og hemme EMT i eggstokkene og brystkreftceller.
Tidligere studier viste at KLF4 binder seg til promoter regioner av E-cadherin og snail2, og dermed kan aktivere ekspresjon av E-cadherin eller undertrykke ekspresjonen av snail2 i fibroblaster og en rekke kreftcellelinjer [18], [24], [27], [31]. Ekspresjonen av epitel cellemarkør E-cadherin er nødvendig for stamcelle omprogrammering. KLF4 letter MET prosessen ved å aktivere E-cadherin uttrykk [31]. I eggstokkreft celler, observerte vi en KLF4 avhengig oppregulering av E-cadherin og en nedregulering av vimentin og snail2. Våre data indikerer at KLF4 transkripsjonelt binder seg til promoterene fra E-cadherin, og dermed fører til aktivering av E-cadherin ekspresjon i eggstokkreft celler.
EMT eller MET er strengt regulert av flere signalveier. Flere studier har vist at flere signalveier, inkludert WNT, hakk, NFkB, og TGFp, er involvert i EMT eller MET overgang i-kreft [32], [33], [34], [35]. Tidligere studier har også vist at TGFB fremmer EMT i eggstokkreft celler [36], [37]. Men det er ingen relaterte studier på beskriver mekanismen hvordan KLF4 er involvert i EMT og samhandler med disse veiene i eggstokkreft celler. Vår nåværende studier indikerer at KLF4 hemmer TGFB-indusert EMT i både SKOV3 og OVCAR3 celler (fig. 6A, B), noe som tyder på at KLF4 demper TGFB indusert EMT i eggstokkreft. Derfor vil synergi overekspresjon av KLF4 og hemming av TGFB pathway gi en ny tilnærming i utviklings nye terapeutiske legemidler for behandling av eggstokkreft.
I sammendraget, er dette den første rapporten som viser at KLF4 fungerer som en svulst lyddemper ved å hemme celleproliferasjon, migrasjon og invasjon i eggstokkreft celler gjennom demping TGFB-indusert EMT.
Hjelpemiddel Informasjon
Figur S1.
Induksjon av KLF4 uttrykk i eggstokkreft celler ved hjelp lentiviral Tet-på vektoren. A. Lentiviral Tet-på vektorsystem. Omvendt transaktivatorprotein (rtTA-M3) ble drevet av menneskelige ubiquitin C (UBC promoter), og EGFP eller KLF4 ble drevet av Dox induserbar promoter TRE tett. For å indusere ekspresjon av EGFP eller KLF4 er Dox kreves for å aktivere det Tet-promoteren følgende rtTA-binding til det Tet-responsive element i promoter-regionen. B. EGFP og KLF4 uttrykk ble indusert av Dox i SKOV3 eggstokkreft kreftceller og oppdaget av Western blot. C. SKOV3 celler som overuttrykker KLF4 skjerm avrundede epithelial celle-lignende morfologi
doi:. 10,1371 /journal.pone.0105331.s001 product: (PDF)
Figur S2.
Dox-indusert EGFP uttrykk i SKOV3 og OVCAR3 celler. EGFP uttrykk i SKOV3 (A) og OVCAR3 celler (B) transduced med EGFP lentiviral vektor ble visualisert under fluorescerende mikroskopi med eller uten Dox induksjon. Cell morfologi ble undersøkt under lysmikroskopi. C. Celle morfologi ble fotografert ved ulike tidspunkt etter lysmikroskopi
doi:. 10,1371 /journal.pone.0105331.s002 product: (PDF)
Figur S3.
KLF4 fremmer MET i brystkreft MCF7 celler. A. Colony dannelse ble utført i MCF7 celler transduced med EGFP og KLF4 overekspresjon lentiviral vektorer. Antallet kolonier i KLF4-overekspresjon celler ble betydelig redusert i forhold til at det i Dox-behandlede kontroller (***
p
0,001). B. Western blot analyse av KLF4 (**
p
0,01), E-cadherin (**
p
0,01), og snail2 (*
p
0,05) i MCF7 celler som overuttrykker KLF4 og EGFP med eller uten Dox behandling
doi:. 10,1371 /journal.pone.0105331.s003 product: (PDF)
Figur S4.
KLF4 nedregulerer twist1 uttrykk i eggstokkreft SKOV3 celler. Twist1 ekspresjon i KLF4 uttrykke SKOV3 og kontrollceller ble detektert ved sanntids RT-PCR følgende KLF4 induksjon i 24 timer ved anvendelse av 1 pg /ml doksycyklin (*
p
0,05)
doi:. 10,1371 /journal.pone.0105331.s004 product: (PDF)
Tekst S1.
doi: 10,1371 /journal.pone.0105331.s005 plakater (docx)
