Abstract
Mutasjoner som øker mottakelighet for inflammatorisk tarmsykdom (IBD) har blitt identifisert i en rekke av gener i både mennesker og mus, men de faktorer som styrer hvordan disse mutasjonene bidra til patogenesen av IBD og føre til fenotypisk presentasjon som ulcerøs kolitt (UC) eller Crohns sykdom (CD) er ikke godt forstått. I denne studien mus som mangler både TNF og IL-10 (T /I mus) ble funnet å spontant utvikle alvorlig kolitt snart etter avvenning, uten behov for eksogene triggere. Kolitt i T /I mus hadde klinisk og histologisk funksjoner som ligner på menneskets UC, inkludert en betydelig økt risiko for å utvikle betennelse-assosiert kreft i tykktarmen. Viktigere, utvikling av spontan kolitt hos disse musene ble forhindret av antibiotikabehandling. I samsvar med den kjente rollen til Th17-drevet inflammasjon som svar på bakterier, T /I mus hadde forhøyede serumTh17-type cytokiner når de utviklet spontan kolitt og etter systemisk bakteriell utfordring via NSAID-indusert nedbrytning av slimhinnebarrieren. Selv om TNF-produksjon har vært ansett å være patogene være i IBD, indikerer disse dataene at evnen til å produsere normale nivåer av TNF faktisk beskytter mot den spontane utvikling av kolitt som reaksjon på intestinal kolonisering av bakterier. T /I musemodell vil være nyttig for å utvikle nye rasjonelt-basert terapi for å forebygge og /eller behandle IBD og betennelse-assosiert kreft i tykktarmen, og kan videre gi viktig innsikt i patogenesen av UC hos mennesker.
Citation : Hale LP, Greer PK (2012) A Novel Murine modell av inflammatorisk tarmsykdom og betennelse-Associated Colon Cancer med ulcerøs kolitt-lignende funksjoner. PLoS ONE syv (7): e41797. doi: 10,1371 /journal.pone.0041797
Redaktør: Markus M. Heimesaat, Charité, Campus Benjamin Franklin, Tyskland
mottatt: May 15, 2012; Godkjent: 25 juni 2012; Publisert: 27.07.2012
Copyright: © Hale, Greer. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av midler fra Duke University Avdeling for patologi, samt ved National Institutes of Health gir R21-DK75522 og R01-CA115480. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
human inflammatorisk tarmsykdom (IBD) manifesterer seg vanligvis enten som ulcerøs kolitt (UC) eller Crohns sykdom (CD). Pasienter med UC eller CD begge lider av episodisk blodig diaré og magesmerter, men de skiller seg i brutto og histologisk distribusjon av deres tarmbetennelse. Den betennelse i UC innebærer alltid endetarmen, og kan også strekke seg nærmest og på en kontinuerlig måte for å involvere sigmoid, synkende colon, eller hele tykktarmen ( «pancolitis»). Histologisk krypten byller og sårdannelse er vanlig i UC, med betennelse vanligvis begrenset til slimhinnen. I motsetning til dette, kan CD involvere en hvilken som helst del av mage-tarmkanalen, selv om den mest vanlige sykdomsmønster involvere terminal ileum alene, tykktarmen alene, eller både terminal ileum og kolon. Betente kviser i CD forlenge dypt inn i tarmveggen ( «transmuralt»), kan omfatte ikke-caseating granulomer, og er karakteristisk atskilt med uninvolved vev ( «skip lesjoner»). Komplikasjoner av transmuralt engasjement i CD inkluderer perforeringer, dannelse av store byller, og unormale tilkoblinger (fistler) mellom tilstøtende tarmen sløyfer eller kroppsoverflaten.
Mutasjoner som øker mottakeligheten for IBD har blitt identifisert i en rekke gener i både mennesker og mus. Noen av disse mutasjonene er sett i menneske familier med både UC og CD, men de faktorene som styrer om UC eller CD forekommer i en gitt pasient er ikke bestemt. Denne informasjonen er svært viktig klinisk, siden disse sykdommene har en annen prognose og reagerer forskjellig på tilgjengelige behandlinger. For eksempel var homozygote mutasjoner i reseptoren for IL-10 som nylig er funnet å være en årsak til tidlig debut, alvorlig CD hos mennesker [1]. Imidlertid har genome-wide forening og andre studier også identifisert polymorfismer i menneske IL-10 genet som konferere en økt risiko for å utvikle UC [2], [3]. Den immunregulerende cytokin IL-10 er viktig for generering og funksjon av T-regulatoriske celler som er blitt vist å beskytte mot utvikling av IBD i murine modeller [4], [5]. IL-10 ble også nylig vist å redusere IL-1β produksjon av dendrittiske celler, derved nedregulering av Th17-mediert betennelse som har vært implisert i patogenesen IBD [6].
Selv om mus med delesjon av genet som koder for IL-10 ble opprinnelig rapportert til spontant å utvikle kolitt [7], er det funnet at
Il10
– /- mus på C57BL /6 bakgrunn er resistente mot utviklingen av spontan kolitt da holdt fri for patogener som
Helicobacter product: [8], [9]. Men disse
Il10
– /- mus lett utvikle moderat til alvorlig IBD når den utløses av hendelser som kompromittere deres slimhinnebarriere, slik som infeksjon med Heliobacter-arter [8], [10], eller eksponering for ikke- -steroidal antiinflammatoriske midler (NSAIDs) [11], [12]. IBD i
Il10
– /- mus er preget av transmuralt betennelse og hoppe lesjoner og er vanligvis mest alvorlig i cecum og den proksimale colon. Vi har også tidvis observert granulomer, entero-entero eller entero-kutan fistler, og mage byller i
Il10
– /- mus med langvarige tarmsykdom (L.P. Hale, upubliserte observasjoner).
Il10
– /-. Mus dermed ut til å gi en IBD modell som ligner det som er sett hos mennesker med CD
cytokin TNF er en viktig regulator av betennelse. I tillegg til de direkte effektene, induserer TNF flere genprodukter er involvert i den inflammatoriske reaksjonsveien, reparasjon av vev og immunresponser, inkludert IL-1, IL-6, og prostaglandiner. I overensstemmelse med sin rolle i regulering av inflammasjon, TNF-nøytraliserende monoklonale antistoffer som infliximab har vist seg å redusere signifikant inflammatorisk aktivitet i behandling fast CD hos mennesker, for å forbedre lukking av fistler, og for å være en effektiv vedlikeholdsterapi hos pasienter med luminal eller fistulizing CD [13] – [16]. Effekt av infliximab er også blitt vist hos mennesker med UC [17]. Den kliniske Suksessen til disse spesifikke anti-TNF-terapeutika har ført TNF å anse som en vesentlig regulator av betennelse i IBD. Imidlertid har mangelen på effekten av andre anti-TNF-medikamenter slik som den oppløselige TNF-reseptor etanercept [18] og TNF-syntese inhibitor LMP-420 [19] i human eller murin IBD reist spørsmål om hvorvidt anti-TNF-behandling i IBD arbeid via nøytralisering av TNF, eller via en annen mekanisme (f.eks immunsuppresjon generert av cytotoksisitet til TNF-uttrykkende celler). For ytterligere å adressere viktigheten av TNF i patogenesen av IBD, vi skapte
Il10
– /- mus som var også globalt mangelfull i TNF og vurdert deres mottakelighet for colits, betennelse-assosiert kreft i tykktarmen, og systemiske responser på tarmbakterier.
Materialer og metoder
Animal Studies
hekkende par av C57BL /6 mus mangelfull i IL-10 (stamme name =
B6. 129P2-Il10
tm1Cgn /J
; lager # 002251) og TNF (stamme name =
B6.129S6-Tnf
tm1Gkl /J
; lager # 005540) ble innhentet fra Jackson Laboratories (Bar Harbor, ME) og krysset for å generere
Tnf
+/- Il10
– /- product: (T-het /i) og
Tnf
– /- Il10
– /-
dobbel knockout (T /i) mus som var IBD-følsomme, med heterozygot eller fullstendig mangel av TNF-produksjon i alle celletyper. Hekke ordningen brukes vanligvis genereres T-het /I og T /I mus som kullsøsken som ville bli utsatt for det samme mors bakterieflora ved fødselen. Når det er mulig, co-huset homofile kullsøsken av ulike genotyper ble brukt når alderstilpassede sammenligninger ble gjort. Men hver genotype gruppe studerte var sammensatt av flere kull og data innhentet ble ikke matchet til kullsøsken.
Mus ble plassert i polykarbonat mikro-isolator bur i individuelt ventilerte stativer under konkrete patogenfrie barriere forhold, med tilgang til mat og vann
ad libitum
. Sentinel mus eksponert gjentatte ganger å skitne sengetøy fra mus brukt i denne studien var negative for parasitter ved mikroskopisk undersøkelse, negativ for
Citrobacter rodentium
av fekal kultur, negativ for infeksjon med
Helicobacter
arter av PCR av avføring, og negativ ved serologi for et panel av 22 murine protozo, bakterielle og virale patogener, inkludert murine parvovirus, murine hepatitt virus, og muse norovirus.
for studier av spontan kolitt, kohorter av mus ble avlivet for histologisk scoring av tykktarmsbetennelse på forhåndsbestemte tidspunkter eller hvis nådde de humane endepunkter av rektal prolaps, tap av 15% av kroppsvekten, eller tegn på smerte og ubehag inkludert dårlig stell, redusert aktivitet, og krum holdning. Noen årskull av mus ble eksponert for 200 ppm piroksikam i pulverisert LabDiet 5001 chow (Land O’Lakes-Purina, Richmond, IN) i 7 dager, en behandling tidligere vist å utløse utbruddet av kolitt i
Il10
– /- mus [11], [12]. Basert på målte matforbruk, dosen av piroxicam i gjennomsnitt 48 mg /kg /dag i disse forsøkene. Musene ble deretter plassert tilbake på chow uten piroksikam og observert i ytterligere 16 dager før avlivning for histologisk scoring av tykktarmsbetennelse.
For studier av kolitt forebygging, antibiotikabehandling ble initiert ved avvenning ved anvendelse av kommersielt tilgjengelig gnagerfor som inneholdt 3 mg amoxicillin, 0,5 mg klaritromycin, 1 mg metronidazol og 20 mg omeprazol per 5 g platen (Bio-Serv, Frenchtown, NJ). Kontrollgrupper fikk identiske wafere som manglet antibiotika.
vevet analyse
Etter eutanasi ble fordøyelseskanalen delt inn i 5 segmenter som representerer cecum og proksimale, midten, distale og terminal kolon /rektum. Vevene ble løst i Carnoy løsning i 2-4 timer eller i 10% nøytral bufret formalin i 18 timer, deretter behandlet i parafinblokker. Alvorlighetsgraden av tykktarmsbetennelse og forekomst av tykktarms neoplasi sett i hematoxylin og eosin-farget seksjoner ble scoret av en bord-sertifisert patolog blindet for forsøksgruppen. Histologiske score ble beregnet som beskrevet [12], [20], ved bruk av en skala 0-75 som tar hensyn til slimhinne endringer i de 5 forskjellige tarmsegmenter, inkludert hyperplasi og sårdannelse, graden av betennelse, og% av hver tarmsegment påvirkes av disse endringene. Ved hjelp av denne skalaen, en poengsum 12 indikerer tilstedeværelse av kolitt, 13-24 indikerer mild kolitt, og 26 indikerer moderat til alvorlig kolitt. Dyr med histologiske score som faller inn i moderat til alvorlig rekkevidden vanligvis enten har spredt alvorlige inflammatoriske lesjoner eller omfattende sykdom som involverer slimhinnen. Snittene ble scoret også for ikke-invasive eller invasive neoplasi [21]. Gastrointestinale intraepitelial neoplasi (synonymt med atypisk hyperplasi, microadenoma, carcinoma
in situ
) og adenom ble ansett for å være ikke-invasive lesjoner. Diagnosen invasivt karsinom kreves nærvær av en desmoplastic respons (dannelse av et rikelig kollagene stroma) for å skille fra invasjon av slimhinnen prolaps eller pseudoinvasion. Regioner av neoplasi som ble atskilt av regioner i normal slimhinne ble scoret som separate lesjoner
Cytokin Responses to Bakterier og deres produkter
For å vurdere systemiske cytokin respons på bakterielle produkter, voksne mus ( 8 uker) ble injisert intraperitonealt med 100 pg lipopolysakkarid (LPS) fra
E. coli
Ø55: B5 i 1 ml saltvann. Dyrene ble avlivet 90 minutter senere for å få serum for cytokinanalyse. Vekselvis, ble mus plassert på dietter inneholdende 200 ppm piroksikam og serum ble oppnådd 42 timer senere. Cytokinene som er tilstede i serum ble kvantifisert ved sammenligning med standarder med kjente konsentrasjoner ved bruk av enten enzym-immunoanalyser (mus-TNFa DuoSet DY410; R dette varierte fra 1 til 10 pg /ml for analyttene som ble testet. Målinger under denne grensen ble tildelt en verdi på null. Ifølge produsentens litteratur, reagenser brukt hadde ubetydelig kryssreaksjon med andre analytter.
Statistical Analysis
Statistisk sammenligning av histologiske score og cytokin nivåer for genotypene studert ble utført ved hjelp av ANOVA, deretter en post-test for multiple sammenligninger ved hjelp GraphPad Prism programvare, versjon 5.03. Cytokin data ble log-transformert før statistisk analyse. En Dunnetfs post-test ble anvendt når hver gruppe ble sammenlignet mot naturlig forekommende kontroll. En Tukey post-test ble anvendt da eksperimentelle grupper ble sammenlignet mot hverandre. Kategoriske data ble sammenlignet via chi-squared analyse (Fishers eksakte test). Overlevelse ble beregnet ved hjelp av Kaplan-Meier test med
p
-verdier beregnet ved bruk av log rank test (MediCalc Software, versjon 12.2.1, Mariakerke, Belgia). En p-verdi ≤0.05 ble ansett å utgjøre en betydelig forskjell mellom gruppene.
Etikk erklæringen
Alle dyrestudier ble godkjent (protokoll nummer A151-09-05) av Institutional Animal Care og bruk Committee of Duke University, en institusjon som er akkreditert av Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care (AAALAC), International. Selv kolitt har potensial til å produsere smerte og ubehag, ble analgetika ikke anvendt i disse studiene, ettersom ikke-steroide anti-inflammatoriske midler (NSAID) kan forverre kolitt og opioider påvirke intestinal motilitet og funksjon. Lidelse ble minimert ved å gi dødshjelp for mus som møtte humane endepunkter, som angitt ovenfor.
Resultater
Effekt av TNF mangel på hekkesuksess og vekst av
Il10
– /- Mus
Tnf
– /-
: Il10
– /- (T /I) unge voksne menn og kvinner var fruktbare med normal kullstørrelse, men unger ofte utstilt høy tidlig dødelighet og /eller unnlatelse av å trives. Hekke livet av T /I dammer ble vanligvis begrenset til 1-2 kull og noen aldri ble gravid i det hele tatt. Svangerskap sjelden skjedde med T /I dammer eller okser eldre enn 5 måneders alder. Disse avl problemene var knyttet til kombinasjonen av IL-10 og TNF-mangel, siden lignende problemer var uvanlig når enkelt knockout
Il10
– /- eller
Tnf
– /- mus ble likeledes holdes under Helicobacter frie betingelser i det samme anlegget. Vi rutinemessig spredte linjen ved hjelp av T-Het /I dammer og T /I okser.
Når født til en sunn dam, T-het /I og T /I valpene var av samme vekt i løpet av de første 3 ukene av liv og deres vekter var lik de som ble observert i alders matchet villtype C57BL /6,
Il10
– /- eller
Tnf
– /- valper hevet i samme anlegg (figur 1). Men vekten av T /I mus begynte å henge bak de av WT, T-het /I,
Il10
– /- og
Tnf
– /- mus snart etter avvenning (figur 1 og data ikke vist). Dette førte oss til hypoteser om at T /I mus kan være utsatt for å utvikle kolitt spontant, i fravær av den spesifikke utløser nødvendig for å indusere kolitt i
Il10
– /-. Mus
gjennomsnitt ± SEM kroppsvekt er vist for villtype og T /i hannmus mellom 2 og 9 uker gammel. Antall kull og mus representert er 8 kull og 2-24 mus /punkt for villtype (WT) og 14 kull og 3-12 mus /punkt for T /I mus. Lignende data ble også innhentet for følgende stammer som ikke skiller seg fra villtype verdier på noen av de 8 tidspunkter testet:
Il10
– /- (IL10 KO), 5 kull, 3-21 mus /punkt;
Tnf
– /- (TNF KO), 5 kull, 7-13 mus /punkt; T-het /I, 14 kull, 2-6 mus /punkt. De SEM for WT mus varierte 0,2 til 0,6 g og dermed blir skjult av markørene valgt. * Angir en signifikant forskjell mellom WT og T /I-mus; p-verdiene varierte 0,0001 til 0,03. Lignende tendenser ble sett i hunnmus (ikke vist)
TNF-mangel predisponerer for utvikling av Spontan kolitt
WT og
Tnf
-. /- mus plassert i det samme dyr anlegget som T-het /i og T /i mus viste ingen tegn på spontan kolitt (tabell 1). Selv om noen
Il10
– /- kontroll mus undersøkt på 8-12 uker gammel hadde histologiske score i samsvar med mild kolitt, gjorde den gjennomsnittlige histologiske score i denne kohorten ikke avviker vesentlig fra det som ble observert i WT mus (tabell 1). Disse resultatene er i samsvar med våre tidligere rapporter som
Il10
– /- mus på C57BL /6 bakgrunn er resistente mot utvikling av spontan kolitt når holdt under rene Helicobacter frie forhold [8], [ ,,,0],9]. Men vi fant ut at T /I mus spontant utviklet kolitt under disse samme rene forhold (Figur 2A). Forekomsten og alvorlighetsgraden av spontan kolitt i T /I mus økte med alderen. Minimal eller ingen tykktarmsbetennelse var til stede på 3 uker gammel, men kolitt var tydelig i noen mus med 5 ukers alder. Overall, kolitt ble scoret som moderat til alvorlig i 81% av T /I mus undersøkt mellom 3 og 35 uker (n = 63). Videre alle T /I mus scoret uten (13%) eller mild kolitt (6%) var mindre enn 20 uker gammel (figur 2A, tabell 1).
Kolon histologisk poengsum er vist som en funksjon av alder til T /i (panel A) og T-het /i (panel B) mus. Hvert punkt representerer en enkelt mus studert. Stiplede linjer dele mus i grupper med ingen kolitt (histologisk stillingen ≤12), mild kolitt (histologiske score mellom 13 og 24), og moderat til alvorlig kolitt (histologisk stillingen ≥25). Prosentandelen av mus i hver av disse alvorlighetskategorier vises på høyre side av hver figur. Betydelig færre T-het /I mus hadde moderat til alvorlig kolitt sammenlignet med T /I mus. (P = 0,0004; relativ risiko 0,39, 95% konfidensintervall 0,22 til 0,68)
Noen mus som var heterozygote for TNF-mangel (T-het /i mus) også utviklet kolitt snart etter avvenning, men var betydelig mindre sannsynlig å gjøre det i forhold til T /i mus (relativ risiko 0,39, 95% konfidensintervall 0,22 til 0,68; p = 0,0004) (figur 2B). Overall, kolitt ble scoret som moderat til alvorlig i bare 51% av T-het /I mus studert (n = 78). I markert kontrast til T /I mus hvor 100% av musene 30 uker gamle hadde moderat til alvorlig kolitt (n = 17), bare 38% av T-het /I mus undersøkt ved 30 uker gamle (n = 13) hadde moderat til alvorlig kolitt (figur 2B). Selv om gjennomsnitts histologiske score for T-het /I mus var lavere enn T /I mus for aldersspredningen av 8-12 uker og 26 + wks (tabell 1), denne forskjellen skyldes i hovedsak redusert% av T-het /I mus med kolitt undersøkt ved disse tider snarere enn noen genotype relatert forskjell i kolitt alvorlighetsgrad
per se
(figur 2).
De histologiske score for T-het /i og T /i mus beskrevet ovenfor inkludert mus som kreves for eutanasi kolitt-relaterte humane endepunkter, i tillegg til mus som ble prospektivt avlives for vev høsting ved forhåndsbestemte tidspunkter. Kaplan-Meier analyse viste at T /I mus var signifikant større sannsynlighet for å dø eller å kreve avliving av humane grunner enn T-het /I mus (hazard ratio = 2,28; 95% konfidensintervall: 1,35 til 3,85; p = 0,0032; log rank test) (figur 3). Tatt sammen med dataene på kolitt alvorlighetsgrad (f.eks histologiske score), disse dataene viser tydelig at TNF ikke er nødvendig for utvikling av klinisk signifikant alvorlig kolitt i
Il10
– /- mus. Det motsatte, manglende evne til å produsere tilstrekkelig TNF er en sterk risikofaktor for spontan utvikling av alvorlig og potensielt dødelig IBD i en innstilling av IL-10 mangel.
Sannsynligheten for å overleve som en funksjon av tiden vises for T-het /i vs. T /i mus. Sensurerte data for mus avlives før nå humane endepunkter er markert med en liten vertikal linje. Antall mus i fare er anordnet under grafen. T /I mus var signifikant større sannsynlighet for å dø eller å kreve avliving av humane grunner enn T-het /I mus (p = 0,0032; log rank test).
Response av T /I Mus til tarm~~POS=TRUNC Barrier Forstyrrelse Via NSAID eksponering
NSAIDs som piroksikam forbedre apoptose av colonic epitel, som fører til mangler ved slimhinnebarriere som gjør at bakterier i tarmlumen å ta kontakt og potensielt aktiverer immunceller som ligger i lamina propria [12 ]. For å bestemme hvordan defekter i TNF-produksjon påvirkes responser på slimhinnebarrieren avbrudd, T-het /I og T /I mus ble eksponert for 200 ppm av NSAID piroxicam i deres diett i 7 dager; piroksikam ble avviklet og ble observert mus i ytterligere 16 dager før avliving for vurdering av kolitt alvorlighetsgrad. Selv om noen T-het /I mus dukket motstandsdyktig mot å utvikle kolitt spontant (figur 2B), piroksikam utsatte T-het /I mus jevnt utviklet kolitt (gjennomsnittlig histologisk poengsum = 38 ± 3; n = 14). 86% av T-het /I mus overlevde til den planlagte studieslutt 16 dager etter seponering av piroksikam. Alvorlighetsgraden og histologisk mønster av tykktarmsbetennelse observert i piroksikam utsatte T-het /I mus var lik den som ble observert i T-het /I mus som utviklet kolitt spontant og ikke avviker fra det som ble observert i T /I mus på samme måte utsatt til piroxicam (bety histologisk poengsum = 45 ± 3; n = 5; p = 0,11). Selv om graden av spontan kolitt hos disse T /I mus kunne ikke bli vurdert før piroksikam eksponering, deres kolitt alvorlighetsgrad etter piroksikam var lik det som ble observert i T /I mus som utviklet spontan kolitt i fravær av piroxicam eksponering ( sammenligne med tabell 1). Men bare 17% (1 av 6) av piroksikam eksponert T /I mus overlevde inntil den planlagte studieslutt 16 dager etter seponering av piroksikam (p = 0,007; Fishers eksakte test).
Histologi av kolitt i T /i mus ligner det man ser i human UC
terminalen tykktarm /endetarm ble betent i 100% av T /i mus (n = 40) ble undersøkt histologisk ved ≥15 uker gammel. Betennelse typisk var sammenhengende, som begynner ved endetarmen og ofte kommet proksimalt på en lineær måte for å involvere de fleste eller alle av tykktarmen. Men i sjeldne tilfeller, T /I mus hadde betennelse begrenset til terminalen tykktarm /endetarm (n = 1, 5 uker) eller til den distale colon pluss rektum (n = 2, 5 uker). Lamina propria av endetarmen og mer proksimale betent vev av T /I mus var fullpakket med betennelsesceller, inkludert et stort antall nøytrofile. Crypt byller og sår var vanlig, men betennelse generelt ikke utvide forbi muskularis slimhinner og inn i submucosa (Figur 4A). Mønsteret og alvorlighetsgraden av betennelse som ble observert i T-het /I mus med spontan (ikke vist) eller piroksikam-utløst kolitt (figur 4B) var lik den som ble observert i T /I mus (Figur 4A). I motsetning til dette, når den utløses på mus som mangler IL-10 alene, tykktarmsbetennelse var karakteristisk transmuralt (figur 4C), med regioner av inflammasjon vidt adskilt av ikke-betente områder ( «skip lesjoner»). En sammenligning av plasseringen og omfanget av betennelse i
Il10
– /- kontra T /I mus er presentert i Figur 5. kolitt i
Il10
– /- musene var vanligvis mest omfattende i den proksimale kolon, etterfulgt av coecum og rektum; median område som er involvert i hvert segment var ≤30%. I motsetning til mange T /I mus som hadde høyest mulig grad stillingen, med inflammatoriske endringer er tilstede i 60% av arealet undersøkt i hvert segment tykktarm. T /I mus dermed hatt en betydelig større grad av sykdom i 4 av de 5 colonic regioner undersøkt i forhold til
Il10
– /- mus (figur 5). Basert på disse funksjoner, histologi av kolitt i TNF-mangel T /I mus (og TNF-haplogruppene-utilstrekkelig T-het /I mus) lignet det som er vanligvis sett i menneskelig UC, mens kolitt i mus enkeltvis mangelfull i IL- 10 mer lignet den som er sett i menneskelig CD.
A. Spontan kolitt hos T /I-mus (tarmen vist) er karakterisert ved epitelial hyperplasi og infiltrering av lamina propria med inflammatoriske celler, inkludert et stort antall neutrofiler. Crypt byller er vanlig (pil). Betennelse innebærer vanligvis slimhinnene eneste, med liten eller ingen inflammasjon er tilstede i submukosa (Sub M). B. Piroxicam-utløste kolitt (vist) og spontan kolitt (ikke vist) i T-het /I mus har en lignende histologisk apprearance til kolitt i T /I hannmus (rektum vist; pil indikerer krypt byll). C. I motsetning til dette, kolitt (tarmen vist) i
Il10
– /- mus er vanligvis transmuralt som angitt ved pilspisser, med betennelse tilstede i submucosa og /eller muscularis propria (MP). D, E. Colon kreft som utvikler seg i T /I mus (og T-het /I mus, ikke vist) er vanligvis mucinkjertler adenokarsinomer som kan vise omfattende lokal invasjon. Svulsten vist i D er fra proksimale colon; svulsten i E er fra endetarmen. M indikerer mucin innsjøer. Blekk på svulst (pilspisser) indikerer invasjonen helt gjennom tarmveggen (pilene i E punkt til serøse overflaten). F. T /jeg (og T-het /I, ikke vist) mus med kolitt ofte utstilt plateepitel metaplasi i endetarmen, som kan gi opphav til karsinomer med både kjertel og sqamous funksjoner (piler). G. Høyere forstørrelse visning av mucinous adenokarsinom i et T /I mus. H, I. T /I mus som fikk placebo mat spontant utviklet alvorlig kolitt etter 8 uker gammel (I), mens T /I mus som fikk matchet mat som inneholder antibiotika viste ingen tegn på betennelse på dette tidspunkt (H). Pil indikerer en krypt abcess, vist ved høyere forstørrelse i J. Scale bar = 100 mikrometer i A – C, F – J og 1 mm i D og E.
% av colonic området som viste betennelsesforandringer i hvert segment av tykktarmen (en vurdering nødvendig for beregning av histologiske score [12]) er vist for en kohort av
Il10
– /- mus med kolitt utløst av eksponering for piroksikam (n = 14) og en alders matchet kohort av 11-12 wk T /i mus med spontan kolitt (n = 14). Den stiplede linjen viser median område som er involvert i hver kolon segment. De p-verdiene som vises representerer sammenligning av sykdommens utbredelse (som involverer 0-60% vs. 60% av segmentet området). I de 2 genotyper ved hjelp av Fishers eksakte test
Betennelse-forbundet Kolon neoplasi i T /i og T-het /i Mus
Colon betennelse har vist seg å disponere til utviklingen av betennelse-assosiert neoplasi hos både mennesker og i musemodeller for IBD, inkludert
Il10
– /- mus [8] – [10], [22] – [27]. Vi fant det samme til å være sant i T /I og T-het /I mus med kolitt. 93% av T /I-mus (n = 40) ble undersøkt ved 15 uker alder hadde moderat til alvorlig kolitt. Neoplastiske lesjoner ble observert i kolon av 63% denne kohorten, med et gjennomsnitt på 2 neoplastiske lesjoner /mus (range 0-4). De fleste av disse lesjonene var invasive mucinkjertler adenokarsinomer preget av relativt tørt utseende søyle epitelceller og omfattende produksjon av mucin forming «mucin innsjøer» (figur 4D, E, G). Progresjon til lokalt fremskreden sykdom hvor tumor invaderte gjennom veggen av tykktarmen (figur 4D-G) var vanlig i mus som er eldre enn 25 uker, men ble ikke observert noen lymfeknute eller andre metastaser. Omfattende skvamøs metaplasi var ofte til stede i endetarmen av disse mus og noen karsinomer med en squamous komponent ble observert, særlig i endetarmen (figur 4F). Kun 65% av T-het /I mus undersøkt ved ≥15 uker gammel hadde moderat til alvorlig kolitt (n = 52). Forekomsten av neoplasi i dette kullet var 54%, med et gjennomsnitt på 2 neoplastiske lesjoner /mus (range 0-6; n = 36). Alle mus med neoplasi hadde histologiske score ≥40. Dermed ligner på mennesker med UC [22] -. [24], T /I og T-het /I mus har en økt risiko for å utvikle tykktarmskreft i innstillingen av betennelse
Antibiotika forebygge utvikling av Spontan kolitt hos T /i Mus
IBD er for tiden antatt å resultere fra en patogen immunrespons mot kolitt-induserende (colitogenic) mikrobiota i en mottakelig vert. For å teste hypotesen om at kolitt i T /I-muse resultater fra patogene immunresponser til økninger i colitogenic bakterier som naturlig oppstår på tidspunktet for avvenning [28], T /I mus ble avvent for å konsumere dietter med og uten 4 medikament cocktail av amoxicillin, klaritromycin, metronidazol og omeprazol inntil 8 uker gammel. Selv om denne 4 medikament cocktail ble opprinnelig utviklet for utrydding av Helicobacter-infeksjoner i mus, har vi vist at det også undertrykker eller utrydder colitogenic bakterier, og dermed er også i stand til å forhindre utvikling av kolitt i helicobacter-fri
Il10
– /- mus som er utsatt for piroksikam [8]. T /I mus som fikk mat uten antibiotika jevnt utstilt alvorlig kolitt når undersøkt ved 8 uker alder (gjennomsnittlig histologisk poengsum ± SEM = 49 ± 4; n = 8; Figur 4I, J). I motsetning til dette, T /I musene som fikk dette 4 medikament antibiotikum cocktail i maten fra tidspunktet for avvenning hadde ingen tegn på tykktarmsbetennelse ved 8 uker gamle (gjennomsnittlig histologisk stillingen ± SEM = 2 ± 1; n = 5; Figur 4H ).
systemiske responser av T /i mus til Bakteriell Challenge
De ovennevnte studiene definitivt viser at spontan utvikling av kolitt i T /i mus er drevet av colitogenic bakterier. Cytokinet TNF er typisk en stor del av antibakterielle responser, og har blitt antatt å være kritisk for IBD patogenese, siden behandling med visse anti-TNF stoffer har vært meget effektive ved behandling av IBD hos mennesker. Men våre studier viser at evnen til å produsere TNF ikke er nødvendig for utvikling av IBD i
Il10
– /- mus. For å begynne å forstå hvordan TNF og IL-10 kan påvirke svarene til mikrobiell eksponering, bestemt vi hvordan mus med varierende kombinasjoner av villtype og null-alleler for
Tnf Hotell og
Il10
svarte systemisk til <
